Home   |   Structure   |   Research   |   Resources   |   Members   |   Training   |   Activities   |   Contact

EN | PT

BrBRCEEx0100-40421998000200008

BrBRCEEx0100-40421998000200008

National varietyBr
Country of publicationBR
SchoolEx-Tech-Multi Sciences
Great areaExact-Earth Sciences
ISSN0100-4042
Year1998
Issue0002
Article number00008

Javascript seems to be turned off, or there was a communication error. Turn on Javascript for more display options.

Estudo de métodos de aumento de resolução de espectros de FTIR para análise de estruturas secundárias de proteínas ii. O aumento de resolução não introduz qualquer fenômeno físico novo.

iii. Os estreitamentos das bandas são obtidos com distorções das bandas originais e também levam à degradação da razão sinal/ruído.

iv. A quantificação baseada em aumento de resolução é dependente da relação das áreas e/ou intensidades relativas, e não dos valores absolutos.

Derivação do Sinal A derivação dos sinais de FTIR vêm sendo usada desde 1983 em estudos de ESP3.

Dong et al8,16,17,, fizeram uma descrição detalhada do uso da segunda derivada como método quantitativo na determinação das ESP, e tem sido criticado por alguns autores4,7. Somente as derivadas pares (principalmente a segunda) tem sido usadas em estudos de ESP4.

Como o sinal de FTIR é digital, com resolução finita e bem mais complexo, a sua derivada é calculada numericamente e o algoritmo mais usado é o de Savitzky- Golay11,15,18.

Na figura_1, tem-se um sinal simulado, onde a aplicação tanto da segunda como da quarta derivadas reduzem a largura do sinal. O inconveniente deste processamento é a presença de lobos laterais que distorcem a base do sinal.

Como o uso de quarta derivada, que causa maior redução na largura de linha, é muito restrito por necessitar de razão sinal/ruído muito alta15,24, a segunda derivada será analisada com mais detalhes.

A meia largura da segunda derivada, g'', está relacionada à meia largura do sinal original por15: (2) Para um sinal composto de dois picos de mesma intensidade e 10 cm-1 de meia largura na meia altura, a distinção entre os dois picos pelas derivadas começa a ser observada a partir de 8 cm-1 e 6 cm-1 de separação, para a segunda e quarta derivadas respectivamente. Para sinais com diferenças de intensidade como o da figura_2, a distinção pela segunda e quarta derivadas começa em 10 e 8 cm-1 respectivamente. Ou seja, a segunda derivada distingue sinais com separação igual ou superior à sua meia largura na meia altura. Nesta figura pode-se notar a grande distorção do sinal de baixa intensidade. Além disso não como definir com precisão uma linha de base tanto para o cálculo das intensidades e áreas. Esse problema não tem sido levado em consideração nos trabalhos publicados por Dong et al8,16,17.

Um problema adicional é encontrado com o uso de derivadas quando as larguras de linhas dos sinais não são iguais. A intensidade da segunda derivada de um sinal lorentziano15 é dada por: <formula/> (3) onde a intensidade da derivada do sinal é inversamente proporcional ao quadrado da meia largura original. Um exemplo desse efeito pode ser visto na figura_3, onde foram simulados espectros com mesma intensidade e largura de linha 11 e 10 cm-1. A separação foi de 40 cm-1 para melhor visualização do problema. Pode-se notar que tanto a intensidade como a área do sinal mais largo, sofreram uma redução de 80% se comparado ao sinal mais estreito. A redução da relação da área será tanto maior quanto maior for a diferença de largura de linha entre os sinais.

Com isso fica evidente que as derivadas podem ser usadas em análises quantitativas quando as larguras de linha forem iguais e quando os sinais estiverem separados em números de onda maiores que suas meias larguras à meia altura e com pequenas diferenças de intensidade. Como em espectros reais de proteínas isso não é garantido, as derivadas devem ser usadas em análises qualitativas ou semiquantitativas7.

Deconvolução de Fourier A deconvolução de Fourier é outra técnica usada para reduzir a largura das bandas dos espectros. Esse procedimento é muito usado em espectroscopia de RMN tanto para aumento de resolução ou para melhoria da razão sinal/ruído3-5,9,19.

A redução da largura do sinal é obtida com a convolução do espectro com uma função filtro do tipo passa alta19. Por facilitar o processamento, essa convolução é realizada no domínio de Fourier, onde é apenas uma multiplicação.

Para isso obtém-se o interferograma a partir do espectro da proteína, com a transformada inversa de Fourier. Após a multiplicação do interferograma com a função filtro faz-se novamente a transformada de Fourier para obter o espectro com as linhas mais estreitas19.

As funções filtro do tipo passa alta são exponenciais crescentes do tipo exp (xg), onde x é o retardamento em cm e g a meia largura a meia altura em cm-1. A sua utilização reduz o decaimento do interferograma reduzindo a largura de linha do espectro. Ao aumentar a resolução um conseqüente aumento de ruído, pois no final do interferograma uma grande redução da razão sinal/ruído.

Essa função também aumenta o problema de truncagem causando o aparecimento de batimentos laterais no espectro. Ambos os problemas podem ser amenizados com a utilização de funções de apodização do sinal. Uma função (ff) que contempla as duas soluções (4) foi proposta por Kauppinen e colaboradores19: <formula/> (4) onde x é o retardamento em cm; L é o ponto limite da função filtro em cm; g é a largura de linha na meia altura em cm-1.

Esta função representada na figura_4 é largamente usada em estudos de proteínas por FTIR3-7 e apresenta o crescimento exponencial necessário para o aumento de resolução bem como a apodização (1-x/L), fazendo com que o sinal retorne a zero, no ponto onde L=X. Multiplica-se também o interferograma por uma função boxcar, que tem valor 1 de zero a L e zero de L a X, ou seja, é a substituição dos valores dos pontos de L a x por zero19.

Diferentemente das derivadas, o sinal decorrente da deconvolução de Fourier (figura_5) não é muito distorcido e a redução da largura de linha pela deconvolução de Fourier é determinada pela escolha dos valores de g e/ou L.

Isso pode ser um problema pois pode levar à sobredeconvolução do sinal (figura 6), onde aparecem os lobos laterais19, isto devido a utilização de um valor de g grande comparado à largura de linha do sinal (g=10).

Ao deconvoluir um espectro composto de sinais de mesma largura de linha, as intensidades e áreas relativas são mantidas (igual às derivadas). No entanto, quando as larguras de linha são diferentes, cada sinal tem sua intensidade reduzida por um fator inversamente proporcional à sua largura de linha, ou seja, os sinais mais largos ficam menos intensos, como nas derivadas10. O fator de redução depende dos valores de L e g usados. Por isso o uso das intensidades tem sido pouco aplicado na análise das ESP4.

Na figura_7, pode-se observar o efeito da deconvolução de dois sinais de mesma intensidade e largura de linha 11 e 10 cm-1, separados por 60 cm-1 (para facilitar a visualização).

As linhas mais estreitas sofrem maior deconvolução (ficam proporcionalmente mais estreitas) que as linhas mais largas, porém a razão entre as áreas é mantida, diferentemente das derivadas.

Assim, é possível usar as áreas dos sinais deconvoluídos para as análises das ESP. Para a obtenção das áreas individuais em sinais altamente complexos como o de proteínas é necessário fazer o ajuste do sinal, para se obter as áreas dos sinais individuais.

Ajuste do Sinal ("fitting") O ajuste é um processo de decomposição de um sinal complexo em seus componentes individuais, através da otimização pelo critério de mínimos quadrados, tendo como parâmetros de entrada o número e posição dos picos, forma e largura do sinal e uma linha de base11. O ajuste normalmente produz resultados precisos quando a separação entre as bandas é maior que suas meias larguras22, o que não ocorre nos espectros de proteínas.

Como o método de deconvolução de Fourier reduz a largura de linha, sem distorcer as áreas relativas, o ajuste do sinal deconvoluído começou a ser largamente usado na quantificação das ESP de proteínas a partir do trabalho pioneiro de Susi & Byler11.

O ajuste do sinal deconvoluído tem causado muita polêmica, com autores considerando-o como a melhor solução7,21,24 e outros defendendo o uso do ajuste do sinal original9,25.

Para os estudos de ajuste dos sinais originais e deconvoluídos, usaram-se dois tipos de sinais simulados, de uma banda de amida I composta por combinações das várias absorções de uma proteína rica em a-hélice (figura_8) e outra rica em folhas b (figura_9).

Na figura_8 o espectro foi simulado com sinais de mesma largura de linha e intensidade. A exceção é o sinal em 1656 cm-1, que tem área dez vezes maior do que os outros picos e representa 60% da área total do sinal. Observa-se nessa figura que a segunda derivada identificou 5 sinais, cujas posições foram usadas como parâmetros de entrada para o ajuste. Esse indicou que o sinal em 1656 cm-1 corresponde à 52% da área total e que as áreas dos outros sinais variaram em até 6 vezes entre si.

Esse tipo de resultado indica a dificuldade de usar o ajuste de espectros sobrepostos como o da banda de amida I de proteínas. No caso do sinal simulado para uma estrutura rica em folhas b (figura_9) foram visualizados apenas sete sinais dos onze simulados. As áreas ou intensidades originais com intensidades iguais foram distorcidas em até 50%.

O mesmo tipo de problema foi encontrado ao realizarem-se os ajustes dos mesmos sinais deconvoluídos com a função de Kauppinen e colaboradores. Para isso os espectros simulados foram processados pelo programa de deconvolução de Fourier.

Na figura_10 tem-se o ajuste do sinal simulado (igual ao da figura_8) e deconvoluído, onde a derivada identifica somente 6 dos 8 picos existentes. Essa melhor resolução reflete o efeito da deconvolução de Fourier.

Na figura_11 tem-se o ajuste do sinal simulado (igual ao da figura_9) e deconvoluído. Neste caso também foi possível identificar com a segunda derivada um número maior de componentes (igual ao da figura_8) do que no ajuste do sinal original. Isso porém não foi suficiente para se obter a proporcionalidade entre as áreas dos picos.

Uma opção para melhorar o ajuste do sinal seria a utilização da quarta derivada ou aumentar o fator de aumento de resolução da deconvolução, para identificar o número e a posição dos picos. No entanto essa alternativa não tem muita aplicação em espectros reais uma vez que necessita de uma razão sinal/ruído da ordem de 10000/124 e/ou pode levar à sobredeconvolução do sinal (figura_5).

4. CONCLUSÕES A partir desses resultados pode-se concluir que não confiabilidade no uso dos métodos de aumento de resolução na quantificação das ESP, uma vez que os sinais reais de proteínas são bem mais complexos do que os sinais simulados, devido às diferentes larguras de linha, não linearidade dos sinais, ruído e interferência do meio como sinais de solventes e vapor de água etc.

Esses métodos também estão sujeitos a interferências externas, uma vez que parâmetros como número e posição dos picos, fator de aumento de resolução, entre outros, podem ser escolhidos de modo a que conduzam a um resultado direcionado, ou seja, os métodos de aumento de resolução abordados não são confiáveis e devem ser usados para fins de análises qualitativas ou semi quantitativas.


Download text