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A química dos liquens

INTRODUÇÃO Define-se liquens como organismos simbióticos compostos por um fungo (micobionte) e uma ou mais algas (fotobionte)1.

Calcula-se que existam 13.500 espécies (aproximadamente 600 gêneros) de fungos liquenizados, o que corresponde a 20% dos fungos conhecidos2,3. A grande maioria (98%) dos fungos liquênicos são Ascomicetos e 46% desses são liquenizados, de modo que a liquenização é uma grande regra e não uma exceção nesse grupo de fungos. Os Deuteromicetos ou fungos imperfeitos são representados por apenas uma dezena de gêneros, ou pouco mais. Os Basidiomicetos formam diversas associações semelhantes a liquens em regiões tropicais e são encontrados com algas azuis. Algumas espécies do gênero Dictyonema ocorrem como Basidiomiceto liquenizado2.

As algas mais comuns encontradas na associação são as clorofíceas e destas a mais freqüente é uma espécie de Trebouxia, em aproximadamente 70% dos gêneros de liquens. Além dessa, ocorrem também espécies de Coccomyxae Trentepohlia.Entre as algas verde-azuladas (cianofíceas), as mais comuns são a Nostoc e Scytonema 4.

Nos liquens, as algas constituem, com raras exceções, uma parte muito pequena do talo variando entre 5-10% da massa ou volume e são completamente envolvidas pelos tecidos do fungo nos talos. Portanto, toda a organização do talo liquênico se deve ao fungo. As algas podem, ou não, estar restritas a uma camada especial do talo e responsabilizam-se totalmente pela fotossíntese3.

O micobionte, geralmente dominante, é um organismo heterotrófico que obtém sua fonte de carbono do fotobionte. A liquenização pode ser considerada uma estratégia pela qual o fungo pode satisfazer sua necessidade de carboidrato para respiração e crescimento2. Sabe-se hoje, que polióis em liquens com algas verdes e glucose em liquens com cianofíceas são passados do fotobionte para o micobionte3. No estado liquenizado a parede celular do fotobionte se torna mais permeável à perda de carboidratos, resultando em benefício para o micobionte5.

Além disso, em cianoliquens o micobionte ganha uma fonte de nitrogênio6.

Com relação à alga, as vantagens não estão associadas a ga-nhos metabólicos em si, mas a benefícios, de alguma maneira, relativos à hidratação, evitando dessecação. Além disso, as hifas opacas protegem a alga de alta intensidade luminosa, e a liquenização é um mecanismo que permite ao fotobionte se desenvolver em ambientes de alta luminosidade7.

Como resultado da simbiose, tanto fotobionte e micobionte têm se espalhado em muitos habitats, das regiões tropicais às polares, onde separadamente, na condição de organismos de vida livre, não existiriam, ou seriam raros. Por exemplo, as algas de vida livre e cianofíceas, em sua maioria, ocorrem em ambientes aquáticos ou bastante úmidos, mas como parte de liquens ocorrem abundantemente em habitats que são freqüentemente secos8,9.

Os liquens são encontrados desde o nível do mar até as montanhas mais altas.

Porém, são relativamente raros em altitudes acima de 5.000 m e em matas excessivamente escuras. Podem, também, ser encontrados em desertos onde a temperatura é bastante variável, e em regiões polares, com temperaturas extremamente baixas. Seu limite de tolerância às oscilações climáticas é superior a qualquer outro vegetal9. Desenvolvem-se sobre os mais variados substratos, sendo que muitos não apresentam especificidade: existem espécies que somente se desenvolvem sobre córtex de árvores, outras sobre folhas e outras sobre rochas alcalinas ou ácidas, necessitando ou não das características físicas como rugosidade, porosidade, dureza, exposição à luz; há outras, ainda, mais exigentes quanto ao pH do substrato, presença de partículas no ar, umidade, ventos e temperatura. Portanto, a presença de liquens nos mais variados habitats e micro-habitats depende da disponibilidade de fatores físicos e climáticos que proporcionem as condições necessárias para seu desenvolvimento. Dessa forma, cada região pode apresentar uma comunidade liquênica com componentes específicos próprios em resposta às condições ambientais10.

QUÍMICA DOS LIQUENS As substâncias químicas produzidas pelos liquens são agrupadas, de acordo com a localização no talo, em produtos intracelulares e extracelulares. Sendo o talo liquênico uma estrutura composta, alguns produtos são sintetizados pelo fungo, outros pela alga11. Os produtos intracelulares (carboidratos, carotenóides e vitaminas, aminoácidos e proteínas) estão ligados na parede celular e ao protoplasto. São freqüentemente solúveis em água e podem ser extraídos com água quente. Esses compostos ocorrem não somente em liquens, mas em fungos e algas de vida livre e em plantas superiores11.

Metabólitos primários Carboidratos Polióis tais como glicerol, eritritol, ribitol, arabinitol, D-volemitol, D- sifulitol e açúcares como glucose, sacarose, trealose e outros, são metabólitos comuns em liquens. São produtos resultantes da atividade fotossintética do ficobionte e ocorrem também em plantas superiores. Entretanto, compostos como 3-O-b-D-galactofuranosil-D-manitol (peltigerosídeo) e 2-O-b-D-galactofuranosil- D-ribitol (umbilicina) são exemplos de compostos restritos a liquens12,13.

Glucanas (liquenanas e isoliquenanas) e heteropolissacarídeos contendo manose estão presentes nos liquens em quantidades relativamente altas. Variações em estruturas químicas de a e b glucanas (isoliquenanas e liquenanas, respectivamente) são devidas às diferentes proporções de ligações 1®3 e 1®4 contidas em cada uma. Um outro grupo, as pustulanas, contêm unidades de b-D- glucopiranosil com ligações 1®6, e, algumas vezes, encontram-se parcialmente acetiladas14.

Heteropolissacarídeos de liquens, contêm galactose, manose e em alguns casos, ácido galacturônico. Na maior parte, são constituídos de uma cadeia principal 1®6 a-D-Manp, substituída com várias cadeias laterais, incluindo unidades de a- e b-D-Galp, b-D-Galf,ae b-D-Glcp e a e b-D-Manp.Algumas das estruturas de heteropolissacarídeos de liquens, são semelhantes àquelas isoladas de leveduras14,15.

Aminoácidos, derivados e proteínas Aminoácidos livres encontrados nos liquens são similares aos observados em outros vegetais. Dos aminoácidos que ocorrem em proteínas, alanina e ácido glutâmico são os predominantes em liquens. Além desses, podem ocorrer diferentes aminoácidos ou seus derivados, como sarcosina, taurina, citrulina, ácido b-aminobutírico16-18.

A natureza das proteínas de liquens não está ainda bem estabelecida e poucos são os relatos sobre o isolamento dessas substâncias. Vicente, em 198819, publicou uma revisão abordando a enzimologia de liquens, envolvendo o metabolismo de carboidratos, lipídeos, fenóis e de nitrogênio nestes organismos. Outros relatam o isolamento de urease20, celulase21,22, manitol-1- fosfato-desidrogenase23, bromoperoxidase24. Inibidores de serinoproteinases (tripsina e calicreína tissular) e cisteínoproteinases foram isolados de Collema leptosporum25,26.

Glicolipídeos Recentemente, Machado et al.27relataram o isolamento e identificação de três glicolipídeos extraídos de Ramalina celastri. O principal componente foi O-a-D- galactopiranosil-(1®6)-O-b-D-galactopiranosil-(1 ®1)-D-glicerol esterificado com ácidos graxos de cadeia longa, sendo alguns desses insaturados.

Metabólitos secundários Os produtos extracelulares, freqüentemente chamados metabólitos secundários, são encontrados na medula ou no córtex, raramente em ambas as camadas.

Substâncias que apresentam cor, como a maior parte das antraquinonas, derivados do ácido pulvínico e ácido úsnico [1], outras incolores como atranorina [2] e liquexantona [3] são exemplos típicos de substâncias presentes no córtex.

Entretanto, pode ocorrer que as substâncias químicas estejam localizadas também em outras partes do líquen. Nos apotécios de Haematoma ventosum está presente a hemaventosina [4], que é um pigmento vermelho escuro28, 29,em Letraria columbina os apotécios contêm ácido norstítico [5] e no talo estão presentes atranorina [2] e ácido vulpínico30 [6]. O ácido taminólico [7] ocorre nos apotécios e o ácido perlatólico [8] no talo de Icmadophila ericetorum31.

Em geral, em um espécime pode ocorrer de um a três ou mais compostos resultantes do metabolismo secundário. Entretanto, há casos, como Pseudocyphellaria impressa da Nova Zelândia que apresenta 41 diferentes depsídeos, depsidonas, derivados do ácido pulvínico e 17 triterpenos32.

Atualmente, são conhecidos aproximadamente 630 compostos provenientes do metabolismo secundário de liquens. São ácidos alifáticos, meta- e para- depsídeos, depsidonas, ésteres benzílicos, dibenzofuranos, xantonas, antraquinonas, ácidos úsnicos, terpenos e derivados do ácido pulvínico. Ainda que esses compostos sejam também produzidos por fungos de vida livre e por plantas superiores (50-60), a maior parte é considerada exclusiva de liquens33.

Muitas espécies em que o fotobionte é uma cianobactéria não produzem derivados fenólicos34.

A concentração de metabólitos secundários pode variar de 0,1 a 10% em relação ao peso seco do talo liquênico, embora em alguns casos a concentração possa ser mais alta11,34,35. O estudo sistemático das substâncias químicas resultantes do metabolismo secundário de liquens teve início com os trabalhos de Bebert em 1831, Alms em 1832 e Knopp em 1844 que isolaram os ácidos vulpínico [6], picroliquênico [9] e úsnico [1], respectivamente, de algumas espécies liquênicas36.

Gmelin, em 1858, publicou a primeira revisão sobre substâncias isoladas de liquens36. Entretanto, o marco inicial da Liquenologia foi estabelecido com os trabalhos de Zopf e de Hesse. Zopf (Friedlich Wilhelm Zopf) era botânico e publicou, em 1907, uma das mais importantes obras na área de Liquenologia37. O livro "Die Flechtenstoffe in chemischer, botanischer, pharmakologischer und technischer Beziehung " é uma compilação de trabalhos que foram por ele publicados e descreve fórmulas empíricas, propriedades e ocorrência de 150 compostos. O químico Hesse, no período de 1861 a 1905, publicou inúmeros trabalhos sobre substâncias isoladas de liquens. O mais importante deles, "Flechtenstoffe", foi editado em 191238.

O ácido lecanórico [10] foi o primeiro depsídeo de líquen sintetizado em laboratório por Emil Fischer em 191339.

Durante o período de 1930, Asahina, químico japonês, determinou fórmulas moleculares de várias substâncias liquênicas mais comuns e estabeleceu a base para pesquisas posteriores desses compostos40a - 40r.

Em 1954, Asahina e Shibata, no Japão, publicaram um outro clássico da Liquenologia, o livro "Chemistry of Lichen Substances". Essa obra é uma compilação de seus trabalhos e contém as estruturas elucidadas de numerosos compostos, suas sínteses, os métodos de isolamento e purificação e algumas propriedades físicas41. Nesse trabalho incluíram também a identificação de substâncias liquênicas por microcristalização e descreveram a ação antibiótica de vários compostos.

Asahina e Shibata dividiram as substâncias liquênicas em alifáticas e aromáticas. Na série alifática incluíram os ácidos graxos, polióis e triterpenos e na série aromática os derivados do ácido tetrônico (ácido pulvínico), depsídeos, depsidonas, quinonas, dibenzofuranos e derivados da dicetopiperazina. O sistema de classificação das substâncias liquênicas proposto por Asahina e Shibata foi baseado em conhecimentos estruturais e vias biossintéticas que lhes dão origem41. O sistema de classificação mais recente é aquele proposto por Culberson & Elix42, em que as substâncias são ordenadas de acordo com sua provável origem biossintética.

Biossíntese A maior parte dos metabólitos secundários de liquens são compostos oriundos da via do acetil-polimalonil. Essa via conduz à formação de compostos alifáticos como os ácidos graxos de cadeia longa e as substâncias aromáticas do tipo ácidos fenólicos.

A acetilSCoA pode sofrer ativação de átomos de hidrogênio a do grupo metila por ação do sítio de caráter básico presente na enzima que toma parte no processo sintético. A ativação desenvolve caráter básico na molécula pela remoção de um próton e o carbono a pode então, por um ataque nucleofílico ao carbono carbonílico eletrofílico de outra molécula de acetilSCoA, formar o derivado acetoacetilSCoA por condensação tipo Claisen43.

A formação do b ceto-éster é o ponto de partida para a síntese de terpenos pela via do ácido mevalônico. O b ceto-éster obtido pode também, por redução e repetidas condensações, conduzir à formação de ácidos graxos, ou, por condensações sem redução, a policetídeos, os quais podem ciclizar, dando origem a compostos aromáticos43, 44.

Via do acetil-polimalonil Ácidos graxos Os ácidos graxos que ocorrem em liquens apresentam certa semelhança com aqueles que ocorrem em fungos não liquenizados, porém não são idênticos. Ácidos agarícico [11] e 2-decilcítrico [12] isolados de fungos são estruturalmente relacionados ao ácido caperático [13], um metabólito comum em liquens45, 46.

Além do ácido caperático [13], podem ocorrer em liquens outros ácidos, como rocélico [14], rangifórmico [15] e nor-rangifórmico [16]. Ácidos acaranóico [17] e acarenóico [18] são d-lactonas e os ácidos liquesterínico [19], nefrosterânico [20], nefrosterínico [21] e protoliquesterínico [22], são exemplos de ácidos g-lactônicos de cadeia longa.

Ácidos hidroxilados como 9, 10, 12, 13-tetraidroxieneicosanóico e 9, 10, 12, 13-tetraidroxieicosanóico são freqüentes em liquens. Até 1973, ácidos graxos de cadeia longa, como oleico e linoleico não tinham sido citados como componentes de liquens35. Mais recentemente, Dembitsky et al. analisaram cinco espécies de liquens da subclasse Gymnocarpeae47, três espécies do gênero Parmelia48, três espécies da ordem Lecanorales49 e identificaram, através da análise por CG-EM, ácidos de cadeia longa, como palmítico, esteárico, oleico, linoleico e linolênico, além de outros ácidos de cadeia mais longa que esses e de estruturas variadas. Xantoria parietina apresenta ácidos graxos que variam de 10 a 20 carbonos e, entre esses, os ácidos insaturados palmitoleico, oleico, linoleico, linolênico e 11,14-eicosadienoico50.Ácidos palmítico, esteárico, láurico, linoleico, oleico e araquídico também foram identificados em Collema leptosporum51.

A biossíntese de ácidos graxos de cadeia longa presentes em liquens, procede de maneira semelhante àquela já estabelecida em diversos organismos19, 43, 44 52- 54. Entretanto, são poucas as informações disponíveis sobre a biossíntese das lactonas dos ácidos alifáticos de cadeia longa. A biossíntese do ácido protoliquesterínico [22] foi estudada por Blomer et al.54 que suplementaram talos de Cetraria islandica com glucose e [1-14C]acetato de sódio. Os autores sugeriram que a biossíntese do ácido protoliquesterínico deve envolver um intermediário de 3 C como o piruvato, ou de seus precursores (como o oxalacetato) da via glicolítica, que se condensa com o grupo a-metileno de uma longa cadeia alcanoilSCoA, como o palmitoilSCoA. A desidratação e ciclização oxidativa do produto resultante dessa condensação dá origem ao ácido protoliquesterínico [22].

Compostos aromáticos Depsídeos e Depsidonas Embora muitos dos compostos aromáticos isolados de liquens sejam exclusivos desse grupo vegetal, alguns podem ser encontrados também em fungos não liquenizados ou em plantas superiores.

Os compostos aromáticos mais comumente presentes em liquens são formados pela esterificação de duas ou ocasionalmente três unidades fenólicas, como por exemplo, derivados do ácido orselínico43.

Duas unidades fenólicas derivadas do orcinol, isto é, sem substituintes na posição 3 podem formar compostos denominados depsídeos55. Esses compostos são formados pela esterificação da carboxila da posição 1 da primeira unidade com a hidroxila da posição 4' ou da posição 3' da segunda unidade. Os compostos resultantes são para-depsídeos e meta-depsídeos da série do orcinol, como o ácido lecanórico [10] e o ácido criptoclorofeico [23]. Tridepsídeos são resultantes da esterificação de três unidades fenólicas, como no ácido girofórico[24]55.

Além dos depsídeos derivados do orcinol (ácido orselínico), ocorrem outros derivados do b-orcinol (ácido b-metil-orselínico), como por exemplo atranorina [2], os ácidos difractáico [25], obtusático [26] e baeomicésico [27].

Um outro grupo de compostos estruturalmente relacionados aos depsídeos são as depsidonas. Além de ligação éster presente nos depsídeos, as depsidonas apresentam também um heterocíclo adicional resultante de uma ligação éter, geralmente entre as posições 2 e 5' como no ácido fisódico [28]. No ácido variolárico [29] a ligação éter está entre as posições 2 e 3', sendo este o único caso, até então, conhecido.

Biossíntese de derivados fenólicos O ácido orselínico é a unidade fundamental da biossíntese de depsídeos e depsidonas. O processo biossintético inicia-se, como no caso dos ácidos graxos, com a condensação de 1 mol de acetilSCoA e 1 mol de malonilSCoA. A acetoacetilSCoA, resultante da condensação da acetilSCoA com malonilSCoA, pode condensar com duas outras moléculas de malonilSCoA em etapas sucessivas, formando um policetídeo de 8 carbonos. Este último pode ciclizar através de dois processos distintos: um deles por condensação aldólica produzindo ácido orselínico, e o outro por condensação tipo Claisen, produzindo floroacetofenona52(Fig._1).

A reação biossintética de formação de ácido orselínico é catalisada pela enzima ácido orselínico sintase19. O mecanismo de formação desse ácido envolve reação de desidratação somente na etapa final quando ocorre a ciclização da cadeia para formar o ácido orselínico, diferente do que acontece na biossíntese do ácido 6-metilsalicílico, característico de outras espécies de fungos de vida livre. A reação de obtenção do ácido 6-metilsalicílico é catalisada pela enzima ácido aromático sintase19. A enzima ácido orselínico sintase tem sido caracterizada como um complexo enzimático contendo duas atividades transacetilases, uma proteína transportadora de grupos acil, uma enzima de condensação, uma de ciclização e uma atividade hidrolase. Embora os liquens produzam ácido orselínico em concordância com essa via, o sistema multienzimático não está ainda totalmente elucidado19.

O ácido orselínico é o precursor de depsídeos derivados do orcinol. A formação desses compostos ocorre por esterificação entre unidades derivadas desse ácido.

Várias esterases podem estar envolvidas nesse processo. Entretanto, essas enzimas não foram ainda isoladas56.

Os para-depsídeos da série do orcinol apresentam hidroxilas substituintes nas posições 2 e 4 do primeiro anel e 2' do segundo anel, exceto no ácido planáico [30] em que 2 e 2' se encontram metoxiladas. No ácido confluêntico [31] as metoxilas se encontram nas posições 4 e 2', enquanto que no ácido divaricático [32] a metoxila se encontra na posição 4.

Vários depsídeos derivados do orcinol contém outros grupos substituintes ligados às unidades de ácido orselínico. Esses depsídeos são biossintéticamente derivados do ácido 6-alquil-2,4-diidróxibenzóico ou do ácido 6-alquil-b-ceto- 2,4-diidróxibenzóico. Devido às variações da cadeia alquila nas unidades do ácido orselínico, o número de depsídeos é bastante elevado52.

Cadeias laterais de um ou mais carbonos (-CH3,-CH2CH2CH3,-C5H11,-C7H15) localizam-se nas posições 6 e 6'. Pode ocorrer que a cadeia lateral apresente grupo cetônico na posiçãob, como no ácido confluêntico [31].

Visando determinar se as unidades de 1 Carbono são introduzidas antes ou após a ciclização de policetídeos para formação de derivados do b-orcinol, foram realizados experimentos utilizando talos de Parmotrema tinctorum que produzem ácido lecanórico [10], atranorina [2] e 5-cloroatranorina [2a]57,58.Os talos foram suplementados com [1-14C ]acetato e [1-14C]formiato. Após uma semana de incubação os compostos foram isolados e a medida da atividade específica de cada um deles indicou que [1-14C]acetato é o precursor dos três depsídeos, enquanto que [1-14C]formiato é incorporado somente em atranorina [2b] e em 5- cloroatranorina [2c] participando na formação dos grupos -CHO (C 8) e CH3 (C 8') desses compostos43.

Quando o ácido orselínico marcado nos carbonos 2,4 e 6 com 14C foi suplementado aos talos de P.tinctorum somente o ácido lecanórico [10a] apresentou-se radioativo. A ausência de atranorina [2b] e 5-cloroatranorina [2c] levou à conclusão de que a introdução de unidades de 1 Carbono ocorre antes da ciclização do policetídeo19, 43, 52.

Nos para-depsídeos derivados do b-orcinol, a posição 3 (anel A) apresenta substituinte de uma unidade de carbono, que pode ser -CH3, -CHO, -COOH, enquanto que na posição 3' o substituinte é sempre -CH3. As posições 6 e 6' estão sempre metiladas, e a carboxila da posição 1' está na forma de éster metílico somente na atranorina [2] e na 5-cloroatranorina [2a].

Meta-depsídeos A ligação éster se estabelece entre a posição 1 do anel A e a posição 3' do anel B. As unidades fenólicas da série do orcinol, que intervém na formação de depsídeos, não possuem hidroxila na posição 3'. Em princípio, não se poderia pensar em uma reação de esterificação para a formação dometa-depsídeo.

Químicamente existem 3 possibilidades distintas: a) A ligação éster (-COO- ) pode se estabelecer em posiçãometa do anel B por reagrupamento de um para- depsídeo, que atuaria como precursor; b) O grupo -COOH da primeira unidade fenólica pode transformar-se em carboxilato, o qual poderia formar a ligação entre as unidades por ataque direto sobre o C-3' do anel B; c) A segunda unidade fenólica (anel B) pode ser hidroxilada préviamente como unidade mononuclear no carbono 3' e a formação do meta-depsídeo segue os passos normais de esterificação, como no caso dos para-depsídeos.

Na hipótese a, o reagrupamento consistiria em uma hidroxilação secundária do carbono formador da ligação éster no meta-depsídeo (C3'), quebra da ligação éster do para-depsídeo seguida de um giro de 60o do anel B, de modo que a nova ligação se formaria na posição 3', ficando uma hidroxila regenerada na posição 4'55.

A hipótese b consiste em um ataque direto do grupamento carboxílico da primeira unidade fenólica (anel A) sobre a posição 3' da segunda unidade (anel B).

Químicamente o sistema é possível, dada a alta reatividade da espécie ArCOO-.

Considerando do ponto de vista biológico, devem haver reações enzimáticas que realizariam mais facilmente a formação da ligação55.

A hipótese c é a mais aceita atualmente. Baseia-se na hidroxilação prévia da posição 3 do anel B (para os derivados do orcinol, 5 para os derivados do b- orcinol) e estabelecimento da ligação éster.

Elix et al.59forneceram evidências de que os meta-depsídeos podem se originar por hidroxilação do C 3' de para-depsídeos, seguida de rápido rearranjo à forma termodinâmicamente mais estável. Essas conclusões foram obtidas a partir de estudos realizados com uma mistura de compostos isolados de Lobaria escrobiculata, consistindo de m-escrobiculina [33], ácido úsnico, ácidos estítico, norstítico e constítico. Verificaram por cromatografia em camada delgada que a substância m-escrobiculina sempre estava acompanhada de um composto relacionado de Rf levemente maior. A análise cromatográfica e os dados espectroscópicos do composto isolado indicaram que se tratava de uma mistura em equilíbrio dinâmico de m-escrobiculina com seu isômero p-escrobiculina [34].

Para verificar a consistência dessas observações, os autores procederam a síntese de p-escrobiculina e concluíram que a hidroxilação do para-depsídeo é seguida por rápido rearranjo intermolecular ao meta-depsídeo termodinâmicamente mais estável.

A co-ocorrência de ácido divaricático[32] e ácido sequicáico [35] em várias espécies de Ramalinafornece evidências para essa proposta59.

Os meta-depsídeos apresentam cadeias laterais de mais de 1 Carbono, como no caso dos para-depsídeos, porém, com a diferença de que as cadeias são absolutamente reduzidas. Estes substituintes se encontram sempre nas posições 6 do anel A e 6' do anel B. No primeiro caso o substituinte no C 6 é -C3H7, exceto no ácido criptoclorofeico [23], que é n-C5H11. A cadeia lateral na posição 6' é sempre n-C5H11,exceto no meta- e para- escrobiculina [33]e[34] e no ácido sequicáico [35], que é -C3H752, 55.

Os meta-depsídeos da série do b-orcinol são menos abundantes na natureza, sendo conhecidos os ácidos hemataminólico [36], hipotaminólico [37], taminólico [38] e decarboxitaminólico [39]. Este último é considerado por alguns autores como sendo um artefato resultante da descarboxilação do ácido taminólico [38] na posição 1' durante os processos de extração, não sendo, portanto, um produto natural55.Recentemente Elix et al.,60isolaram de Heterodermia dissecta, um novo meta-depsídeo derivado do b-orcinol que foi denominado ácido dissético [40].

Depsidonas Representam um grupo de compostos estruturalmente relacionados aos depsídeos, sendo estes considerados seus precursores59. Além de ligação éster presente nos depsídeos, as depsidonas apresentam também um heterociclo adicional, resultante de uma ligação éter, geralmente entre as posições 2 e 5', como no ácido fisódico [28]. Entretanto, no ácido variolárico [29] a ligação éter está entre as posições 2 e 3', sendo este o único caso, até então, conhecido.

Embora a origem biossintética das depsidonas ainda não esteja esclarecida, a existência de depsídeos e depsidonas estruturalmente relacionados no mesmo líquen indica que esses compostos podem ter relação biogenética61. Como exemplos, tem-se os ácidos olivetórico [41] e fisódico [28] isolados de Cetraria ciliaris61.

Nesse caso, a formação de depsidonas, tendo para-depsídeos como precursores, ocorre por uma ciclização oxidativa. A hidroxila da posição 2 do anel A e a posição 5' não substituída do anel B dão formação à ligação éter. Entretanto, a reação é energéticamente desfavorável e não se realiza com facilidade em condições de laboratório62.

Uma outra rota possível para a biossíntese de depsidonas é aquela sugerida por Salaet al.63,em que as depsidonas são derivadas de depsídeos através de acoplamento fenólico de benzofenonas, tendo como intermediário espirobenzofurano-3-ona. Entretanto, nenhum desses intermediários ocorre naturalmente em liquens, embora seja um processo energéticamente favorável62, 63 (Fig._2).

Embora não sejam conhecidos para-depsídeos contendo uma cadeia lateral oxidada no anel B, ocorrem alguns exemplos desse tipo de substituinte ligado ao anel A, como é o caso do para-depsídeo ácido olivetórico[41]13. Se essa oxidação ocorre na posição 3, subseqüentes rearranjos do para-depsídeo formado conduzem a meta- depsídeos por migração do grupo acila59.Se ocorrer oxidação na posição 5' seguida por uma migração de acila e subseqüente rearranjo tipo Smiles do meta- depsídeo formado, isso poderá conduzir às correspondentes depsidonas derivadas do orcinol64 (Fig._3). Os autores consideraram que tal rota poderia estar envolvida na biossíntese desses compostos.

Diferenças estruturais entre depsídeos e depsidonas não ocorrem necessariamente após a ciclização. Por exemplo, o ácido fumarprotocetrárico [42] pode ser originado por inserção do ácido fumárico na posição 3 do ácido orselínico (na forma de ácido 3-metil-orselínico) dando origem ao anel B do ácido fumarprotocetrárico, ou por esterificação direta do grupo -CH2OH do anel B do ácido protocetrárico19 [43] com o ácido fumárico.

As depsidonas originárias do b-orcinol são mais complexas do que aquelas derivadas do orcinol. Pode ocorrer em alguns compostos um anel heterocíclico com oxigênio entre os substituintes das posições 1' e 6', se estes forem grupamentos carboxila e aldeído, respectivamente. Esse tipo de ciclização ocorre nos ácidos salazínico [44], estítico [45] e norstítico [5].

Dibenzofuranos A característica estrutural desse grupo de substâncias é a ligação carbono- carbono e uma ligação éter entre duas unidades fenólicas. A ligação éter é formada a partir de grupos hidroxilas nas posições 11 e 10 da primeira e segunda unidades fenólicas, respectivamente. Os dibenzofuranos podem ser divididos em dois grupos: um deles engloba os compostos que apresentam grupo carboxila na posição 5 do primeiro anel, como os ácidos panárico [46]e chizopéltico [47],e o outro em que esse grupo não está presente nessa posição, como nos ácidos dídimico [48]e hipostrepisílico [49]33, 65, 66.

Ácidos Úsnicos Uma das substâncias originadas de liquens mais conhecida é o ácido úsnico. Foi isolado pela primeira vez de Ramalina calicaris,de Usnea barbatae de outras espécies de liquens, em 1834, por Rochleder et al.67.Apresenta-se em duas formas isoméricas: ácido (+)-úsnico [a]D20+ 495o e (-)-úsnico [a]D20 - 495o.

Em 1967, Shibata et al.68isolaram de Cladonia mitise Cladonia arbuscula o ácido (+)-isoúsnico [a]D20 + 510oe de Cladonia pleurostao ácido (-)-úsnico [a]D20 - 490o. Os ácidos úsnicos [1a]e [1b]são largamente distribuídos em liquens, enquanto que os ácidos isoúsnicos [1c] e[1d] são de distribuição restrita55.

Embora muitos autores classifiquem os ácidos úsnicos como um grupo de dibenzofuranos, considera-se que sejam formados pela ciclização do tipo floroglucinol e não do tipo orselínica, típica de dibenzofuranos46, 55.

A cadeia policetídica (ácido 3,5,7-tricetoctanóico ligado a uma enzima) resultante da condensação de 1 mol de acetilSCoA e 3 moles de malonilSCoA, por uma condensação do tipo Claisen, dá origem ao acetilfloroglucinol (metilfloroacetofenona), que é precursor dos ácidos úsnicos52.

A biossíntese do ácido úsnico foi estudada por Taguchi et al.69 usando várias espécies liquênicas e quatro precursores marcados: [1-14C]-acetato, [2-14C]- malonato, [14CH3-CO]-floroacetofenona e [14CH3-CO]-metilfloroacetofenona (Fig.

4).

Quando [1-14C]-acetato foi usado, o ácido úsnico incorporou radioatividade nas posições 2, 4, 7, 9, 11, 12, 15 e 17, enquanto que ao usar [2-14C]-malonato os grupos metila das posições 15 e 15' não estavam marcados. Isto significa que o grupo CO-CH3 em cada unidade fenólica deriva do acetato. Resultados coincidentes com esses foram encontrados por Fox et al.70 para a síntese do ácido úsnico por Cladonia sylvaticasuplementada com14 CO2.

A utilização alternativa de floroacetofenona ou metilfloroacetofenona radioativas como precursores, resolveu outro ponto importante no quadro biossintético dos ácidos úsnicos. Quando se empregava [14CH3-CO]- metilfloroacetofenona, o ácido úsnico isolado apresentava-se marcado nos grupos CO-CH3 das duas unidades fenólicas. Porém, quando o precursor era floroacetofenona marcada na mesma posição, o ácido úsnico isolado não era radioativo em nenhum dos seus carbonos43.

Entretanto, quando se administrava ao líquen floroacetofenona e formiato, ambos radioativos, o ácido úsnico formado apresentava radioatividade (Fig._5). Esse fato indicou que a formação do anel furânico entre as duas unidades fenólicas requer a adição prévia de uma unidade de 1 Carbono, visto que os fenóis não substituídos não são substratos da reação enzimática de ciclização. Ambos os substituintes metila aparecem marcados nos ácidos úsnicos quando o líquen dispõe de formiato radioativo administrado de forma exógena (Fig._5).

A formação da ligação C - C ocorre de maneira idêntica como na formação de outros dibenzofuranos, envolvendo possivelmente a formação de radicais livres.

Uma reação subseqüente de desidratação conduz à formação da ligação éter do anel furânico43. A reação é catalisada por fenol-oxidases ou por peroxidases43.

Cromonas, xantonas, naftoquinonas, antronas e antraquinonas Compostos pertencentes a essas classes também ocorrem em liquens, porém não são exclusivos desses organismos. São compostos freqüentemente idênticos a produtos biossintetizados por fungos de vida livre ou por plantas superiores.

As rotas biossintéticas propostas envolvem a formação de um policetídeo intermediário resultante da condensação de 1 mol de acetilSCoA com um número variável de moléculas de malonilSCoA. Cromonas podem ser formadas pela condensação de 1 mol de acetilSCoA com 4 ou com 8 moles de malonilSCoA, resultando na rupicolina [50] e sifulina [51]43, 52.

Xantonas e antronas são resultantes da condensação de 1 mol de AcetilSCoA com 6 e 7 moles de malonilSCoA, respectivamente 43, 44, 52.

As antronas são facilmente oxidadas às antraquinonas. As antraquinonas e seus derivados são produtos do metabolismo de fungos (Aspergilluse Penicillium sp.), liquens, basidiomicetos e plantas superiores. Clivagens oxidativas do anel B de antraquinonas produzem derivados da benzofenona que são transformados em xantonas44. A dimerização de xantonas produzindo os ácidos secalônicos ocorre, provavelmente, via fenol-oxidases, ou por radicais derivados de peroxidases44 (Fig._6).

Hemaventosina [4], ácido quiodectônico[54] e canariona [55] são exemplos de naftoquinonas que ocorrem em liquens. Hemaventosina [4] é um pigmento vermelho presente nos apotécios de Haematomma ventosum28, 29. Ácido quiodectônico [54] e canariona [55] foram isolados de Chiodecton sanguineum(Sw.)Vain. e de Usnea canariensis, respectivamente71.

As antraquinonas são pigmentos amarelos, vermelhos ou de cor laranja encontrados em liquens, particularmente nos gêneros Xanthoria e Caloplaca.

Atualmente, são conhecidas cerca de 40 antraquinonas isoladas de liquens, embora algumas ocorram também em fungos não liquenizados11.

A substância mais conhecida desse grupo é a parietina ou fisciona [56],encontrada não só em liquens, mas também em fungos e em plantas superiores.

Recentemente, Huneck et al.72 isolaram dos apotécios(i) de Haematomma puniceum um pigmento vermelho que foi denominado hematomona [58] e que se assemelha ao ácido norsolorínico [59].

Sordidona [60], sifulina[51] e ácido leprárico[61]são as cromonas conhecidas como componentes de algumas espécies liquênicas. Sifulina apresenta dois derivados, oxisifulina [62] e protosifulina [63], que foram isolados de Siphula ceralites73, 74.

Em liquensocorrem também alguns glicosídeos. De Rocellaria mollis (Hampe) Zahlbr., Schismatomma accedens (Nyl.) Zahlbr. e Roccella galepagoensis Follm.

foram isolados os glicosídeos rocelina [64], molina[65] e galapagina [66],cuja aglicona éuma cromona75.

As xantonas isoladas de liquens são derivadas da norliquexantona35 [67]. Seis desses compostos variam somente em relação ao grupo de O-metilação e à presença de cloro no anel. Entretanto, uma delas, a eritromona [68], isolada de Haematomma erytromma, é o primeiro exemplo de xantona liquênica O-acetilada76.

Além da norliquexantona [67], as xantonas conhecidas, são a turigiona [69], ácido tiofânico [70], ácido tiofanínico [71], artotelina[72], liquexantona[3], 2,4-dicloronorliquexantona[73], 2,7-dicloronorliquexantona [74]e outras Derivados da via do mevalonato Esteróis e terpenos Esteróis e terpenos não são tão freqüentes em liquens quanto em plantas superiores. Ergosterol, fitosterol e b-sitosterol são exemplos de esteróis conhecidos por ocorrerem em algumas espécies de liquens. Fungisterol foi isolado de Pseudoevernia furfuraceae77.

Outros compostos derivados do ciclopentanoperidrofenantreno também são conhecidos, incluindo divaricatinato de peroxiergosterila [75] isolado de Haematomma ventosum78.

Triterpenos constituem o maior número de compostos entre os terpenos isolados de liquens. Nesta classe de compostos estão incluídos zeorina [76], o mais conhecido triterpeno isolado de liquens, leucotilina [77],que difere da zeorina pela presença de uma hidroxila com configuração b na posição 16 e diversos compostos derivados desses por hidroxilação, acetoxilação e oxidação do grupo metila76.

Compostos como ácido ursólico, taraxenoe friedelinaocorrem também em liquens76.

Embora não tenham sido relatados estudos da biossíntese desses compostos em liquens, considera-se que esse processo segue o modelo estabelecido, envolvendo a formação de ácido mevalônico a partir de 3 moléculas de acetilSCoA que é ativado pela ação de ATP em ácido mevalônico pirofosfato, e por descarboxilação e desidratação transforma-se em pirofosfato de isopentenila, precursor biossintético dos compostos derivados do isopreno43, 53.

A condensação entre unidades de pirofosfato de isopentenila (isopreno) conduz à formação de monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos e outros43, 44,53.

Até o momento, foram isolados de liquens aproximadamente 70 compostos derivados da via do ácido mevalônico, incluindo diterpenos, sesquiterpenos e triterpenos.

Além desses, são conhecidos também 41 esteróis33.

Via do ácido chiquímico Derivados do ácido pulvínico Os derivados do ácido pulvínico são pigmentos amarelos ou de cor laranja. Nesse grupo estão incluídos compostos como calicina [78], epanorina [79], ácido leprapínico [80], ácido vulpínico [6] e outros.

Dos compostos obtidos de liquens, somente dois pertencem à classe classe das terfenilquinonas e 12 são derivados do ácido pulvínico. São compostos biossintetizados pela via do ácido chiquímico. Seus intermediários geram fenilpropanóides, que se condensam, dando origem a compostos como os ácidos polipórico [81]e telefórico [82] ou os derivados do ácido pulvínico calicina [78], epanorina[79], ácido leprapínico[80], ácido vulpínico[6] e outros43, 79.

Os derivados do ácido pulvínico são pigmentos amarelos encontrados em alguns liquens, como em Letraria vulpina, Rhizocarpum geographicum e Bryoria fremontii.As terfenilquinonas são pigmentos de cor vermelha e púrpura e, até o momento, foram isolados somente de liquens da família Peltigerales80.

Taxonomia e Quimiotaxonomia Liquens são identificados aos níveis de gêneros e espécies por várias combinações de caracteres morfológicos dos apotécios e talos.

Dados relativos apenas à análise morfológica muitas vezes não elucidam a identificação de um dado espécime, mas aliados às informações obtidas sobre a provável composição química do espécime em estudo, podem conduzir a uma identificação mais segura.

A análise química, para fins de taxonomia, é realizada utilizando reações de coloração no talo, microcristalização, análise cromatográfica, análise por fluorescência e análise por espectrometria de massas. Dependendo da natureza do material em estudo, pode-se obter informações pelo uso de apenas uma das técnicas, ou se necessário, pelo conjunto delas. As reações de coloração no talo são as mais utilizadas pelos liquenologistas e podem, em geral, fornecer informações suficientes, que somadas àquelas de análise morfológica, conduzem à identificação de uma dada espécie.

O uso de informações químicas para fins de taxonomia de liquens, deve-se ao fato de que esses organismos produzem metabólitos secundários, os quais são em grande parte exclusivos do referido grupo vegetal. Além desses, muitos outros compostos, tanto do metabolismo primário, quanto do secundário, são obtidos de liquens. Porém, muitos deles são comuns em fungos ou em plantas superiores.