Classificação e definição dos métodos de análises em fluxo (Recomendações -
IUPAC 1994)
INTRODUÇÃO
A crescente necessidade de automação de procedimentos analíticos se deve ao
aumento significativo do número de amostras laboratoriais a serem analisadas,
por exemplo, nas áreas clínicas e ambientais, e à demanda por técnicas rápidas
e confiáveis operando 24 horas por dia, freqüentemente requeridas para controle
de processos industriais. Apesar dos esforços para desenvolver sensores
seletivos e sensíveis para determinar diretamente a concentração de um analito
em uma amostra-teste (para nomenclatura relativa à amostragem, ver1), a grande
variedade dos analitos e a complexidade dos produtos a serem analisados tornam
altamente improvável que sensores para a maioria dos compostos de interesse se
tornem disponíveis em futuro próximo. Desta forma, separação e/ou conversão
química permanecem como etapas essenciais na maioria dos procedimentos de
análise quantitativa. Nestes casos, a automação dos procedimentos analíticos
implica na automação do processamento das amostras-teste. Como a maioria das
separações e conversões químicas é normalmente conduzida em fase líquida, o
conceito lógico e engenhoso de Skeggs2,3 possibilitou a execução dos processos
analíticos em um fluxo que transporta a alíquota de amostra do ponto de
introdução até a unidade de detecção. Esta abordagem tem sido denominada como
CFA, Análise em Fluxo Contínuo (segmentado).
Durante aproximadamente vinte anos, foi aceito que a segmentação, dividindo o
fluxo em compartimentos pequenos, regulares e separados por bolhas de ar, era a
melhor estratégia para se evitar o alargamento de uma zona discreta do analito
(freqüentemente denominada de dispersão da amostra) no percurso, desde o ponto
de sua introdução até o detector.
Em analogia ao seu uso na área de tecnologia de processos, onde o transporte
sem alargamento da zona é denominado de fluxo em pluguea, a zona da amostra é
freqüentemente denotada como plugue. Apesar de algumas publicações ao final dos
anos sessenta e início dos anos setenta já abordarem procedimentos nos quais a
segmentação não era aplicada (ver, por exemplo4), somente a partir da metade da
década de setenta é que foi amplamente aceito que a segmentação podia ser
omitida, utilizando-se sistemas em fluxo com dimensões e vazões adequadas,
simplificando-se assim o sistema analítico e aumentando-se o número de
amostras-teste que poderiam ser analisadas por unidade de tempo (freqüentemente
denominado de freqüência de amostragem). Esta abordagem tornou-se conhecida
como Análise por Injeção em Fluxo (FIA). Atualmente, o termo Injeção em Fluxo
(FI) é também utilizado em conjunção com técnicas analíticas tais como
potenciometria por injeção em fluxo, amperometria por injeção em fluxo,
espectrofotometria por injeção em fluxo, etc.
Sistemas nos quais os processamentos da amostra-teste podem ser considerados
como intermediários entre CFA e FIA tem sido também descritos. Um deles é o
denominado de Análise em Fluxo Monossegmentado (MSFA), no qual a alíquota da
amostra injetada é intercalada entre duas bolhas de ar5.
Independentemente destes procedimentos, os quais foram desenvolvidos e
aplicados em laboratórios analíticos, alguns métodos de análises de processos
baseados em fluxo têm sido desenvolvidos. Nestes, um fluxo contínuo de solução
contendo o analito e um ou mais reagentes são intermisturados e processados
antes de se atingir a unidade de detecção. Estes métodos são às vezes
denominados de Sistemas de Monitoramento Contínuo. Deve ser observado que CFA e
FIA também são largamente utilizados para monitoramento de processos.
O desenvolvimento de várias técnicas e procedimentos analíticos tem seguido
essencialmente caminhos independentes, cada um acompanhado de sua própria
terminologia. Isto tem gerado confusão, ambigüidade e desentendimentos,
particularmente quando os vários termos usados em diferentes métodos em fluxo
não estão de acordo com os termos antigos, já bem estabelecidos e usados em
outras áreas da Química Analítica, tais como as Cromatografias, ou mesmo em
outros ramos da ciência, tal como a Engenharia Química.
Esta publicação não pretende fornecer uma descrição completa dos métodos de
análise em fluxo e de seus componentes, mas visa a classificação dos métodos
analíticos em fluxo e a definição (padronização) da terminologia pertinente. O
seu objetivo não é considerar todos os termos utilizados; portanto, aqueles
auto-explicativos não são discutidos. A proposta e uso de nomes ou expressões
que não descrevam adequadamente aquilo que ocorre é fortemente desencorajada e,
desta forma, tais nomes e expressões são também excluídos desta publicação. Um
exemplo desta última categoria é o termo Análise Reversa por Injeção em Fluxob,
o qual pode sugerir que a direção do fluxo é invertida, quando na realidade o
reagente é injetado em um fluxo contínuo do analito, ao contrário dos
procedimentos "normais" nos quais uma alíquota da amostra é injetada
em um fluxo contínuo do reagente.
Embora também baseada em fluxo, cromatografia e seus termos típicos não serão
aqui considerados. Contudo, existem certas áreas onde métodos "em
fluxo" e métodos cromatográficos apresentam um considerável grau de
sobreposição; certo cuidado deve, então, ser tomado nestes casos, para se
evitar ambigüidade.
Atenção é dada à classificação e terminologia dos vários métodos de análise, à
descrição de alguns dos sistemas mais característicos e suas partes
constituintes importantes, bem como a alguns parâmetros importantes que
descrevem o comportamento dos sistemas como um todo e também de seus
componentes. Como a padronização e harmonização são úteis para se evitar
ambigüidade e propiciar um melhor entendimento mútuo, e não devem prejudicar a
introdução de novos conceitos e desenvolvimentos, decidiu-se dar enfoque aos
aspectos e sistemas atualmente mais importantes.
CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS ANALÍTICOS EM FLUXO
Análise em fluxo é recomendado como o nome genérico para todos os métodos
analíticos que são baseados na introdução e processamento de amostrasc em
fluxos. Uma classificação preliminar pode ser baseada em dois aspectos:
* na forma como a alíquota da amostra é introduzida, i.e. contínua ou discreta/
intermitentemente; e
* na característica básica do fluxo, i.e. segmentado, não-segmentado ou
monossegmentado; onde a segmentação é basicamente considerada como sendo
aplicada com o propósito de evitar intercontaminação de zonas de analitos
sucessivas.
Isto leva à seguinte classificação (Fig._1).
Em princípio, é possível introduzir uma terminologia mais lógica e descritiva,
com acrônimos, para que os vários procedimentos analíticos sejam ajustados à
classificação acima proposta. Por exemplo, Análise por Injeção em Fluxo pode
ser apropriadamente descrita como "sistema em fluxo não-segmentado com
injeção da amostra (-teste)" ou "sistema em fluxo não-segmentado com
injeção do reagente", e Análise em Fluxo Contínuo, denotada como
"sistema em fluxo segmentado com aspiração da amostra (-teste)". Um
sistema de injeção em fluxo baseado em zonas coalescentesd de analito e solução
reagente pode ser especificado como "sistema em fluxo não-segmentado com
injeção de amostra (-teste) e de reagente". Um processo de monitoramento
com amostragem à vazão constante e baseado no princípio da Análise em Fluxo
Contínuo, pode ser indicado como "sistema em fluxo segmentado com
amostragem contínua". Esta abordagem para classificação e nomenclatura tem
a vantagem adicional de ser facilmente expandida; assim, a natureza do meio
segmentador pode ser especificada (sistema em fluxo segmentado por gás/ar/
nitrogênio/...). Também, um sistema para extração líquido/líquido pode ser
convenientemente incorporado como, por exemplo "sistema de extração em
fluxo segmentado (e.g. tolueno) com injeção da amostra"e.
Uma introdução forçada desta terminologia poderia, contudo, violar o
desenvolvimento histórico e uso corrente dos termos, e sua aceitação a curto
prazo poderia ser questionada. Termos bem estabelecidos tais como CFA e FIA
podem ainda ser utilizados, mas devem se restringir aos casos específicos acima
mencionados. Entretanto, nomes que resultem da estrutura apresentada acima
devem ser prioritariamente recomendados.
Resumindo:Sistemas de análises em fluxo devem ser caracterizados pela indicação
do tipo de fluxo (segmentado, não-segmentado), pela forma como a amostra (-
teste) é introduzida (aspiração, injeção) e, no caso de injeção ser utilizada,
se a amostra ou o reagente é injetado. Para métodos em fluxo segmentado,
esclarecimento adicional deve ser fornecido quando o segmentador não for ar.
TERMOS QUE DESCREVEM O SISTEMA E SEUS COMPONENTES
O coração da maioria dos sistemas em fluxo é a parte do sistema entre o ponto
de introdução da amostra (-teste) e o detector. Quando esta parte consiste
simplesmente de um tubo para transportar a zona de amostra, sem alterá-la,
desde o ponto de sua introdução até a unidade de detecção, e quando a
concentração do analito se situa na faixa útil do detector, a dispersão
freqüentemente deve ser minimizada por resultar apenas em diluição da amostra
(-teste) e introduzir uma contribuição extra no tempo de resposta, reduzindo o
sinal/altura de pico em procedimentos envolvendo zonas de analito pequenas e
discretas. Na maioria dos procedimentos analíticos, entretanto, reações com a
espécie a ser determinada, ou algum tipo de tratamento da matriz (por exemplo,
ajuste de pH) devem ser conduzidos. Nestes casos, a amostra (-teste) deve ser
misturada com a solução transportadora ou com outra(s) solução(ões) contendo
constituintes do sistema tampão, reagentes, etc. Isto sempre resulta em
diluição do analito e alargamento da zona de amostra para alíquotas discretas
da amostra (-teste). A parte do módulo de análise onde os processos ocorrem é
denominada de reator. Quando somente a mistura tem que ser obtida, também é
possível referir-se a esta ação como, por exemplo, bobina de mistura.Existem
vários tipos de reatores e dispositivos para mistura:
· reator helicoidal/bobina de mistura. É um tubof o qual é enrolado para
melhorar a homogeneização radial em fluxos não-segmentados, de forma a se obter
melhores condições de mistura entre o analito e, por exemplo, o reagente ou a
solução tampão. Neste caso, é explorado um efeito conhecido como "fluxo
secundário" i.e.uma movimentação circular entre o centro do tubo e as
paredes, perpendicular à direção do fluxo principal, causada pela força
centrífugag. O grau de mistura depende da razão entre o diâmetro de enrolamento
e o diâmetro interno do tubo, aqui denominada como razão característicah.
· reator recheado.Consiste em um tubo preenchido com partículas. A dispersão é
muito menor que em tubos helicoidais abertos e é similar à que ocorre nas
colunas cromatográficas recheadas. A dispersão pode ser descrita pelos mesmos
parâmetros utilizados em cromatografia tais como altura do prato (H) e número
de pratos (N).
· reator com esferas encadeadas (SBSR)i. É um tubo preenchido com partículas
esféricas (pérolas) de diâmetro um pouco maior que a metade do diâmetro interno
do tubo; desta forma, as partículas apresentam arranjo regular6,7. A dispersão
neste tipo de reator é menor que em um reator helicoildal, mas não tão baixa
quanto em um reator recheado. A vantagem em relação aos recheados é que os SBSR
apresentam uma queda de pressão muito menor, o que permite o seu emprego com
bombas peristálticas comuns.
· reator enoveladoj. Consiste de um tubo aberto bem entrelaçado sem colapsar
suas paredes, assegurando-se a presença de inúmeros percursos curvos de pequeno
raio8. Desta forma, altas razões características localizadas e melhor mistura
radial são verificadas. O desempenho é da mesma ordem de grandeza relativamente
ao SBSR.
· câmara de mistura.É uma pequena câmara na qual as soluções admitidas são
extensivamente misturadas pela ação de forças centrífugask, usualmente
induzidas com a ajuda de um dispositivo agitador (em geral uma pequena barra
agitadora magnética)9. O comportamento pode ser aproximadamente descrito pelo
modelo de um único "tanque idealmente agitado", i.e.a concentração na
saída exibe uma resposta exponencial para uma variação instantânea na
concentração de entrada.
Vários tipos de componentes específicos podem ser incorporados aos módulos de
análise, tais como unidades de extração, unidades de diálise, membranas de
difusão (gasosa), dentre outros. Geralmente, os termos usados para tais
situações são auto-explicativos e não requerem padronização formal.
Introdução de amostras (-teste)
Com relação ao sistema de introdução do analito, deve ser enfatizado que,
particularmente no caso de injeção, a forma da zona de amostra que se move
através do sistema depende do modo de injeção. Assim, quando uma válvula de
injeção é utilizada, a forma bidimensional inicial da zona de amostra (-teste)
é aproximadamente retangular, ao passo que na introdução por meio de seringa,
cujo conteúdo pode ser lenta e gradualmente expelido, a região frontal da zona
é de formato parabólico, e a final é virtualmente plana (às vezes, isto é
chamado de injeção por tempo,ou temporizada;mas injeção por seringapode ser uma
expressão mais adequada) (Fig._2)10.
Quando o volume da amostra-teste é pequeno em comparação com o volume total do
sistema, a forma pela qual a amostra é injetada não afeta significativamente a
resposta final. Isto é particularmente verdadeiro quando o sistema contém
elementos ou módulos que contribuem significativamente para o alargamento da
zona de analito. Desta forma, o modo de injeção deve ser sempre indicado
claramente.
Originalmente, a aspiração era usada em sistemas nos quais o volume introduzido
era menos crítico, como em análise em fluxo segmentado envolvendo grandes
alíquotas de amostra. Neste caso, os dados são registrados no momento em que o
sinal praticamente atinge o estado estacionário. Entretanto, em instrumentos
modernos baseados no mesmo princípio, a reprodutibilidade da aspiração é
suficiente para permitir o emprego de pequenos volumes de amostra, o que
resulta em sinais na forma de picos, similares àqueles referentes aos sistemas
usando injeção do analito.
Detecção
A detecção influencia o sinal obtido. Alguns detectores podem indicar a
concentração média de uma seção transversal durante um certo período de tempo
comparável à medida de frações coletadas em cromatografia envolvendo coletores
de fração (cup-mixing detector). Outros, tais como os detectores de transmissão
fotométrica, podem medir a concentração média referente a um percurso (mean
value detector), ou a concentração em contato com a superfície sensora do
detector. Um detector potenciométrico cuja superfície ativa é paralela à
direção do fluxo, é um exemplo desta última categoria. Como a detecção pode
influir de maneira pronunciada no formato do sinal registrado, é importante
descrever o processo de detecção sem ambigüidade.
Com relação à avaliação do sinal, a altura do pico ou a altura a um certo tempo
fixado, a área do pico, e o tempo entre dois valores pré-estabelecidos de
sinais podem ser utilizados. A escolha mais apropriada depende do problema a
ser resolvido, e deve ser especificada.
Termos que descrevem o desempenho dos sistemas em fluxo
Após sua introdução, nem todos os elementos de fluido da alíquota de amostra
demoram o mesmo tempo para atingir o detector, existindo uma distribuição de
tempos de residência. Este fenômeno está associado à dispersão. O grau de
dispersão é um dos principais aspectos relacionados com o desempenho de um
sistema em fluxo, porque ele determina os graus de diluição e de mistura, bem
como a freqüência com que as amostras (-teste) podem ser introduzidas sem que
os sinais sejam afetados pela amostra precedente.
Dependendo do modelo adotado, várias expressões podem ser utilizadas para
descrever a dispersão da zona do analito. Em cromatografia, em geral, a altura
de prato, o número de pratos ou a eficiência da coluna são utilizados; em
engenharia química, um modelo de tanques-em-série é freqüentemente adotado, no
qual o número de tanques afeta o desempenho do sistema. O número de tanques
pode ser diretamente relacionado ao número de Péclet adimensional. (Pe= <v>.x /
D, onde <v> é a velocidade linear média, x é um comprimento característico tal
como comprimento do tubo ou diâmetro do tubo, e D é o coeficiente de dispersão,
como definido em engenharia química). Esta abordagem também tem sido empregada
na descrição de sistemas analíticos em fluxo11. Vários autores têm apresentado
soluções numéricas para a equação de convecção-difusão referente à dispersão em
tubos retos. Os resultados fornecem um melhor entendimento sobre a real
distribuição espacial do analito quando a zona está passando através do
tubo12,13.
Em aplicações analíticas, é desejável se dispor de uma quantidade
característica que descreva prontamente as concentrações do analito na zona de
amostra, antes e depois de o processo de dispersão ter ocorrido no elemento de
fluido referente ao sinal analítico14. Na literatura sobre análise em fluxo
segmentado, a razão entre estas duas concentrações tem também sido designada de
coeficiente de dispersão. Em casos onde a altura do sinal é linearmente
proporcional à concentração, a razão entre a altura do sinal registrado e a
altura máxima na ausência de dispersão (experimentalmente obtida empregando-se
volumes muito grandes de amostra) tem sido considerada. O termo
"coeficiente de dispersão" é atualmente bastante aceito em Análise
por Injeção em Fluxo. Isto é inoportuno, porque o decréscimo na concentração
não é somente devido à dispersão pura, mas também à diluição que ocorre quando
um fluxo transportador contendo a zona de analito conflui com outros fluxos.
Ainda, o termo foi previamente definido em engenharia química para equações de
transporte de um modo análogo ao coeficiente de difusão na lei de Fick.
Portanto, em análise em fluxo, seria mais apropriado usar termos tais como
sinal/altura de pico adimensional ou reduzida ao invés de coeficiente de
dispersão mas, novamente, a proliferação do termo "coeficiente de
dispersão" tem sido tal que torna-se virtualmente impossível reverter ou
inibir o seu uso. Como é absolutamente claro, a partir do contexto, o que ele
significa, isto não deve causar muitos problemas. Contudo, deve-se estar atento
a esta discrepância ao se discutir métodos analíticos em fluxo com engenheiros
químicos.
Quando as expressões acima que descrevem o desempenho apresentam uma relação
mais ou menos direta com a realidade física, é também possível caracterizar o
sinal em termos puramente matemáticos ou estatísticos, tais como primeiro,
segundo, terceiro momentos, etc. representando a média, o desvio padrão e a
assimetria do sinal, respectivamente.
Finalmente, deve ser dada atenção ao termo "freqüência de
amostragem". Na maioria dos documentos científicos sobre métodos em fluxo,
este termo se refere à freqüência com que as amostras (-teste) subsequentes
podem ser injetadas sem que os correspondentes sinais analíticos sejam afetados
pelos sinais anteriores. Deve-se salientar que isto não é equivalente ao número
de amostras (-teste) que podem ser analisadas por unidade de tempo pois, na
prática, calibrações regulares com amostras-padrão se fazem necessárias e, em
geral, o sistema pode requerer limpeza pela introdução de soluções de lavagem;
ainda, é bastante usual a introdução repetitiva de amostras e o emprego da
média para se obter o resultado da análise. Todos este fatores incluídos fazem
com que o número de amostras (-teste) que podem ser processadas na prática seja
reduzido por um fator de pelo menos quatro.
