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Biocatálise em meios aquo-restritos: fundamentos e aplicações em química analítica

INTRODUÇÃO Na última década, os conceitos relativos as reações enzimáticas mudaram drasticamente. Embora a constatação que certas enzimas apresentam atividade catalítica em meio orgânico date do início do século, foi a partir dos anos 80 que as macromoléculas biológicas passaram a ser vastamente utilizadas em outros meios que não o aquoso. Dentre as numerosas aplicações de reações enzimáticas em meio orgânico, destacam-se a síntese de produtos de interesse nas áreas clínica, nutricional, ambiental, industrial e biotecnológica. Paralelamente, a utilização de biossensores em meio não aquoso também levou a novas aplicações, tornando possível trabalhar em meios até então inexplorados ou analisar espécies de caráter hidrofóbico, entre outras vantagens. A seguir serão apresentados vários aspectos de importância no controle da atividade enzimática em solventes orgânicos, bem como diversas aplicações analíticas envolvendo reações enzimáticas em meio não aquoso.

REAÇÕES ENZIMÁTICAS EM MEIO AQUOSO A utilização de reações enzimáticas pelo homem se confunde com os primórdios da civilização. Inicialmente esta utilização ocorreu exclusivamente de forma doméstica, para mais recentemente tornar-se de grande importância em uma vasta gama de aplicações industriais.

Nas últimas décadas, a extraordinária seletividade de substratos (incluindo quimio-, régio- e enantio-especificidade), passou a ser explorada de forma cada vez mais intensa. A capacidade das enzimas de catalisar reações em meio aquoso, em condições moderadas de temperatura e de pressão, reduzem a possibilidade de danos a analitos termossensíveis e minimizam, também, os efeitos de corrosão em alguns processos químicos. Em contrapartida, a aplicação eficaz de enzimas tem sido restrita devido a uma série de limitações, particularmente aquelas referentes à sua estabilidade operacional (essencial para uso por longos períodos ou para procedimentos automatizados) e, em muitos casos, à pouca solubilidade dos analitos.

Para eliminar esses efeitos desfavoráveis, algumas estratégias têm sido investigadas. A mais antiga é a via sintética1 que utiliza técnicas da química orgânica buscando a síntese de catalisadores com atividades similares à de enzimas. Recentemente, foi demonstrado que técnicas de engenharia de proteínas podem promover a formação de ligações intramoleculares estrategicamente posicionadas, a modificação da polaridade ou, ainda, a alteração da densidade de carga na superfície da proteína2,3, produzindo biocatalisadores robustos capazes de manterem a atividade catalítica mesmo em condições pouco favoráveis.

Outra abordagem tem sido a utilização de procedimentos para a imobilização (insolubilização) das enzimas, preferencialmente, através de ligações covalentes (opção de um ou vários pontos de ligação) Neste caso, ligações múltiplas originam preparações mais estáveis, entretanto com menor flexibilidade espacial das enzimas, resultando geralmente em decréscimo de atividade.

Esses métodos de imobilização estão disseminados tanto em aplicações industriais como em sistemas de análise. Exemplos de aplicações analíticas envolvendo enzimas imobilizadas são os biossensores, os reatores para análises cromatográficas ou em sistemas de análise por injeção em fluxo, cabendo ainda destacar aplicações envolvendo kits para titulações e para imunoensaios.

Contudo, os procedimentos de imobilização, normalmente, são laboriosos e bastante demorados além de acarretarem limitações difusionais e ainda custos adicionais. As principais vantagens advindas da aplicação de enzimas imobilizadas4,5 são mostradas na Tabela_1.

Uma outra possibilidade, para reduzir as limitações da estabilidade, é o emprego direto de enzimas naturais de organismos extremófilos que são bastante estáveis às "intempéries" ambientais6,7 em seu meio natural.

Com respeito às restrições de solubilidade do analito, os recursos mais utilizados são a adição de um solvente miscível ou de um surfactante no meio onde ocorrerá a reação. Freqüentemente, o emprego desses aditivos pode provocar diminuição da atividade enzimática.

Os métodos enzimáticos convencionais têm sido empregados em meio aquoso principalmente devido a idéia preconcebida de que este é um bom ambiente para a manutenção da conformação estrutural da enzima cataliticamente ativa. Essa noção não é completamente verdadeira. Muitas enzimas (ou complexos multienzimáticos) tais como lipases, esterases, desidrogenasese aquelas responsáveis pelo metabolismo xenobiótico, são cataliticamente ativas em ambientes hidrofóbicos naturais8 com eficiência similar àquela em soluções aquosas, ou em certos casos, até superior. Em sentido estrito, podem ser considerados como ambientes não-aquosos os solventes orgânicos9-12, os fluidos supercríticos13, os gases14, os substratos líquidos ou misturas eutéticas de substratos livres de solvente15.

Reações enzimáticas em meios aquo-restritos A catálise enzimática em meio orgânico possui uma enorme potencialidade para aplicações em síntese orgânica (separação de álcoois ou ácidos racêmicos16,17, síntese de peptídeos18), na indústria (síntese de aspartame19, interesterificação regiosseletiva de óleos e gorduras20) e particularmente, na (bio)analítica21.

Apesar do reconhecimento desses benefícios, o número de trabalhos onde enzimas têm sido utilizadas para propósitos analíticos em meio não-aquoso é, ainda, bastante limitado, quando comparado com a profusão de monografias produzida em fase aquosa. As principais razões listadas por Braco22 que podem justificar esse desequilíbrio no uso de meios aquosos e não-aquosos em métodos analíticos mediados por enzimas são: a) o comportamento de inúmeras enzimas em ambientes aquo-restritos ainda permanece inexplorado; b) muitas amostras reais são aquosas ou encontram-se em meio aquoso o que implica, muitas vezes, ou numa partição ineficiente ou no acréscimo de uma etapa no processo para a extração do analito de interesse na fase orgânica; c) os fundamentos da enzimologia em meios não-aquosos foram estabelecidos muito recentemente; d) o uso de solventes orgânicos pode, muitas vezes, colocar em risco a saúde do analista (por serem tóxicos, inflamáveis e/ou explosivos) além de poderem acarretar problemas ambientais. A esse respeito, a possibilidade do emprego de solventes não-tóxicos, biocompatíveis com os lipídeos em aplicações analíticas tem sido amplamente explorada23.

Inúmeras pesquisas têm demonstrado as vantagens da biocatálise em meios aquo- restritos, oferecendo uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de novas tecnologias e de biossensores na determinação de importantes analitos (insolúveis em água) e de matrizes de amostras hidrofóbicas. Na Tabela_2 são apresentadas as principais vantagens da realização de reações enzimáticas em meios aquo-restritos.

A introdução de biossensores eletroquímicos, em meios não-aquosos, tem encontrado variadas aplicações no processamento industrial e em testes de controle de qualidade. Quando utilizados em sistemas de análise por injeção em fluxo, propriedades tais como velocidade, portabilidade e simplicidade de análise são conseguidas. Neste contexto, o desenvolvimento de novos biossensores amperométricos em meios não-aquosos deve ser explorado em profundidade por químicos, bioquímicos e engenheiros.

A seguir, serão discutidos de forma concisa, os princípios básicos do comportamento das macromoléculas biológicas (enzimas, anticorpos, anticorpos catalíticos) e receptores abióticos em ambientes não-aquosos (função da água, critérios para a seleção do solvente, efeitos de memória, estabilidade térmica, alteração da especificidade enzimática, influência do pH). Aplicações correntes e perspectivas futuras de biossensores em fase orgânica também serão abordados.

Fatores que controlam a atividade enzimática em solventes orgânicos Água As propriedades solventes da água resultam das forças atrativas fortes (as pontes de hidrogênio) que existem entre as suas moléculas. A molécula de água e seus produtos de ionização, H+e OH-, influenciam profundamente a estrutura, a automontagem e as propriedades das enzimas. As biomoléculas polares dissolvem- se facilmente na água (hidrofílicas) porque elas podem substituir as interações moleculares água-água, energeticamente favoráveis, por interações do tipo pontes de hidrogênio e eletrostáticas, ainda mais favoráveis, no sistema água- soluto. A variação da entalpia (DH) pela dissolução desses solutos é, geralmente, pequena. Diferentemente, moléculas não-polares interferem com as interações água-água e são muito pouco solúveis na mesma água (hidrofóbicas).

Estas moléculas não-polares tendem, quando em solução aquosa, a agregarem-se de forma a minimizar os efeitos energeticamente desfavoráveis provocados pela sua presença.

Biomoléculas como as enzimas são anfipáticas, possuindo regiões superficiais polares (ou carregadas) e não-polares. Em um ambiente aquoso, essas duas regiões da molécula experimentam tendências conflitantes; a região hidrofílica interage favoravelmente com a água enquanto a região hidrofóbica tem a tendência de evitar o contato com a água (Figura_1A). Assim, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos das enzimas agregam-se para apresentar a menor área hidrofóbica possível à água (ficam confinados no interior da molécula protéica) e as regiões polares são arranjadas para maximizar as interações com o solvente aquoso (Figuras_1B e 1C).

Quando a água é substituída por um solvente orgânico, alterações na conformação nativa da enzima podem ocorrer tanto na estrutura terciária como nas mais proeminentes estruturas secundárias (a a-hélice e a conformaçãob) acarretando, desta maneira, a sua desestabilização. Com o objetivo de assegurar uma conformação enzimática cataliticamente ativa em meio orgânico, a molécula da enzima deve ter uma camada de hidratação definida24,25, separando o solvente do contato com a superfície da proteína e contribuindo para o aumento da sua flexibilidade interna.

Quando água é adicionada a um sistema enzimático não-aquoso, ela é distribuída entre solvente, enzima, substrato e suporte (se presente). A quantidade de água ligada as moléculas de enzima é fundamental para a atividade catalítica em meio não aquoso. A explicação mais provável para isso advém do fato da água aumentar a mobilidade e a flexibilidade dos sítios ativos e, concomitantemente, a polarização da estrutura protéica.

Numerosas discussões e trabalhos26-28 têm sido dedicados para determinar a quantidade adequada de água para a atividade enzimática em meio orgânico. Zaks e Klibanov27 examinaram três modelos de enzimas - polifenoloxidase, álcool desidrogenaseeálcool oxidase- em solventes de hidrofobicidades e conteúdos de água diferentes. Eles mostraram que a atividade enzimática estava relacionada à quantidade de água ligada à proteína e não à concentração de água nos solventes orgânicos. A água ligada àquelas enzimas em solventes orgânicos não formaria uma camada de água verdadeira mas, de preferência, uns poucos "clusters", provavelmente, em torno de regiões carregadas e polares da superfície enzimática. Os resultados desse estudo foram re-interpretados em termos de atividade de água por Halling29, confirmando que a atividade enzimática ótima está relacionada com a atividade de água, independente do solvente usado. Este mesmo autor30 tem proposto que a atividade termodinâmica da água é um parâmetro que deve ser usado para quantificar o nível de água associado com a enzima. A água, dessa maneira, é requerida, unicamente, para a função catalítica das enzimas em solventes orgânicos, contribuindo para a formação de todas as ligações não covalentes e pontes de hidrogênio da estrutura protéica.

A quantidade de água necessária para catálise depende das características de cada enzima. Lipases são altamente ativas quando poucas moléculas de água estão associadas com a molécula protéica31-33. Subtilisinae a-quimotripsinanecessitam menos de 50 moléculas de água por molécula de enzima para exibir sua atividade mínima27. Álcool oxidase, álcool desidrogenase e polifenoloxidase, entretanto, são unicamente ativas quando um elevado número de moléculas de água (3,5 x 107) estão ligadas com a molécula de enzima formando uma monocamada34.

Água fortemente ligada pode ser encontrada em preparações enzimáticas desidratadas por liofilização em níveis tão baixo quanto 0,01%. Wehtje et al.35 utilizaram a a-quimotripsina em acetato de etila com diferentes concentrações de água e verificaram grandes modificações na atividade catalítica desta enzima. Há um aumento da velocidade de reação com o incremento do grau de hidratação da enzima até atingir uma condição ótima (Figura_2). Isso, provavelmente, se deve ao aumento da flexibilidade interna da molécula de enzima. Um aumento acima destes valores resultou na diminuição da atividade enzimática. Nesse caso, a água atuaria como um substrato na reação enzimática especialmente em reações hidrolíticas, produzindo reações secundárias e diminuindo o rendimento do processo químico. Outros autores36,37 têm comprovado que a água está envolvida em muitos processos de inativação enzimática propiciada pela agregação da enzima devido as reações de transmidação e formação intermolecular de pontes de dissulfeto.

Existe um consenso de que as enzimas são mais termoestáveis em meios com baixo conteúdo de água do que em soluções aquosas. Isto pode ser explicado pelo aumento da rigidez e pelos processos covalentes envolvidos na inativação irreversível, tais como deamidação, hidrólise de peptídeos e decomposição da cistina, que necessitam de água. Estes processos são extremamente lentos em meios de baixa concentração de água. O aumento da termoestabilidade tem sido mostrado para lipase do pâncreas de suínos10, a-quimotripsina27, ribonuclease,a-quimotripsina, lisozima36e tirosinase38.

Embora a presença de água ligada seja uma condição necessária para a retenção da atividade catalítica e estabilidade em meios não-aquosos, alguns estudos têm demonstrado que as enzimas eritrocupreína39, xantina oxidase40, lipase pancreática41 e subtilisina42 retêm sua atividade catalítica em solventes orgânicos verdadeiramente anidros (dimetilsulfóxido, formamida, piridina ou dimetilformamida). Os mecanismos moleculares que protegem a conformação dessas enzimas e as suas propriedades catalíticas nesses solventes orgânicos ainda permanecem obscuros.

Além dessas propriedades naturais, a modificação química pode reduzir a quantidade de água requerida por uma enzima tornando-a, desta maneira, mais hidrofóbica. Esta sugestão foi comprovada pelo aumento na atividade da peroxidase após deglicosilação ou modificação benzil- e poli-(etileno glicol)43.

Solvente As modificações no sistema biocatalítico somente afetarão o biocatalisador quando estas ocorrerem nas proximidades moleculares da enzima. Quando se dissolve um solvente orgânico imiscível em água (sistema bifásico líquido- líquido) a concentração do solvente é variável e depende de sua solubilidade em água. Isto significa que o biocatalisador, nesses sistemas, não experimenta uma concentração do solvente que exceda a solubilidade deste na fase aquosa. Dessa maneira, o biocatalisador estará exposto na interface do sistema líquido- líquido o qual poderá ser nocivo para ele44.

Para solventes miscíveis não há limite de solubilidade do solvente na fase aquosa e qualquer concentração deste pode ser obtida nestes sistemas. Tem sido mostrado que há um valor limite para a concentração do solvente orgânico onde se inicia a inativação (ver Tabela_3)45,46. Tem sido demonstrado quantitativamente, que solventes não polares não são suficientemente solúveis em água para alcançar a concentração limite de inativação47.

Os efeitos do solvente sobre a velocidade de reação da catálise enzimática em sistemas de uma ou duas fases podem ser diretos ou indiretos48. Os efeitos indiretos compreendem a partição de reagentes e de produtos, a alteração do equilíbrio químico e mais a transferência de massa em sistemas de duas fases.

Os efeitos diretos são responsáveis pela redução da atividade e pela inativação (desestabilização) da enzima através de dois mecanismos: primeiramente, pela interação solvente-enzima que altera a conformação nativa da enzima devido a penetração do solvente no âmago hidrófobo da proteína provocando a quebra das ligações de hidrogênio e das interações hidrofóbicas49.

Uma exceção, seria a estabilização conformacional adquirida pela enzima em meios não-aquosos, através do "efeito gaiola". Neste caso, as moléculas das enzimas, no interior da proteína, estariam firmemente espremidas pelas moléculas ao seu redor50 à semelhança das enzimas imobilizadas.

Outra maneira na qual os solventes afetam a atividade é por interação direta com a água essencial em torno da molécula enzimática51. Solventes altamente polares são capazes de absorver água avidamente e retirar a camada de hidratação da enzima, provocando a perda das propriedades catalíticas por inativação ou desnaturação. Reciprocamente, os solventes hidrofóbicos por serem menos capazes de arrastar "para fora" ou deformar a camada de hidratação podem apenas afetar parcialmente a atividade catalítica.

É importante frisar que há exceções notáveis. A xantina oxidase40, a lipasepancreática suína41 e a subtilisina42mantêm suas propriedades catalíticas tanto em solventes orgânicos como em meio aquoso. Uma possível explicação para este fato é que essas enzimas são capazes de reter sua camada de hidratação tão fortemente que mesmo solventes hidrofílicos não conseguem retirar a água.

Muitas maneiras diferentes têm sido descritas na literatura para quantificar a hidrofobicidade52. Os mais importantes indicadores de hidrofobicidade são citados na Tabela_4.

Laane et al.53 discutiram amplamente os parâmetros da Tabela_4 e concluíram que o Log P apresentava a melhor correlação com a atividade enzimática. Desta maneira, o Log P, definido como o logaritmo do coeficiente de partição em um sistema bifásico padrão octanol/água foi introduzido como uma medida quantitativa da polaridade do solvente.

Para moléculas simples, os valores do Log P são conhecidos ou podem ser calculados das constantes fragmentais hidrofóbicas (hydrophobic fragmental constants - hfc) de Rekker e Kort54. Estes valores foram obtidos por comparação dos valores de Log P de uma série de compostos homólogos determinados experimentalmente. Os compostos orgânicos mais comuns e seus respectivos Log P estão listados na Tabela_5. Pela adição do hfc próprio, o Log P pode ser calculado para qualquer composto relativamente simples.

Para exemplificar, o Log P do pentanol (CH3 (CH2)4OH) é: 1 x CH3+ 4 x CH2 + 1 x OH = 1 x 0,701 + 4 x 0,519 + (-1,595) = 1,182, que é um valor próximo ao determinado experimentalmente, 1,30. Deve-se notar que para estruturas conjugadas os cálculos são mais elaborados, pois correções são necessárias para produzir o valor Log P adequado. Geralmente, para estruturas mais complexas, o Log P é determinado pela medida da concentração no equilíbrio do soluto em ambas as fases, por técnicas convencionais.

Há poucos casos de desvios mais acentuados entre os valores calculados e os preditos: pentanol, 1,5655 comparado com 1,3; ciclohexanol 1,2356 comparado com 1,5; acetato de benzila, 1,9656 comparado com 1,6; CCl4, 2,7256 comparado com 3,0 e pentano,3,3156comparado com 3,0. Algumas dessas diferenças podem refletir erros nas medidas. Em compensação, boa concordância têm sido conseguida para numerosos solventes.

Baseado nestes resultados, o Log P foi introduzido como uma medida quantitativa da polaridade do solvente53,57. Geralmente, a atividade enzimática é baixa em solventes relativamente hidrofílicos, que apresentam Log P < 2, é moderada em solventes tendo Log P entre 2 e 4 e é alta em solventes apolares, onde Log P > 4 (ver Tabela_5).

Outro fator a ser considerado para a seleção do solvente é a solubilidade do substrato e do produto nos meios58. Por ex., açúcares são solúveis apenas em solventes hidrofílicos (miscíveis com a água) tais como piridina (Log P = 0,71) ou dimetilformamida (Log P = -1,0). O uso de solventes imiscíveis com a água é inviável para a catálise enzimática, pois não ocorre nenhuma interação entre o açúcar insolúvel e a enzima também insolúvel. De modo similar, compatibilidade dos produtos da reação enzimática com o solvente é crucial. Produtos polares tendem a permanecer na camada de água em torno da enzima e isto causará inibição ou reações secundárias indesejáveis. Esta situação foi encontrada na catálise de fenóis pela polifenoloxidase em hexano11 (Log P = 3,50) e na oxidação do álcool benzílico pela álcool oxidase, também em hexano59. No primeiro caso, os produtos polares gerados (o-quinonas) são insolúveis em hexano e rapidamente se polimerizam no ambiente aquoso próximo a enzima, provocando a sua inativação. Em um solvente mais polar como o clorofórmio (Log P = 2,0), os produtos se distribuem por todo o solvente e não inativam a enzima11,60.

Apesar da ampla utilização do Log P como parâmetro para ser relacionado com a atividade enzimática, algumas discrepâncias têm sido relatadas61,62. Reslow et al.63, mostraram que a inclusão do parâmetro solubilidade de Hildebrand (d) em água ajudava na relação solvente orgânico/atividade enzimática. Valivety et al.64, mostraram que a atividade catalítica era melhor relacionada como uma função não só do Log P mas também com o índice de aceitação de elétrons ou polarizabilidade. Posteriormente, Wehtje65e Yang e Robb66verificaram que não havia nenhuma relação satisfatória entre a atividade do biocatalisador e o Log P.

Outras propriedades do solvente têm sido relacionados com a atividade enzimática. Por exemplo, a atividade da álcool desidrogenase aumentou com a diminuição da constante dielétrica do solvente67 e uma relação linear foi observada entre a atividade da lipasee o Log Sw/o (solubilidade molar da água em um solvente)68.

Pelos aspectos apresentados, pode-se concluir que ainda não há um parâmetro quantitativo confiável que possa refletir as múltiplas interações entre enzima- solvente orgânico que permita predizer, com sucesso, a atividade biocatalítica ótima em meio não aquoso.

Vários autores têm buscado essa solução. Schneider69 propôs um parâmetro de solubilidade tridimensional pela combinação dos parâmetros Log P, d e ligações por pontes de hidrogênio. Khmelnitzky et al.46, desenvolveram um modelo matemático denominado "capacidade desnaturante" que relaciona algumas características físico-químicas do solvente orgânico, tais como hidrofobicidade, capacidade de solvatação e geometria molecular. Batra e Gupta70, mediram as atividades da polifenoloxidase, peroxidase, fosfatase ácida e tripsina na presença de diferentes solventes e constataram que a variação na atividade enzimática com a natureza do solvente não está relacionada com o Log P nem com a capacidade desnaturante.

É possível que estudos futuros, envolvendo um grande número de proteínas de natureza diferentes (por ex., proteínas com estrutura quaternária), possam introduzir parâmetro(s) que possibilite(m) a otimização das concentrações limites dos solventes orgânicos que retenham e/ou maximizem a atividade e a estabilidade do biocatalisador em sistemas bifásicos.

pH e alteração da especificidade enzimática Entre as questões intrigantes referentes a ação das enzimas em solventes não- aquosos encontra-se o pH. Todas as reações enzimáticas em água são fortemente dependentes do pH visto que o estado de ionização da enzima é essencial para a catálise. Desde que protonação e desprotonação da enzima raramente ocorrem de maneira perceptível em um meio orgânico, como a enzima reconhece o pH em solventes orgânicos anidros? A resposta é um tanto inusitada: a enzima "recorda-se" do pH da última solução aquosa a que foi expostae isto tem sido chamado de "memória de pH"41,71. A nível molecular, os grupos ionogênicos da molécula enzimática adquirem uma certo grau de ionização na solução aquosa a um dado pH - e a atividade enzimática correspondente a este pH - que é mantido sem modificação nos solventes orgânicos como também no estado sólido.

Desta maneira, a capacidade tamponante do microambiente aquoso deve ser controlada e algumas substâncias como hidrocloreto de trisoctilamina e ácido trifenil acético (sal sódico)72 têm sido adicionadas às soluções aquosas que vão ser liofilizadas ou introduzidas na fase orgânica. A perda da "memória de pH" na hidratação pode ser atribuída a redistribuição de cargas na superfície da proteína.

Tem sido registrado que a liofilização da a-quimotripsinaem soluções aquosas contendo certos ligantes (N-acetil-l-fenilalanina) tem efeitos significativos sobre a atividade catalítica desta enzima em fase orgânica. Foi observado um aumento de até 35 vezes na sua atividade quando liofilizada napresença daquele ligante27. Efeitos similares têm também sido documentados para subtilisina73 e de novo, mais recentemente, para a-quimotripsina74,75. Esse aumento na atividade deve-se ao efeito "fechadura" entre ligante e enzima tendo como resultado uma conformação enzimática mais ativa. A enzima assume uma nova conformação quando ocorre a sua união com o ligante que é complementar para aqueles substratos com a mesma estereoquímica. Esta conformação é "congelada" - torna-se rígida - e permanece quando a enzima é transferida para um solvente orgânico, visto que a mobilidade das moléculas de enzima é muito menor neste meio do que na água76.

Esse fenômeno permitiu o desenvolvimento da técnica de "moléculas impressas" (molecular imprinting) de Stahl et al.74 e de Braco et al.77. O trabalho de Braco et al.77 mostrou que a albumina de soro bovino, quando liofilizada a partir de uma solução aquosa contendo ácido p-hidroxibenzóico ou ácido l-tartárico, desenvolveu uma afinidade específica para estes ligantes quando em solventes orgânicos anidros. Por outro lado, Stahl et al.74 mostraram que usando um sistema similar, a a-quimotripsinapode se tornar aceptora de derivados do d-aminoácido.

O mais importante desse fenômeno é a sua possível utilização na preparação de uma enzima, em meio orgânico para análise. Assim, uma alteração da especificidade enzimática pode ser obtida em favor de um particular analito se a enzima for liofilizada na presença de uma solução aquosa concentrada deste analito. Zaks e Klibanov10comprovaram que a lipasepancreática suína, em meio aquoso reage, indiferentemente com substratos pequenos ou grandesenquanto que a enzima desidratada, em meio orgânico, não reage com moléculas grandes (álcoois terciários), presumivelmente, devido a rigidez do seu centro ativo que não pode mais ser aberto para acomodá-las.

Estabilidade térmica de enzimas em solventes não-aquosos As moléculas de água, que se encontram em torno da molécula enzimática nas soluções aquosas, exercem um papel importante na estabilidade protéica devido, principalmente, às interações hidrofóbicas78-80 além das forças de van der Waals, pontes salinas e pontes de hidrogênio81. Desta maneira, todas as reações que provocam termoinativação irreversível de enzimas envolvem água livre82,83 e a desnaturação, induzida pelo calor, necessita de uma ampla mobilidade conformacional. Assim, não é surpresa que a manipulação da natureza do meio e da quantidade de água em torno da enzima tem um profundo efeito sobre sua estabilidade.

A remoção de água da superfície da proteína, indubitavelmente, diminui os efeitos hidrofóbicos provocando a sua desestabilização. Isto conduz a uma reorganização das moléculas de água devido ao incremento do número de ligações intramoleculares por pontes de hidrogênio78 que contribui para a estabilização e aumento da rigidez da proteína. O componente predominante destas ligações intramoleculares é eletrostático. Logo, a estabilidade dessas ligações deve aumentar em solventes com baixa constante dielétrica.

Quando proteínas são expostas a temperaturas elevadas por um período prolongado, elas sofrem um processo de desenrolamento que expõe os grupos reativos e áreas hidrofóbicas mais internas, acarretando modificações químicas irreversíveis, o desordenamento monomolecular e agregação. Os processos químicos que freqüentemente levam à inativação (altamente acelerados em temperaturas elevadas) são a deamidação dos resíduos de asparagina e glutamina, hidrólise das ligações peptídicas nos resíduos de ácido aspártico, permuta dissulfeto-tiol, destruição de ligações dissulfeto, oxidação de cisteínas, isomerização de prolinas, glicação de aminogrupos e outros processos químicos84. Todos esses processos exigem a participação de água e, portanto, não devem ocorrer em um microambiente livre de água como nos solventes orgânicos anidros.

Inúmeros autores têm demonstrado que suspensões enzimáticas em solventes orgânicos anidros exibem termoestabilidade bem superior do que aquelas em soluções aquosas. Alguns exemplos estão agrupados na Tabela_6. Um exemplo bastante ilustrativo da significativa diferença de termoestabilidade entre meio aquoso e meio orgânico é o caso da tirosinase. Esta enzima possui uma vida média, a 50oC, nove vezes superior em clorofórmio do que em solução aquosa.  

Reslow et al.63(a-quimotripsinadesidratada imobilizada sobre superfície porosa de vidro) e Zaks e Klibanov10,27 (lipase, a-quimotripsinae subtilisinaliofilizadas) concordam em que a estabilidade térmica é fortemente dependente da hidrofobicidade do solvente. Na presença de apenas 1,0% de água no meio orgânico, a estabilidade da lipaseaproxima-se da sua estabilidade em meio aquoso. Isto significa que a estrutura da enzima permanece inalterada (enrolada) em meio orgânico, mesmo em altas temperaturas. A água exerce papel relevante em tais processos, aumentando de forma significativa a flexibilidade conformacional das enzimas. Zaks e Klibanov10demonstraram que a lipasepancreática de suínos em solução aquosa a 100oC foi completamente inativadaem menos de dois minutos., ao passo que nesta mesma temperatura, mantém elevada atividade por várias horas, se o percentual de água presente não ultrapassar 0,4%, como pode ser visto na Figura_3.

Biossensores, em geral, operam em temperaturas ótimas para que a reação biocatalítica se processe rapidamente e tenha grande sensibilidade. Entretanto, em muitos casos, a temperatura ideal para a reação enzimática ocorrer não coincide com a condição mais favorável para os demais parâmetros envolvidos no processo. O aumento da estabilidade térmica das enzimas proporcionada pelos solventes orgânicos é uma vantagem importante do ponto de vista operacional da enzima, ampliando o intervalo de temperatura onde ocorre um dado processo químico de interesse.

APLICAÇÕES ANALÍTICAS DE ENZIMAS EM MEIOS NÃO-AQUOSOS O principal impulso da química industrial moderna é a busca incessante de maior especificidade nos processos bioquímicos. A falta de seletividade resulta em aumento de custos advindo dos processos de separação, purificação e tratamento de resíduos. Por outro lado, o conhecimento de que enzimas são específicas e podem funcionar vigorosamente em sistemas anidros ou com baixo conteúdo de água, tem proporcionado variadas transformações de importância biotecnológica.

Klibanov94,95, Dordick96 e tanaka e kawamoto97 têm revisado as inúmeras aplicações de tais sistemas. Uma lista da natureza de tais aplicações é mostrada na Tabela_7.

Apesar dessas limitações, aplicações e vantagens de dispositivos bioanalíticos baseados em enzimas (biossensores enzimáticos) que funcionam em fase não-aquosa têm sido demonstradas solucionando diversos problemas analíticos de indústrias de alimentos, de bebidas, farmacêuticas, petroquímicas, militar e de cosméticos, além do seu emprego na agricultura e nos diagnósticos clínicos.

Antes dessa exploração, somente uns poucos sensores enzimáticos operavam em meios não aquosos. As enzimas eram mantidas em um compartimento aquoso separadas do meio orgânico por uma membrana permeável seletiva. Um exemplo desse tipo de sensor foi idealizado pela Phillips Petroleum para a determinação do conteúdo de álcool na gasolina21. Ele consistia de um eletrodo de oxigênio onde a álcool oxidasese encontrava imobilizada na extremidade e mantida adequadamente hidratada por uma membrana externa semi-permeável. O álcool no meio aquoso poderia atravessar essa membrana e na camada onde se encontrava a enzima hidratada era biocataliticamente oxidado. A diminuição concomitante da concentração de oxigênio era medida amperometricamente. Em outros casos, a solubilidade do analito insolúvel em água era aumentada pelo uso de detergentes. Isso, normalmente, acarretava perda de sensibilidade do sensor tanto pela insolubilidade do analito em água como devido ao próprio detergente.

Entretanto, se a enzima era capaz de funcionar em uma fase predominantemente orgânica, então analitos de baixa solubilidade em água poderiam estar em altas concentrações para a bioanálise. Independente dessa característica - aumento de solubilidade - os biossensores em fase orgânica podem oferecer outras vantagens que são mostradas na Tabela_8.

Hall et al.125,126 descreveram, em 1988, o primeiro biossensor no qual o biocatalisador estava em contato direto com a fase orgânica, para a determinação amperométrica de fenóis em clorofórmio. Neste solvente, a polifenoloxidasecatalisava a conversão do composto fenólico a benzoquinona, que era eletroquimicamente reduzida em eletrodo de carbono vítreo a -275 mV (vs ECS).

Algumas aplicações dos sensores enzimáticos, anticorpos e de compostos com características similares à dos anticorpos (antibody mimics) em ambientes aquo- restritos desenvolvidas nos anos recentes serão, a seguir, brevemente discutidos.

Eletrodos enzimáticos de fase orgânica Nos últimos oito anos, uma considerável atenção tem sido dada à pesquisa e ao desenvolvimento de biocatalisadores de fase orgânica para serem utilizados em síntese, no processamento industrial e, particularmente, como ferramenta analítica nos testes de controle de qualidade. Estes biossensores podem ser usados para a detecção, direta e específica, de analitos hidrofóbicos de uma variedade de amostras complexas que se tornam acessíveis ao microambiente enzimático devido ao meio orgânico.

Muitos dos recentes avanços nesta área têm sido obtidos utilizando-se técnicas de detecção eletroquímica que se expandiram durante as décadas de 60 e 70 usando eletrodos convencionais e solventes tais como dimetilformamida, acetonitrila, carbonato de propileno e dimetilssulfóxido. Estes solventes possuem algumas características importantes: constantes dielétricas baixas, a capacidade de solubilizar analitos orgânicos e alguns compostos inorgânicos, resistência à oxidação e à redução (ampliando a faixa de potencial de trabalho) e, geralmente, boas características de estocagem. Uma abordagem sobre eletroquímica em fase orgânica pode ser encontrada em Saini et al.21.

Com o desenvolvimento da tecnologia dos biossensores, outras técnicas de transdução, além da eletroquímica, têm sido exploradas. Parâmetros tais como oxigênio, gás carbônico, peróxido de hidrogênio e pH são comumente detectados nas reações biocatalíticas. Para esses e outros parâmetros, uma ampla variedade de métodos e ou sensores espectrofotométricos (absorbância, reflectância, fluorescência, fosforescência e quimo/bioluminescência), calorimétricos, piezelétricos e de sensores não catalíticos, são exeqüíveis. Dessa maneira, a expansão da tecnologia de biossensores pode permitir o aumento potencial de suas aplicações em fase orgânica e seu uso certamente beneficiará áreas tais como a tecnologia de alimentos, diagnóstico clínico e o controle de contaminação de águas. Muito tem que ser realizado para o desenvolvimento desses novos biossensores para adequá-los a outros métodos de análise que não os eletroquímicos. Recentemente, Díaz-Garcia e Valencia-González127, revisaram o emprego de sensores ópticos em meio não-aquosos, ao passo que Wang e col.128 deram principal ênfase aos sensores eletroquímicos. A Tabela_9 reúne os transdutores mais utilizados e possíveis aplicações.

Apesar do amplo emprego de enzimas isoladas como componente biológico, preparações de células íntegras de microrganismos e de fontes vegetais e animais têm sido também propostas como elementos biocatalíticos dos biossensores. Tais materiais simplesmente mantêm a enzima de interesse em seu ambiente natural resultando em uma estabilização da atividade enzimática desejada137, sem sacrificar, em muitos casos, a sua seletividade.

Os biossensores de tecidos vegetais podem ser construídos pela retenção física de fatias muito finas do tecido na superfície de um elemento de detecção usando uma membrana porosa. Outra maneira de utilização desse material é a distribuição homogênea do tecido vegetal, picado, em reatores de geometria própria, para operarem em sistemas em fluxo138.

Diversos exemplos de aplicações recentes dos eletrodos enzimáticos em fase orgânica estão listados na Tabela_10.

Uma outra aplicação dos biossensores baseia-se na possibilidade do uso de mediadores insolúveis em solventes orgânicos (podem ser co-imobilizados com a enzima por adsorção) obtendo-se os chamados sensores sem reagentes. Schubert et al.130, exploraram a oxidação do íon hexacianoferrato(II) pelo peróxido de hidrogênio na presença de peroxidaseem vários solventes orgânicos. A forma oxidada desse íon era novamente reduzida em eletrodo de grafite em potencial próximo de zero permitindo assim a quantificação de peróxido de hidrogênio.

Recentemente, Stancik et al.149 desenvolveram um biossensor baseado em um eletrodo de Clark acoplado a uma camada biocatalítica contendo tirosinase.

Derivados da tiouréia foram detectados em hexano e o método mostrou-se altamente sensível com limites de detecção no intervalo de 13 - 181 nmol L-1, dependendo da estrutura do composto inibidor.

Há numerosas oportunidades do emprego de biossensores em fase orgânica em sistemas de análise em fluxo. Recentemente, em uma revisão, Wang e col.150 discutiram as vantagens de tal metodologia. Em tais sistemas, além dos benefícios já mencionados da enzimologia em meio não-aquoso, há rapidez na análise de amostras complexas sem a necessidade de pré-tratamentos, tornando-os atrativos para testes de controle de qualidade e de processos industriais.

Algumas aplicações recentes desses biossensores podem ser encontradas baseadas, principalmente, no uso de oxidases e desidrogenases (polifenoloxidases, álcool desidrogenasese peroxidases)151-155.

A utilização de tecidos vegetais como fonte de material enzimático para aplicações em meio orgânico também foi explorada pelos autores138. O mesocarpo fibroso do coco-da-baía (Cocus nucifera, L.)e frutas da palmeira-leque (Lataniasp) em meio orgânico apresentam excelente desempenho para a detecção de dihidroxifenóis, mas são altamente dependentes da quantidade de água ligada à enzima. Na figura 4-A são apresentados os picos e a respectiva curva de calibração, correspondentes à injeções de soluções contendo 1 x 10-4 M de catecol e concentrações crescentes de água. Um comportamento bastante linear (r = 0,997) é verificado em função do incremento percentual da quantidade de água, entre 0,1 e 0,8 % (v/v). O incremento do sinal torna-se menos pronunciado para quantidades maiores de água. Tais resultados permitem avaliar a quantidade de água contida em um solvente, que para o presente caso, a reta extrapolada indica a presença de 0,03% (v/v) de água na acetonitrila utilizada. A elevada reprodutibilidade do método pode ser verificado pela realização de injeções repetitivas de amostra. Para 44 injeções sucessivas de uma solução contendo 5 x 10-4 M de catecol e 0,7% (v/v) de água, respostas altamente repetitivas foram obtidas (C.V. = 0,65%) apesar de ocorrer uma pequena deriva da linha base. A alternância de amostras contendo respectivamente 0,1 e 0,8% de água, demonstra a notável adequação da atividade enzimática, em função do conteúdo de água, não havendo nenhum efeito de "memória" em relação às injeções anteriores, como pode ser visualizado na Figura_4-B.

Reatores com o mesocarpo fibroso do coco, utilizados em meio de acetonitrila, mostraram estabilidade muito superior àqueles mantidos em meio aquoso. O monitoramento indireto da água deverá ser utilizado para determinação de umidade de produtos com baixos teores de umidade. Estão em andamento experimentos utilizando tais tecidos, tanto em meio aquoso como em fase orgânica, visando a quantificação de inibidores enzimáticos.

Análises em bateladas Diversos pesquisadores26,123realizaram determinações em bateladas onde a enzima era diretamente introduzida em um meio não-aquoso e o produto formado monitorado pelo aparecimento de cor. Kazandjian et al.26 utilizaram colesterol oxidaseagregada com peroxidase(ambas as enzimas adsorvidas em superfícies de vidro poroso) com p-anisidina como substrato cromogênico, em diferentes solventes orgânicos, visando a análise de colesterol. Boeriu et al.123, dispersaram, homogeneamente, a peroxidaseem misturas de parafina solidificável contendo cromógeno (o ponto de fusão era selecionado pela variação desta composição) como um protótipo de um sensor para temperaturas abusivas aplicável a materiais alimentares, farmacêuticos e termo-sensíveis. Com o aumento da temperatura, alterava-se a fase do meio, diminuindo as barreiras difusionais, facilitando assim a catálise enzimática. Como resultado ocorria modificação de cor que era monitorada visualmente.

Reatores enzimáticos que operam em sistemas analíticos em fluxo Braco et al.156, foram os primeiros a realizar uma avaliação sistemática das possibilidades de implementação de sistemas analíticos em fluxo empregando solventes orgânicos. Esses autores adaptaram, para condições em fluxo, a análise para colesterol. Neste trabalho, a viabilidade de utilização de um reator bienzimático imobilizado não covalentemente para determinações em fluxo em meio anidro (tolueno) com detecção espectrofotométrica foi demonstrada, com a vantagem de apresentar ainda um notável melhoramento em relação ao sistema em batelada. Com esse sistema, os autores obtiveram respostas lineares de 1 x 10- 6 até 1,8 x 10-4 mol L-1 de colesterol, com uma freqüência analítica de 60 amostras por hora. Em adição, tais reatores puderam ser utilizados por até 4 meses, período muito superior ao alcançado em meio aquoso.