EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE Passiflora spp. PARA ANÁLISES PCR-RAPD
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
Normalmente, estudos de identificação e de caracterização da diversidade
genética das plantas, por meio de técnicas moleculares, envolvem a avaliação de
um grande número de indivíduos, necessitando-se de métodos rápidos e precisos
de extração de DNA. O co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos
secundários é o principal problema encontrado no isolamento e purificação de
DNA vegetal, podendo danificar o DNA e inibir a ação da enzima Taq polimerase.
As folhas das diversas espécies de Passiflorapossuem níveis variados de
alcalóides, estereóides, flavonóides, glicosídeos cianogênicos, gomas, taninos,
resinas e alguns ácidos (Duke, 1989) que podem comprometer a extração de DNA.
De modo geral, o protocolo de extração de DNA mais utilizado para as diferentes
espécies é o CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) padrão, ou CTAB com algumas
modificações e variações daquele descrito por Dellaporta et al. (1983). Para
extração de DNA de folhas do maracujazeiro, estes métodos são reportados,
respectivamente, por Otoni et al. (1995) e Fajardo et al. (1998). A diferença
básica entre esses protocolos está na composição do tampão de extração que,
normalmente, integra um agente tamponante para estabilizar o pH em torno de
8.0; um sal para dissociar as proteínas do DNA; um detergente para solubilizar
as membranas e auxiliar na inativação de algumas enzimas; e um inibidor de
DNAses para proteger o DNA (Bered, 1998).
Os detergentes devem romper as membranas celulares para que ocorra a liberação
do DNA. Dellaporta et al. (1983) usam SDS (dodecil sulfato de sódio) como
detergente, enquanto Doyle & Doyle (1991) usam o CTAB e Cheung et al.
(1993), o sarcosyl.
Protocolos extremamente simplificados como de Cheung et al. (1993) podem
fornecer DNAs parcialmente degradados ou contaminados que, apesar de
possibilitar amplificações PCR, podem comprometer a reprodutibilidade das
reações, resultando muitas vezes em falsos negativos (Romano, 1998).
Assim, este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar 3 métodos de
extração de DNA de folhas de plantas de várias espécies de Passiflora spp., de
forma a obter quantidade e qualidade de DNA suficiente para a realização da
técnica PCR-RAPD.
Foram avaliados 8 lotes de matrizes e 7 acessos integrantes da coleção de
Passifloraspp. do IAPAR (Tabela_1). As análises foram realizadas sobre 3
plantas por genótipo, instaladas em casa de vegetação, através de estaquia ou
enxertia, sob condições controladas de luminosidade, temperatura e umidade
relativa do ar.
A amostragem das folhas dos diferentes genótipos foi realizada invariavelmente
no mesmo estádio de desenvolvimento de plântula (primórdios foliares). As
folhas foram coletadas e acondicionadas em gelo para serem transportadas até o
laboratório. Foram avaliados três protocolos: Cheung et al., 1993, Tai &
Tanksley (1991) - Dellaporta modificado e Doyle & Doyle (1991). Todos os
protocolos foram testados partindo-se de amostras de tecido de folhas frescas
pesando 40 mg.
Método_de_Cheung_et_al. (1993) - modificado: 20 a 40 mg de peso frescos foram
colocados em tubos de microcentrífuga esterilizados e pulverizados no
homogeneizador elétrico com 160 ml de tampão de extração [200 mM Tris HCl (pH
8.0), 70 mM EDTA (pH 8.0), 2 M NaCl e 20 mM de Metabissulfito de Sódio]. Foram
adicionados 40 ml de solução de sarcosyl 5% e, após incubação a 60 ºC por uma
hora, centrifugou-se por 15 minutos a 18407 g. Foram adicionados 90 ml de
acetato de amônia (10 M) e 200 ml de isopropanol gelado, deixando-se em repouso
em temperatura ambiente por 15min. Centrifugou-se novamente por 15 min a 18407
g e lavou-se com etanol 70% gelado. Em seguida, descartou-se o etanol e secou-
se em estufa a 37 ºC por 15 min. O DNA foi ressuspendido em 50 ml de TE buffer
[10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] com RNAse (10 mg/ml).
Método_de_Tai_&_Tanksley_(1991) - modificado: 20 - 40 mg de peso frescos
foram colocados dentro de tubos de microcentrífuga esterilizados, contendo 400
ml/tubo do tampão de extração (Tris-HCl 1M + EDTA 0,5M + NaCl 5M + SDS 10% + Na
bissulfite)e incubou-se a 65 ºC em banho-maria por 15 min. Adicionaram-se 125
ml/tubo de acetato de potássio (5M), homogeneizando-se e deixando-se por 20min
no gelo. Centrifugou-se a 18407 g durante 5 min, e o sobrenadante foi
transferido para novos tubos de microcentrífuga. Foram adicionados 350 ml de
isopropanol gelado e, em seguida, homogeneizou-se delicadamente, deixando-se
repousar por 30min a TA. Centrifugou-se a 18407 g durante 5 min, o sobrenadante
foi descartado e o precipitado lavado com 50 ml de etanol 75% gelado.
Centrifugou-se a 18407 g por 1 min e eliminou-se o etanol. Os tubos foram
levados para secar na estufa a 37 ºC durante 20 min. Ressuspendeu-se o DNA em
50 ml/tubo de TE buffer (TRIS 10 mM EDTA 50 mM pH 8,). Após centrifugação a
18407 g durante 1min, transferiu-se o sobrenadante para novos tubos aos quais
foram adicionados 2 ml de RNAse a 2,5 mg/ml. Centrifugou-se rapidamente,
deixou-se repousar por 15min a TA, e o DNA foi precipitado com 3,5 ml de
acetato de sódio (10% do volume). Foram adicionados 165 ml/tubo de etanol 95%
gelado, e o DNA foi precipitado durante uma noite a ¾20 ºC. Centrifugou-se a
18407 g durante 5min, descartou-se o sobrenadante e lavou-se com 50 ml/tubo de
etanol 75% gelado. Centrifugou-se novamente por 3min a 18407 g, os tubos foram
levados para secar no exaustor por 15min ou em estufa a 37 ºC. Posteriormente,
o DNA foi ressuspendido em 50 ml de água esterilizada (ultrapura).
Método_de_Doyle_&_Doyle_(1991): 20 ¾ 40 mg de folhas frescas foram
homogeneizadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo 300 ml de tampão
de extração (2% CTAB, 1,4M NaCl, 0,2%, 2-mercaptoetanol, 20mM EDTA, 100 mM
Tris-HCl- pH 8,0). Após 30 min de incubação a 65 ºC, o material foi
centrifugado por 10 min a 11000 g, e o sobrenadante transferido para um novo
tubo, adicionando-se volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), após
suave homogeneização e centrifugação por 2 min a 11000 g, para separação das
fases. A fase superior foi transferida para um novo tubo, adicionando-se 2/3 do
volume de isopropanol gelado, permanecendo por 30 min em gelo. Em seguida,
centrifugou-se novamente por 15 min a 11000 g. Descartou-se o sobrenadante, e o
precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 70% gelado e deixado secar a TA. O
DNA foi ressuspendido em 50 ml de TE buffer (TRIS 10 mM EDTA 50 mM pH 8) e
estocado a ¾20ºC.
Para os três protocolos de extração, o DNA obtido foi quantificado em
fluorímetro (Dyna QuantTM200 ¾ Hoefer).Os resultados obtidos em ng/ml foram
transformados em ng/mg de tecido (peso fresco). Para a determinação da
qualidade do DNA, 1000 ng de cada amostra foram analisadas por meio de
eletroforese em gel de agarose a 0,8% (80 V) já corado com brometo de etídio,
visualizado em Ultravioleta (UV) e fotografado com equipamento EDAS 120 Kodak
Digital Science 1DTM.
Análises preliminares da técnica RAPD, conforme aquela descrita para alfafa por
Crochemore et al. (1996), utilizando-se do primer A04-Operon (AATCGGGCTG)
(Fajardo et al., 1998), foram realizadas apenas com o objetivo de ser mais um
parâmetro para a avaliação da qualidade do DNA extraído pelos 3 métodos.
A concentração média de DNA extraído das folhas de Passifloraspp. pelos três
métodos é apresentada na Figura_1. Observa-se que concentrações maiores foram
obtidas quando se utilizou o protocolo Tai & Tansley (1991), seguido por
Cheung et al. (1991) e Doyle & Doyle (1991). Os três métodos produziram
concentrações adequadas para análises PCR-RAPD. Estas concentrações encontram-
se entre 379 e 4205 ng/mg de tecido (peso fresco).
A qualidade do DNA pode ser observada em gel sob UV, tanto em concentrações de
1000 ng (Figura_2), como em fragmentos amplificados por RAPD, cuja concentração
de DNA utilizada para a reação foi de 25 ng/ml (Figuras_3). De modo geral, os
três métodos produziram DNA de boa qualidade para PCR-RAPD; no entanto, melhor
resolução foi observada no perfil RAPD quando o DNA foi extraído pelo método
Dellaporta (Figura_3).
O protocolo de Cheung et al. (1993) é o mais rápido de ser executado, enquanto
o protocolo de Doyle & Doyle (1991) é mais trabalhoso, necessitando de
maiores cuidados devido à volatilidade e toxicidade do 2-mercaptoetanol.
Enquanto no protocolo de Cheung et al.(1991) há apenas uma etapa para a
eliminação de impurezas, no protocolo Dellaporta modificado são sete as etapas
de purificação, o que nos leva a obter quantidades maiores de DNA.
Assim, com base nos resultados obtidos e nas condições em que se realizou o
presente estudo, conclui-se que os 3 métodos foram eficientes para a obtenção
de DNA de qualidade e em concentrações suficientes para a realização da técnica
PCR-RAPD. Sugere-se, no entanto, a preferência pela técnica de Dellaporta para
a extração de DNA de folhas do maracujazeiro, considerando-se a melhor
resolução apresentada no perfil RAPD produzido.
