AVALIAÇÃO DE PLANTAS MATRIZES DE ABACAXIZEIRO CULTIVAR SMOOTH CAYENNE
UTILIZANDO MARCADORES RAPD E PADRÕES ISOENZIMÁTICOS
INTRODUÇÃO
O Brasil situa-se como um dos maiores produtores mundiais de abacaxi, tendo
sido estimada em 1,7 milhão de toneladas a produção brasileira em 1999 ( FAO
2000).
Entre as cultivares de abacaxi mais cultivadas no Brasil, destacam-se Smooth
Cayenne (Cayenne) e Pérola (Pernambuco), sendo utilizadas para o mercado de
fruta fresca e pequena quantidade para exportação. Atualmente, a preferência
dos importadores, sobretudo da Europa e Estados Unidos, tem sido pela cultivar
Smooth Cayenne (Gorgatti et al., 1996).
Apesar da grande demanda no mercado mundial de frutas, o abacaxi ainda não
conseguiu destacar-se no cenário agrícola brasileiro, apresentando baixo
consumo " per capita" e pequena contribuição para a renda agrícola
(Cunha et al., 1994).
A falta de seleção de plantas matrizes para obtenção de mudas tem sido um fator
limitante para a cultura do abacaxi. Devido ao fato de ser uma planta propagada
vegetativamente, muitas lavouras são iniciadas sem nenhum critério de seleção,
inclusive com mudas contaminadas, o que tem contribuído para a disseminação de
pragas e doenças (Ruggiero et al., 1994).
A qualidade do material de plantio é fator decisivo para obtenção de lavouras
uniformes, de bom estado fitossanitário e altamente produtivas, onde a seleção
de plantas matrizes é de suma importância para o sucesso econômico da cultura,
resultando na melhoria genética com reflexos positivos sobre a produção de
abacaxi.
A seleção de plantas matrizes consiste em realizar, antes da colheita dos
frutos, uma inspeção no abacaxizal, marcando-se as plantas que apresentam o
maior número de caracteres desejáveis, para posterior multiplicação (Reinhardt,
1982). O procedimento de seleção de plantas é importante devido à taxa de
mutação que ocorre na lavoura, em torno de 6%, onde os indivíduos indesejáveis
são eliminados, além de contribuir para uma drástica redução da fusariose,
doença de maior importância econômica para a cultura no Brasil (Ruggiero et
al., 1999).
Através de observações de campo, verifica-se que existe uma considerável
variabilidade genética no material Smooth Cayenne atualmente cultivado no
Brasil, o que pode ser comprovado por uma simples caminhada em uma lavoura
comercial de abacaxi, onde são encontradas plantas com pedúnculo curto e longo,
folhas com e sem espinhos, fasciação, entre outros ( Ruggiero et al., 1999).
Este fato está em acordo com as observações realizadas por Collins (1960), que
considera a cultivar Smooth Cayenne como uma coleção de clones. No entanto,
para alguns pesquisadores brasileiros, a Smooth Cayenne é um material
homogêneo.
Muitos estudos realizados têm enfatizado aspectos à seleção individual de
características desejáveis em programas de melhoramento (Usberti Filho et al.,
1995). Técnicas isoenzimáticas como marcadores genéticos estão sendo utilizadas
com sucesso em plantas de abacaxi visando, principalmente, à identificação de
cultivares (Dewald et al., 1988) e estudos genéticos e taxonômicos (Dewald et
al.,1992; Aradhya et al., 1994), entre outros.
Outra forma de caracterização dos recursos biológicos pode ser realizada
através da amplificação de fragmentos de DNA amplificados ao acaso (RAPD). Esta
técnica, realizada através de PCR (reação em cadeia da polimerase), utiliza
"primers" decanucleotídios de seqüência arbitrária, o que tende a
produzir uma freqüência relativamente alta de polimorfismo por
"primer", sendo o método rápido e eficiente (Fairbanks et al., 1993).
Os " primers" de seqüência aleatória têm sido utilizados para
reproduzir segmentos de DNA genômico em várias espécies de plantas (Willians et
al., 1993), sendo útil no auxílio à pesquisa de caracterização de recursos
biológicos (Fairbanks et al.,1993).
Em abacaxi, as relações genéticas entre diferentes cultivares foram
determinadas através do RAPD por Ruas et al.(1995), os quais sugerem que esta
análise possa ser usada de maneira eficiente para caracterização de recursos
genéticos no gênero Ananas. E no caso da cultivar Smooth Cayenne, embora seja
constatada no campo uma variabilidade morfológica nas plantas, não existem
estudos, até o momento, sobre a variabilidade genética dentro desta cultivar.
Em vista disto, o presente estudo teve como objetivo avaliar padrões
genotípicos e similaridade dentro da cultivar Smooth Cayenne, empregando-se
marcadores bioquímicos e moleculares.
MATERIAL E MÉTODOS
Análise por marcadores RAPD
Foram coletadas amostras de folhas de 20 plantas adultas de abacaxizeiro
cultivar Smooth Cayenne, em área comercial existente na Fazenda Córrego dos
Bois, município de Canápolis ¾ MG. Para esta coleta, selecionaram-se plantas
com as seguintes características: ausência de espinhos nas folhas (excetuando-
se alguns espinhos rudimentares no ápice, típico da cultivar Smooth Cayenne);
"olho" dos frutos de aspecto achatado; ausência de fasciação;
pedúnculo curto e frutos cilíndricos com peso de aproximadamente 1,6 a 2,2kg.
Para a extração do DNA, foi utilizado o tecido da parte basal das folhas de
plantas de abacaxizeiro, baseada no método proposto por Saghai-Maroof et al.
(1984). A quantificação do DNA foi realizada em espectrofotômetro, medindo-se a
absorbância no comprimento de onda de 260 e 280nm. A reação de amplificação
constituiu-se de 30 ng de DNA genômico, tampão de PCR (GIBCO-BRL) 1X, MgCl2
1,5mM (GIBCO-BRL), 200mM de dNTPs, 1,0u de Taq DNA polimerase (GIBCO-BRL),
0,22mM de "primer", água milli Q filtrada q.s.p. 20mL. Os tubos foram
colocados em um aparelho termociclador (PTC-100 Programable Thermal Controler-
MJ Reserch, Inc.) e submetidos a um ciclo de: 92oC por 3 minutos, 47 ciclos à
92oC por 1 minuto, 36°C por 1 minuto e 45 segundos e 72oC por 2 minutos e,
finalmente, um ciclo 72oC durante 7 minutos (Ruas et al., 1995). O conjunto de
"primers" utilizados foram os produzidos pela Operon Tecnologies,
Inc. (Operon B-K) e os da University of British Columbia (RAPD Oligo Project) ¾
Biotechnology Laboratory. As amostras amplificadas foram submetidas à
eletroforese (100V- 1h30min) em gel de agarose a 1,5%, dissolvido em tampão TEB
[89 mM - ácido bórico, 89mM - Tris, 2,5mM - EDTA, contendo brometo de etídio
(5µg/mL) e H2O milli- Q]. Como padrão de peso molecular, foi utilizado
"ladder" de 1kb (GIBCO-BRL). A visualização dos resultados foi
realizada em equipamento de fotodocumentação (Gel Doc- 1000 - BioRad).
Com os dados obtidos, elaborou-se uma matriz binária, a qual foi analisada pelo
método de agrupamento hierárquico UPGMA - "Unweighted Pair Group Method
with Arithmetic Mean", através do programa SHAN do NTSYS ("Numeral
Taxonomy and Multivariate Analysis System"- Rohlf & Slice, 1992).
Empregou-se a análise do bandeamento produzido por cada "primer",
sendo conferido o parâmetro ausência ou presença de bandas, onde 1 indica a
presença de banda e zero a ausência de banda (0/1). Para o cálculo da matriz de
similaridade, foi utilizado o coeficiente de Jaccard.
Determinação de Padrões Isoenzimáticos
Para a extração das isoenzimas foi utilizado 1,0g de tecido da parte basal das
folhas de abacaxi de cada amostra, macerado com 1 mL de água milli-Q. Em
seguida, o macerado foi filtrado em gaze e o material recolhido foi
centrifugado a 5oC por 5 minutos a 17.949 x g para a retirada das impurezas.
Para cada 1mL de sobrenadante coletado, foi adicionado 2mL de glicerol 20%.
A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida 10%, utilizando-se do
sistema contínuo de tampão. Nesta técnica, foi utilizado o sistema mini Protean
(BioRad), aplicando-se um volume de 40mL do sobrenadante acrescido de glicerol
20% por canaleta. A solução-tampão utilizada nos eletrodos foi 0,0125M TRIS e
0,096M Glicina, pH 8,8. A eletroforese foi conduzida a 4oC por 7 horas a 50 V e
os géis foram preparados e revelados.
Foram analisados 15 sistemas isoenzimáticos, sendo eles: Álcool Desidrogenase
(ADH); Superóxido Dismutase (SOD); a-Esterase (EST); b-Esterase (EST);
Fructokinase (EK); Glicose 6-fosfato Desidrogenase (G6PD); NAD Glicose
Desidrogenase (GDH); Aldeído Oxidase (AO); Sorbitol Desidrogenase (SDH);
Glutamato Desidrogenase (GLD); 3-Hidroxibutirato Desidrogenase (HBDH ); Octanol
Desidrogenase (ODH), revelados segundo metodologia proposta por Pasteur et al.,
(1988); Peroxidase (PO) e Fosfoglicose Isomerase (PGI), segundo metodologia
proposta por Alfenas (1998); Arabinose Desidrogenase (ARADH), segundo Lemos
(1994).
Estimou-se o coeficiente de mobilidade (Rf) das bandas de interesse, sendo
utilizada a seguinte fórmula:
Rf = distância_percorrida_pela_isoenzima
distância percorrida pelo corante
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Marcadores RAPD
O emprego da técnica RAPD demonstrou a existência de diferença genética no
material em estudo. Dentre os 100 "primers" utilizados, 43
proporcionaram eficiência na amplificação das amostras (Tabela_1), onde se
obteve um total de 777 bandas polimórficas e 9 bandas monomórficas. Constatou-
se que 57 "primers" não amplificaram nenhuma das amostras, indicando
que estas não apresentam uma região de homologia com tais "primers" .
Os "primers" selecionados geraram um número apreciável de bandas,
onde apenas as bandas intensas foram analisadas. Segundo Ferreira &
Grattapaglia (1996), a maior ou menor intensidade com que uma banda RAPD é
visualizada, é um reflexo direto do grau de competitividade do sítio no genoma,
ou seja, quanto mais competitivo o sítio, mais interpretável, reproduzível e
robusto será aquele marcador em ensaios sucessivos.
De um modo geral, podem-se observar padrões de bandas diferentes, indicando a
existência de variabilidade genética entre as matrizes utilizadas. Apesar de
estas plantas matrizes serem da mesma cultivar e apresentarem as mesmas
características fenotípicas, esta variabilidade genética pode estar relacionada
com o processo de propagação do abacaxizeiro, o qual é realizado
vegetativamente, onde as lavouras são formadas por mudas provenientes de várias
plantas, constituindo, desta forma, uma mistura de clones. Collins (1960)
salienta que a cultivar Smooth Cayenne é formada por uma coleção de clones, e
Lacoeuilhe (1982) considera esta cultivar uma família de clones em mistura.
Essa variabilidade genética pode ser visualizada através da Figura_1, onde se
observa um grande número de bandas polimórficas. Entretanto, encontrou-se
também bandas monomórficas (Figura_2), as quais estão relacionadas com as
características da variedade em estudo.
Ao analisar o dendrograma (Figura_3), verificou-se que as plantas estudadas
encontram-se reunidas em 2 grupos: A e B. No grupo B, encontram-se as plantas
matrizes 3 e 16, apresentando um grau de semelhança entre ambas de
aproximadamente 10%, sendo estas consideradas diferentes das demais plantas. No
grupo A, encontram-se o restante das plantas matrizes, divididas em vários
subgrupos, as quais apresentam diferentes graus de similaridade entre si,
variando de 12,4% a 26,8%. De um modo geral, pode-se observar que o grau de
similaridade entre as plantas é baixo, levando-se em consideração que estas são
da mesma variedade, confirmando-se a existência de variabilidade genética no
material Smooth Cayenne.
Determinação de Padrões Isoenzimáticos
Dentre os 15 sistemas isoenzimáticos analisados, a Glicose 6 fosfato
Desidrogenase (G6PD), Superoxide Dismutase (SOD) e a Glutamato Desidrogenase
(GDH) apresentaram atividade enzimática; Álcool Desidrogenase (ADH), Peroxidase
(PO), Fosfoglicose Isomerase (PGI) e a 3-Hidroxibutirato Desidrogenase (HBDH)
apresentaram baixa atividade; a e b Esterase (EST), Aldeído Oxidase (AO),
Sorbitol Desidrogenase (SDH ), Octanol Desidrogenase (ODH ), Arabinose
Desidrogenase (ARADH) e a NAD Glicose Desidrogenase (GDH), não sendo observada
atividade para estas enzimas.
Resultados semelhantes em relação à atividade enzimática foram encontrados por
De Wald et al. (1992) nos sistemas izoenzimáticos Superoxide Dismutase (SOD), a
e b Esterase (EST) e por Ballve et al. (1995) em relação à Glicose 6 fosfato
Desidrogenase (G6PD), a e b esterase (EST). Entretanto, Ballve et al. (1995)
não obtiveram atividade enzimática no sistema Glutamato Desidrogenase, enquanto
Dewald et al. (1992) e Aradya et al. (1994) obtiveram uma baixa atividade com a
Glicose 6 fosfato Desidrogenase, diferindo dos resultados obtidos. Este fato
pode estar relacionado com a idade da planta utilizada nas amostras para
extração das isoenzimas, uma vez que, em estádios diferentes de desenvolvimento
da planta, podem ocorrer diferenças na atividade enzimática (Ferreira &
Grattapaglia, 1996), onde folhas novas, completamente expandidas, de mudas
tendem a fornecer extratos de maior atividade enzimática que as folhas novas,
de plantas adultas (Alfenas,1998). Entretanto, neste trabalho, foram utilizadas
para extração das isoenzimas folhas de plantas adultas, em fase de colheita dos
frutos.
Em todos os sistemas isoenzimáticos que apresentaram atividade, não foi
possível verificar diferença entre as 20 matrizes utilizadas, pois estas não
apresentaram polimorfismo (Tabela_2). Como exemplo, pode-se observar, na Figura
4, o perfil isoenzimático da Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase, apresentando uma
banda monomórfica para todas as amostras com Rf=0,11.
Apenas no sistema Peroxidase (PO) a amostra de número 4 das plantas matrizes,
além da ocorrência de bandas monomórficas (Rf= 0,41 e Rf= 0,44), apresentou
outras diferentes com Rf= 0,58; 0,64; 0,66; 0,69 e 0,72, respectivamente
(Figura_5). Embora as condições ambientais, bem como a metodologia utilizada
para análise de padrões isoenzimáticos, tenham sido os mesmos para todas as
amostras, algum fator intrínseco desta planta levou à ocorrência de um
bandeamento diferente. Tal fato pode estar relacionado a um ataque de praga ou
doença, pois segundo Cordeiro & Sá (2000), o peróxido de hidrogênio é
formado nas etapas iniciais da resposta de defesa da planta.
CONCLUSÕES
1. A cultivar Smooth Cayenne pode ser considerada como uma coleção de clones em
mistura.
2. Através dos marcadores RAPD, comprovou-se a existência de elevada
variabilidade genética no material Smooth Cayenne cultivado no Brasil.
3. Em todos os sistemas isoenzimáticos utilizados, as amostras não diferiram
entre si, apresentando monomorfismo em todas as amostras de plantas matrizes.
