DESENVOLVIMENTO DE CALOS EM EXPLANTES DE CUPUAÇUZEIRO (Theobroma grandiflorum
Schum.) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AUXINAS E DO MEIO LÍQUIDO
DESENVOLVIMENTO DE CALOS EM EXPLANTES DE CUPUAÇUZEIRO (Theobroma grandiflorum
Schum.) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AUXINAS E DO MEIO LÍQUIDO 1
INTRODUÇÃO
O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma árvore frutífera, tipicamente
amazônica, pertencente à família das Sterculiaceas, que se encontra disseminada
por toda a bacia Amazônica, sendo esporadicamente encontrada em outros países
como a Colômbia, Venezuela, Equador e Costa Rica (Venturieri et al., 1985).
O maior valor da espécie está na polpa, que se encontra aderida às sementes, é
de cor branco-amarelada, sabor ácido e cheiro agradável característico, sendo
utilizada in natura ou na fabricação de néctar enlatado, sorvetes, licores,
compotas, geléias, iogurtes, etc (Calzavara et al., 1984; Venturieri et al.,
1985).
Certas espécies de plantas são recalcitrantes à obtenção de calos em quaisquer
tipos de explantes, sendo que algumas gramíneas e muitas espécies lenhosas só
produzem calos quando são empregadas doses altíssimas de auxinas no meio de
cultura (Damião Filho, 1995).
Singha (1982) observou aumento da disponibilidade e absorção de nutrientes
pelos explantes, quando estes foram colocados em meios líquido e semi-sólido.
Pierik (1987) afirmou que os melhores resultados obtidos nestes meios devem-se
à maior facilidade de absorção de nutrientes e reguladores de crescimento, e
também devido ao maior contato entre explante e meio, ao contrário de meios
mais sólidos, onde há somente contato basal. Os meios líquidos também permitem
melhor diluição de exsudatos oriundos do explante, evitando, desta forma, o
acúmulo de compostos tóxicos.
A literatura cita escassas contribuições à cultura do cupuaçuzeiro com
aplicações de técnicas biotecnológicas. Janick & Whipkey (1988) obtiveram
embriões somáticos de cupuaçu, a partir de calos, contudo não conseguiram
plântulas viáveis. É necessário incrementar as pesquisas básicas com esta
valiosa espécie do gênero Theobroma. Assim, este trabalho teve como objetivo
estudar o efeito da concentração de auxina e do meio líquido sobre o
desenvolvimento de calos de cupuaçu.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Biologia Celular do Núcleo
de Biologia Aplicada, pertencente à Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas-MG.
Foram utilizados como fonte de explantes, eixos embrionários e cotilédones,
obtidos de sementes de frutos imaturos de cupuaçu dos tipos Mamorana e Redondo.
O material foi adquirido junto ao Centro de Pesquisa da Lavoura Cacaueira
(CEPLAC), Itabuna, Bahia.
As sementes foram imersas em solução de 20% de hipoclorito de sódio, contendo 1
a 1,5 % de cloro ativo (alvejante comercial), durante 10 minutos, seguindo-se
três lavagens com água bidestilada. Em condições de câmara asséptica, com o
auxílio de bisturi, foram retirados os eixos embrionários das sementes e
divididos em três partes: região da plúmula, radícula e hipocótilo. Os
cotilédones foram segmentados em pedaços de 1,0 -1,5 cm. A seguir, esses
explantes foram esterilizados com solução Ao (antioxidante), contendo 10 ml de
solução Ao - composta de ácido ascórbico (15 mg/L), cisteína (40 mg/L) e AgNO3
(2 mg/L) - 30 ml de alvejante comercial, 60 ml de água destilada e 3 gotas de
Tween 20. Os explantes ficaram imersos nesta solução por 1 hora e,
posteriormente, foram imersos em solução de 9 ml LS (sais e vitaminas MS) + 1
ml de Ao por dez minutos.
Os explantes foram cultivados em placas de Petri descartáveis (90 x 15 cm) e as
culturas mantidas em sala de crescimento, com temperatura variando entre 24° C
e 28° C em condições de escuro, por 45 dias, até o aparecimento da massa
calosa.
Para cada condição, foram feitas 10 repetições empregando-se os seguintes
meios:
- Meio 1:sais MS(50%) (SIGMA) (2,15 g/L), acrescidos de tiamina (10 mg/L),
piridoxina (3 mg/L), ácido nicotínico (2 mg/L), inositol (99 mg/L), caseína
hidrolisada (500 mg/L), glicina (5 mg/L), cisteína (250 mg/L), PVP (5 g/L),
sacarose (60 g/L), água de coco (100 ml/L), 2,4-D (1; 2; 4; 8 mg/L), cinetina
(0,5 mg/L), gelrite (2,5 mg/L) e pH 5,3 antes da autoclavagem;
- Meio 2: sais N6 (SIGMA)(4 g/L), acrescidos de vitaminas N6(1000 x)(1 ml/L),
prolina (2,9 g/L), mio-inositol (100 mg/L), sacarose (20 g/L), caseína
hidrolisada (100 mg/L), 2,4-D (0; 2; 4 mg/L), ANA (0; 3; 5 mg/L), água de coco
(50 ml/L), phytagel (2,5 g/L) e pH 5,8 antes da autoclavagem. Após a
autoclavagem, foi adicionado AgNO3 (0,85 g/100 mL) e timentin (300 mg/L);
- Meio 3: igual ao meio anterior suplementado apenas com ANA (3 mg/L);
- Meio 4: sais MS (100%) (SIGMA) (4,30 g/L), acrescidos de vitaminas LS (1 ml/
L), sacarose (60 g/L), inositol (100 mg/L), ANA (1 mM), phytagel (3,0 g/L), pH
5,8 antes da autoclavagem.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após seis semanas, foram observados calos em segmentos de eixos embrionários no
meio 1, em todas as concentrações de 2,4-D testadas, com ênfase para a região
do hipocótilo, constatando-se ser esta a região mais facilmente ativada do eixo
embrionário de cupuaçu, apresentando maior calosidade. Explantes cultivados nas
concentrações menores de 2,4-D (1 e 2 mg/L) apresentaram calos com aspecto
branco e brilhante (Figura_1A,_B), enquanto aqueles cultivados nas maiores
concentrações (4 e 8 mg/L) apresentaram um aumento distinto de tamanho, boa
formação de calos brancos, com partes amareladas, aspecto gelatinoso, que
secaram após alguns subcultivos (Figura_1C,_D). Janick (1988) afirmou que altas
concentrações de 2,4-D mais água de coco estimulam a produção de calo e anulam
a indução de embrião.
Para segmentos cotiledonares, nas concentrações menores de 2,4-D, os explantes
ficaram cobertos por calos grandes, brancos e brilhantes (Figura_2A,_B), que
ficavam amarelados, enquanto, nas concentrações mais altas (4 e 8 mg/L), houve
apenas a formação de massa calosa branca, seguida de escurecimento (Figura_2C,
D).
Os calos foram subcultivados a cada 15 dias nestes meios e, após 8 semanas,
verificaram-se o escurecimento e a morte dos mesmos em todas as concentrações
empregadas, o que poderia ser atribuído à combinação de 2,4-D com água de coco.
Estes resultados concordam com os de Kononowicz et al. (1984), empregando
embriões zigóticos imaturos de cacau, que observaram escurecimento e morte dos
calos, em resposta à combinação de água de coco e 2,4-D acima de 2 mg/L.
O alto nível de sacarose empregado (6%), combinado com água de coco, também
pode ter deprimido a embriogênese somática de calos em cupuaçuzeiro. Sugerem-se
o emprego de concentrações menores de 2,4-D e estudos para verificar qual o
melhor nível de sacarose, na presença e ausência de água de coco, no processo
embriogênico deTheobroma grandiflorum.
Após seis semanas no meio 2, observaram-se a presença de raiz em segmentos de
hipocótilo, no meio sem regulador de crescimento, e calos em segmentos
radiculares (Figura_3A,_B). Estes efeitos podem ser devidos à presença de água
de coco no meio de cultura. Legrand et al. (1984) concluíram que a água de coco
favoreceu a rizogênese e calogênese em hipocótilo de plântulas de cacaueiro,
com emprego de meio básico, sem regulador de crescimento. Calos brancos
friáveis foram observados em todos os outros meios empregados, sendo estes mais
pronunciados também na região do hipocótilo. Os meios que continham apenas ANA
(3; 5 mg/L) apresentaram o maior número de raízes acompanhados de massa calosa
(Figura_3C,_D) enquanto os meios que continham ANA e 2,4-D (3; 2 mg/L)
apresentaram calos brancos e raízes (Figura_3E). Com cotilédones também houve
indução de calos, que escureceram e secaram, não sendo evidenciado nenhum calo
embriogênico nestes meios.
Os calos foram subcultivados a cada 15 dias nestes meios e, após um mês, foram
transferidos para meio líquido, sem regulador de crescimento, a fim de
estimular o aparecimento de estruturas embriogênicas. Adu-Ampomah et al. (1988)
obtiveram de 80% a 100% de melhoria no desenvolvimento de embriões somáticos
com o emprego de meio líquido. Figueira & Janick (1993) concluíram que a
pré-cultura de embriões somáticos em meio líquido é benéfica para o seu
desenvolvimento. Ranch (1993) afirmou que a maturação em meio líquido
facilitaria a pronta conversão de maior número de embriões somáticos. Castillo
et al. (1998) aumentaram a produtividade de embriões somáticos de Carica papaya
L., bem como reduziram o tempo necessário para a maturação do embrião,
cultivando calos embriogênicos em meio de maturação líquido.
As culturas foram dispostas em frascos Erlenmeyer, os quais foram mantidos sob
agitação contínua em agitador a 120 r/min, intercalando luz e escuro. Após 3
dias nestas condições, observou-se aumento de tamanho dos explantes, bem como
escurecimento dos mesmos. As culturas permaneceram 15 dias nestas condições,
sendo, em seguida, transferidas para um meio sólido, no caso o meio 3,
empregando-se 3 mg/L de ANA, com o objetivo de estimular o aparecimento de
estruturas embriogênicas. Apesar do escurecimento dos explantes, 3 semanas
após, observou-se o aparecimento de calos amarelos, com aspecto friável (Figura
4A,_B). Estes resultados também foram obtidos por Figueira & Janick (1993),
empregando tecido nucelar de cacau como explante.
As culturas foram mantidas nesse meio durante 5 semanas sendo, em seguida,
transferidas para um meio de regeneração, o meio 4. As culturas foram
subcultivadas a cada 7 dias neste meio e, após um mês, observou-se que os calos
permaneceram indiferenciados.
CONCLUSÕES
1. A região do hipocótilo do eixo embrionário da semente de cupuaçu apresentou
maior calosidade.
2. As maiores concentrações de 2,4-D (4 e 8 mg/L) promoveram bom
desenvolvimento de segmentos deeixos embrionários, acompanhados de calos
brancos.
3. O ácido naftaleno acético promoveu o aparecimento de raízes e formação de
massa calosa.
4. A combinação de ANA e 2,4-D (3; 2 mg/L) promoveu o aparecimento de raízes e
calos brancos em segmentos de hipocótilo.
5. A água de coco favoreceu a rizogênese e calogênese em meio sem reguladores.
6. O meio líquido favoreceu o aparecimento de calos friáveis.
