Produção de etileno e atividade da enzima ACCoxidase em frutos de maracujá-
amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.)
Produção de etileno e atividade da enzima ACCoxidase em frutos de maracujá-
amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.)1
Ethylene production and ACCoxidase activity in passion fruits (Passiflora
edulis f. flavicarpa Deg.)
Larissa Macedo WinklerI, 2; Marguerite QuoirinII, 3; Ricardo AyubIII, 4; César
RombaldiIV, 5; Jorge SilvaV, 6
IDr.ª, Departamento de Botânica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR
IIDr.ª, Prof.ª do Departamento de Botânica, Universidade Federal do Paraná
IIIDr. Prof. Universidade Estadual de Ponta Grossa, PR
IVProf.(s), Dr. (s), Laboratório de Biotecnologia de Alimentos,Universidade
Federal de Pelotas
VProf.(s), Dr. (s), Laboratório de Biotecnologia de Alimentos,Universidade
Federal de Pelotas
INTRODUÇÃO
Os frutos, em se tratando da produção de CO2, são classificados em dois grupos:
climatéricos e não-climatéricos. No processo de maturação dos frutos
climatéricos, ocorre um aumento significativo na taxa respiratória e na
produção de etileno. O maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.)
é um fruto climatérico (Kader et al., 1989).
O etileno é um gás, um hidrocarboneto (C2H4), que atua como fitormônio,
desempenhando um papel importante na regulação do processo deteriorativo
intrínseco da planta. Ele controla muitos estádios do desenvolvimento da
planta, tais como, maturação de frutos climatéricos, senescência de folhas e
flores. Sua síntese autocatalítica é fortemente estimulada por fatores
exógenos, como infecções fúngicas e/ou bacterianas, injúrias mecânicas,
estresses hídrico, térmico e salino, e também por outros fitormônios (Theologis
et al., 1992; Bouzayen et al., 1997; Zimmer, 1998).
A via de biossíntese do etileno foi descrita por Yang e Hoffman (1984). O
aminoácido metionina é o precursor biológico do etileno em todas as plantas
superiores, e é convertido em etileno pela via de biossíntese que compreende
dois passos com reações enzimáticas. Na primeira reação, o S-adenosil-metionina
(SAM) é convertido em ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) pela ação
da enzima ACC sintetase (ACCS). O ACC é então metabolizado pela enzima
ACCoxidase (ACCO), por uma reação de oxidação que necessita de O2 e ferro, e
que é ativada pelo CO2 para produzir etileno. Outra importante reação é o
chamado ciclo de Yang, que recupera o enxofre e ressintetiza o SAM. Em alguns
casos, o etileno regula sua própria produção, induzindo a uma nova síntese de
ACCS e ACCO. O ACC, precursor imediato do etileno, pode ser convertido ainda em
malonil-ACC sob a ação da enzima N-maloniltransferase (NMT) e então
transportado nessa forma para os vacúolos (Theologis et al., 1992; Grierson,
1998).
Ververides e John (1991) extraíram e determinaram a atividade da ACCO in vitro,
por uma analogia feita entre a ACCO e a enzima flavonona hidrolase. Métodos
indiretos de extração permitiram determinar que o O2, Fe++, CO2 e o ascorbato
são co-fatores da ACCO.
Visando a elucidar o processo de maturação dos frutos de maracujá-amarelo, o
presente trabalho teve como objetivo determinar a produção de etileno e a
atividade enzimática da ACCO em maracujá-amarelo colhido em três estádios de
maturação.
MATERIAL E MÉTODOS
O maracujá-amarelo foi analisado em um colorímetro (MINOLTA CORPORATION ®) a
fim de determinar, por meio da radiação ultravioleta, valores absolutos da cor
de cada um dos grupos, identificados pela numeração: I, II e II. Esta técnica
facilita a classificação dos frutos em relação ao estádio de maturação. Estes
estádios foram recentemente determinados pelo CEAGESP (Companhia de Entrepostos
e Armazéns Gerais de São Paulo). O grupo I caracteriza-se pelo fruto ainda
verde. O grupo II é um estádio intermediário, onde o fruto apresenta uma
coloração mais amarelada e aroma característico. Em relação ao grupo III, o
fruto já apresenta características de senescência, coloração amarela-
avermelhada intensa e aspectos de murcha. Três frutos de cada grupo,
provenientes da região de Pelotas-RS, foram analisados. Cada fruto foi marcado
em oito partes iguais, com auxílio de um pincel atômico, e a média destas
leituras resultou em um valor absoluto de cor. A variável luminosidade (L)
varia de zero (preto total) a 100 (branco total); é a opacidade da cor, ou
seja, quanto é mais escuro ou mais claro. A outra variável é designada como
"a", que varia de -200 (verde) até +200 (vermelho), "b" que varia de -200
(azul) a +200(amarelo).
Para a análise da produção de etileno, utilizou-se maracujá-amarelo colhido em
três estádios de maturação: I, II e III. A produção de etileno foi determinada
por cromatografia gasosa, em cromatógrafo Varian 3300. Três frutos de cada
grupo foram pesados e acondicionados em três baldes plásticos com capacidade
para 5L. Após 1 h, foi coletado 1 mL da atmosfera gasosa, com auxílio de uma
seringa hipodérmica, determinando-se a produção de etileno. Uma segunda leitura
foi realizada após 2 h. Os resultados foram expressos em nL. g-1. h-1.
A atividade enzimática da ACCO foi determinada através da produção de etileno
obtida após 1 h de incubação do suco dos frutos a 22ºC-25ºC. Foi utilizado um
fruto de cada grupo para a análise. Duas soluções foram utilizadas, o mix 1,
com 250 µL do extrato ACC; sulfato ferroso (FeSO4) 10 µM; ascorbato de sódio 30
mM; bicarbonato de sódio 30 mM, diluídos em tampão Tris-HCl 100 mM, para um
volume final de 20 mL. O mix 2, contendo as mesmas soluções, porém sem adição
do extrato de ACC, constituiu o primeiro controle da reação. O segundo controle
foi feito apenas com o extrato protéico dos frutos. Foram utilizados frascos
com capacidade para 10 mL. Para cada grupo, foram feitas três repetições com
ACC e três sem ACC (controle 1), mais uma repetição para o segundo controle. Em
cada frasco, foram adicionados 1 mL do mix e 1 mL do suco extraído da polpa dos
frutos. Os frascos foram mantidos sob agitação por 15 min em um agitador do
tipo orbital. Após este período, foi feita uma aeração com um aparelho
nebulizador. Os frascos foram novamente fechados e mantidos sob agitação por
uma hora. Em seguida, procedeu-se a coleta de 1 mL da atmosfera gasosa. A
produção de etileno foi expressa em nL.g (DUPPILLE et al., 1993).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os três frutos do grupo I foram identificados como sendo predominantemente
verdes, de acordo com os valores absolutos obtidos. Os frutos do segundo grupo
foram classificados como predominantemente coloridos, ou seja, em um estádio
intermediário da maturação, e os frutos do terceiro grupo foram identificados
como totalmente coloridos, apresentando-se, portanto, em início da senescência
(Tabela_1). Com base nestes resultados, foi realizada a avaliação da produção
de etileno.
A atividade da enzima ACCO, em maracujá predominantemente verde, mostrou-se
superior em relação aos frutos maduros. Maior produção de etileno foi
encontrada também para estes frutos, com um valor médio de 7,25 nL. g-1. h-1,
bem acima do nível máximo estabelecido para espécies classificadas como
fracamente produtoras de etileno (0,5 nL. g-1. h-1) (Abeles et al., 1992). Por
outro lado, nestes frutos, a adição de ACC (250 µM) ao extrato solúvel
triplicou a atividade da ACCO, que passou de 10,10 nL. g-1. h-1 para 37,84 nL.
g-1. h-1 indicando que a produção de etileno ainda é limitada pela concentração
de substrato e que os co-fatores sulfato ferroso, ascorbato de sódio e
bicarbonato de sódio foram necessários para a obtenção da atividade máxima da
enzima ACCO na reação (Tabela_2).
Com a obtenção destes resultados, foi possível determinar que o maracujá-
amarelo difere quanto à produção de etileno e atividade da enzima ACCO, de
acordo com o grupo de maturação. Todos os frutos climatéricos sintetizam
etileno no início da maturação e este fitormônio induz a expressão de genes
responsáveis pelos atributos qualitativos do fruto, cor, aroma e sabor,
fortemente representado neste estudo pelos grupos I, II e III. Alterações na
cor do fruto podem ocorrer pela perda de clorofila nos plastídios, manifestando
carotenóides amarelos, alaranjados ou vermelhos. Alterações na textura, como o
aspecto de murcha apresentado pelo fruto do grupo III, estão associadas com
alterações na parede celular, onde atuam enzimas como poligalacturonase,
celulase e galactanase, alterando a solubilidade e hidratação da parede
celular, caracterizando um estádio mais avançado de maturação e senescência
(GRIERSON, 1998). No presente estudo, o maracujá-amarelo foi considerado
produtor intermediário de etileno em comparação com outras espécies,
assemelhando-se a algumas cultivares de tomate, maçã, melão, pêssego, pêra,
ameixa, caqui e kiwi (ZIMMER, 1998). Outros estudos mostraram que existem
diferenças para a produção de etileno e atividade da ACCO entre espécies do
gênero Passiflora. Um estudo realizado com frutos de maracujá-roxo (P. edulis
Sims) mostrou que a produção de etileno (0,12 nmol etileno.g-1.h-1), conteúdo
de ACC e atividade da enzima ACCS foram baixos no estádio inicial de maturação
(grupo I). Estes resultados indicaram que esta espécie apresenta a mesma rota
de biossíntese de etileno de outros frutos climatéricos e que a atividade da
enzima ACCS é limitada. Por outro lado, a atividade da enzima ACCO encontrada
neste estudo foi elevada e superior à de outras espécies. Estes níveis elevados
resultam na produção de grandes quantidades de etileno durante a pós-colheita
de frutos (SHIOMI et al., 1996). Entre os fatores relacionados à pós-colheita,
o principal é a perda de água, fazendo com que a vida útil pós-colheita seja
muito variável, de no máximo uma semana em boas condições e uns 10 a 15 dias
com aspecto de murcho (grupo III), favorecendo muitas vezes o ataque de pragas
e doenças, além de diminuir a resistência ao transporte e armazenamento.
CONCLUSÃO
A espécie Passiflora edulis f. flavicarpa é considerada, em comparação com
outras espécies, produtora intermediária de etileno. A atividade enzimática da
ACCO é maior em frutos predominantemente verdes, classificados desta forma por
colorimetria, mas ela é limitada e necessita de co-fatores para sua atividade
máxima.
