Indução de calo a partir de eixo embrionário de coqueiro (Cocos nucifera L.)
PROPAGAÇÃO
Indução de calo a partir de eixo embrionário de coqueiro (Cocos nucifera L.)1
Callus induction from coconut embryogenic axis (Cocos nucifera L.)
Kicia Karinne Pereira GomesI, II; Virgínia Carla de OliveiraII, III; Ana da
Silva LedoII, IV; Paula Cristina da Silva ÂngeloII, V; Jefferson Luís da Silva
CostaII, VI
IBolsista PIBIC/CNPq, kicia@cpatc.embrapa.br
IIEmbrapa Tabuleiros Costeiros, CEP 49001-970 Aracaju-SE
IIIBolsista/AT-CNPq, vcarla@cpatc.embrapa.br, Tel.: (79) 226-1345
IVEng. Agr., D.Sc., Pesquisadora, analedo@cpatc.embrapa.br, Tel.: (79) 226-1318
VBiol., D.Sc., Pesquisadora, paula@cpaa.embrapa.br, Tel.: (92) 621-0419
VIEng. Agr., PhD, Pesquisador, Bolsista PQ do CNPq, jcosta@cpatc.embrapa.br,
Tel.: (79) 226-1359
INTRODUÇÃO
Apesar da importância do coco (Cocos nucifera L.) no cenário mundial, no Brasil
e no Nordeste, a sua produtividade ainda é extremamente baixa, sendo
ocasionada, principalmente, pelo uso de cultivares não selecionadas,
nutricionais, manejo inadequado de água e por problemas fitossanitários que
diminuem significativamente a área foliar, promovendo perdas de até 50% na
produção da cultura no País (Siqueira et al., 1995).
As técnicas de cultura de tecidos têm sido aplicadas de diferentes formas em
programas de melhoramento, na conservação e avaliação de germoplasma, aumento
da variabilidade genética para fins de seleção, na introgressão de genes de
interesse, para acelerar programas de melhoramento e na clonagem de genótipos.
Dentre todas as aplicações da cultura de tecidos de plantas, sem dúvida, as de
maior impacto são as de utilização no melhoramento genético de plantas e na
recuperação de plantas livres de vírus e outros agentes fitopatogênicos (Sá et
al., 2000).
A propagação clonal do coqueiro tem sido alvo de estudos nos últimos 20 anos
por organizações de pesquisa pública e privada. Essas pesquisas têm se
concentrado na obtenção de protocolos de multiplicação in vitro a partir da
embriogênese somática e organogênese, em todos os tipos de tecidos
meristemáticos e a partir da reversão floral (Branton & Blake, 1986;
Buffard-Morel et al., 1988; Verdeil et al., 1994; Blake & Hornung, 1995;
Hornung, 1995). A técnica de clonagem apresenta enorme importância prática por
produzir plantas mais uniformes, sadias e em uma velocidade muito maior do que
os métodos convencionais. Algum sucesso tem sido obtido com a cultura in vitro
de embriões zigóticos de coco, técnica que pode ser usada para conservação e
intercâmbio de germoplasma e para propagação de híbridos raros (Rillo &
Paloma, 1990).
A propagação vegetativa do coqueiro por meio de cultura de tecidos poderá
permitir significativos aumentos de produtividade pela multiplicação de
indivíduos produtivos, resistentes a doenças ou dotados de uma particular
capacidade de adaptação a condições adversas de ambiente (Pannetier &
Buffard-Morel, 1986).
Eeuwens (1978) verificou a influência da nutrição orgânica e dos reguladores de
crescimento nos explantes de tecido de inflorescência. Os resultados mostraram
que reguladores de crescimento, tais como o 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) e
ANA (ácido naftaleno acético), estimularam o crescimento dos tecidos apenas em
baixas concentrações e que sua presença em altas concentrações causou a morte
dos tecidos. Além do crescimento dos explantes, diferentes tipos de
proliferações foram obtidos, como formação de calo na parte superior de
explantes com caule, folhas e inflorescência (Eeuwens, 1976).Chan et al. (1998)
estabeleceram protocolo de regeneração de coco por embriogênese somática,
usando plúmulas de embriões zigóticos como explante, combinando reguladores de
crescimento, 2,4-D e BAP (6-benzilaminopurina), no meio de cultura.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de formação de calos a
partir de tecidos originários do eixo embrionário de embriões zigóticos de
coqueiro-Anão Verde de Jiqui em diferentes concentrações de 2,4-D.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados eixos embrionários obtidos a partir de embriões zigóticos
maduros de plantas de coqueiro-Anão Verde de Jiqui provenientes do Banco de
Germoplasma da Embrapa Tabuleiros Costeiros, localizado no Campo Experimental
do Betume, em Neópolis-SE. O experimento foi instalado em delineamento
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 5 (quatro concentrações de
2,4-D combinadas com cinco segmentos do eixo embrionário), com quatro
repetições, sendo cada parcela experimental composta por dez placas de Petri
com cinco segmentos cada.
Os eixos embrionários foram excisados longitudinalmente, dos embriões zigóticos
sem corte dos primórdios foliares, em câmara de fluxo laminar, com o auxílio de
um microscópio estereoscópio. Em seguida, foram submetidos à assepsia com
hipoclorito de sódio (0,2%), por dois minutos, lavados com água destilada
estéril, por três vezes, e imersos por dois minutos em solução de ácido cítrico
estéril (100 mg.L-1). Os eixos embrionários foram então seccionados em cinco
segmentos correspondentes às posições A (porção apical), B, C, D e E (porção
basal) (Figura_1), e transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura
Y3 (Eeuwens, 1976), suplementado com quatro concentrações de 2,4-D (10-4;
1,36x10-4; 3,62x10-4 e 4,52x10-4 M), sacarose (50 g.L-1), carvão ativado (2,5
g.L-1) e vitaminas de Morel & Wetmore (1951). As placas contendo os
explantes foram mantidas em sala de crescimento, com temperatura variando de 25
± 2º C, umidade relativa do ar média em torno de 70% e ausência total de luz.
Aos 15 e 30 dias após a inoculação, foi determinada a porcentagem de formação
de calo friável nos segmentos de eixo embrionário, nas quatro concentrações de
2,4-D. As médias foram submetidas à análise de variância e, quando
significativas, foram comparadas pelo teste de Tukey, a 1% de significância. Os
dados foram transformados em x +1.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se a formação de calos friáveis nos explantes originários do eixo
embrionário do coqueiro, nos 15 primeiros dias após a inoculação (Tabela_1).
Outros autores têm observado uma variação no tempo de início de formação de
calos, de 2 a 3 meses (Rillo, 1989), 6 meses (Verdeil et al., 1992) e 4 meses
(Verdeil et al., 1994) após a inoculação, em diferentes explantes. Dessa forma,
o fato de obter-se sucesso na formação de calos nesses tecidos em 1/4 a 1/6 do
tempo alcançado pelos autores mencionados, será de grande importância para o
estabelecimento de futuros protocolos de regeneração in vitro de coqueiro.
As concentrações mais baixas de 2,4-D (10-4 e 1,36x10-4 M) mostraram-se as mais
eficientes na indução de calos em tecidos originários de eixo embrionário do
coqueiro, não diferindo estatisticamente entre si (Tabela_1). Obtiveram-se uma
correlação negativa entre a concentração de 2,4-D e a formação de calos
friáveis (Figura_2). O explante C, na concentração de 3,62x10-4 M, não
desenvolveu calo durante o período de 15 e de 30 dias, porém apresentou 2,5% de
calogênese na concentração de 4,52x10-4 M, aos 30 dias de cultura. O explante
D, submetido a 2,4-D nas concentrações de 3,62x10-4 e 4,52x10-4 M, desenvolveu
baixa porcentagem de calos (12,5 % e 5%, respectivamente), aos 15 e 30 dias de
cultura. Estes resultados concordam com os obtidos por Eeuwens (1976), onde
auxinas (2,4-D e ANA) estimularam o crescimento dos tecidos apenas em baixas
concentrações (10-7 M) e que sua presença, em altas concentrações, no meio de
cultura, foi inibitória e causou a morte dos tecidos. Entretanto, Verdeil et
al. (1994) relataram o estabelecimento de calos embriogênicos e a regeneração
de plântulas, a partir de explantes de inflorescência imatura, obtendo a
formação dos calos, aos oito meses de cultura, sem subcultivo em níveis altos
de 2,4-D.
A interação tipo de segmento x concentração de 2,4-D foi altamente
significativa para a indução de calos. Aos 15 e 30 dias de inoculação, os
segmentos A, B e E apresentaram melhor resposta quanto à formação de calos. A
obtenção de maior calogênese nos segmentos A e B se deve, provavelmente, à sua
proximidade da zona meristemática do eixo embrionário, ou seja, nas partes
regenerativas competentes. Por outro lado, o desenvolvimento de calos no
segmento E deve-se à sua proximidade em relação ao haustório, constatado pela
aparência esponjosa do tecido característico. Nos segmentos C e D, não foi
observada a formação satisfatória de calos, nas concentrações testadas nos
períodos analisados, provavelmente, devido ao fato de terem sido seccionados da
parte intermediária do eixo embrionário, distante dos tecidos mencionados.
CONCLUSÕES
1) As concentrações de 2,4-D que melhor induzem a formação de calos, são as de
10-4 M e 1,36x10-4 M, em um espaço de tempo de 15 a 20 dias.
2) Forma-se calo aos 15 dias a partir de segmentos próximos à zona
meristemática do eixo embrionário.
3) Os segmentos do eixo embrionário seccionados nas posições A, B (regiões
apical do eixo embrionário) e E (região basal do eixo embrionário) apresentam
melhores resultados para calogênese nas concentrações analisadas.
