Home   |   Structure   |   Research   |   Resources   |   Members   |   Training   |   Activities   |   Contact

EN | PT

EuPTCVAg0254-02232013000100001

EuPTCVAg0254-02232013000100001

National varietyEu
Year2013
SourceScielo

Javascript seems to be turned off, or there was a communication error. Turn on Javascript for more display options.

Influência do método de extração do cinamono para controle da antracnose da videira

INTRODUÇÃO A antracnose da videira afeta todos os órgãos verdes da planta, desde folhas, gavinhas, ramos, inflorescência até os frutos. Os sintomas iniciais se manifestam por manchas foliares circulares, com margens marrons a negras e bordos redondos ou irregulares. Nas bagas aparecem manchas circulares de cor cinza no centro e preta nas bordas, comumente denominadas de olho-de- passarinho (Grigoletti Jr e Sônego, 1993).

Para o controle dessa doença, deve-se aliar a escolha do local adequado de plantio, com o uso de cultivares resistentes, material de propagação sadio, adubação equilibrada, manejo correto da cultura, eliminação de plantas ou partes vegetais doentes e o uso de fungicidas. Entretanto, o uso exclusivo de produtos químicos para o controle da antracnose tem gerado aumento dos custos de produção, dos riscos de intoxicação dos trabalhadores, da contaminação do ambiente e da seleção de patógenos resistentes (Naves et al., 2006).

Considerando a necessidade da redução ou a eliminação do uso de substâncias sintéticas que preconizam os sistemas sustentáveis de produção de frutas, a busca de novas alternativas para o controle de doenças é imprescindível. Nesse sentido, produtos naturais como extratos de plantas que apresentem substâncias antifúngicas, podem oferecer alternativas aos fungicidas sintéticos. De acordo com Hassanein et al. (2008) várias pesquisas com o cinamomo (Melia azedarach L.), árvore da família Meliaceae, têm sido realizadas devido às suas propriedades antifúngicas, bactericidas e inseticidas.

Abou-Jawdah et al. (2002) verificaram inibição da germinação de esporos de Verticillium dahliae, Fusarium oxysporium f. sp. melonis, Cladosporium spp., Botrytis cinerea, Alternaria solani e Penicillium sp. em 100, 95, 87, 84, 75 e 53%, respetivamente, ao utilizarem o extrato de cinamomo obtido com solvente de éter de petróleo. Posteriormente, Carpinella et al.(2003), verificaram por testes de crescimento micelial que extratos hexânico e etanólico de frutos, sementes e folhas de cinamomo demonstraram atividade fungistática contra Diaphorte phaseolorum var. meridionales, Fusarium oxysporum, F. solani, F.

verticillioides e Sclerotinia sclerotiorum. In vivo, através de teste de sanidade de sementes, o extrato aquoso de cinamomo apresentou toxicidade máxima, resultando em uma supressão completa do crescimento micelial dos fungos Aspergillus fumigatus e Penicillium spp. quando sementes de milho foram desinfestadas durante 20 minutos com o extrato (Shafique et al., 2005).

Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar, in vitro, o efeito de extrato de cinamomo, obtido por meio de diferentes metodologias, no crescimento micelial e esporulação de Elsinoe ampelina (de Bary) Shear e o efeito do extrato de cinamomo obtido por infusão no controle da antracnose da videira em condições de campo.

MATERIAL E MÉTODOS Frutos maduros de cinamomo com suas sementes foram coletados nos meses de abril e maio de 2010, no Campus Cedeteg da Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO), em Guarapuava/PR, e secos em estufa de ventilação forçada a 40 ºC, por 48 horas. Em seguida, foram triturados em moinho de facas e armazenados em sacos plásticos transparentes, durante quatro meses e em temperatura ambiente de 22 a 25 °C.

Experimentos in vitro Os experimentos in vitro seguiram o delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial [(6 x 6) + 2], com cinco repetições e parcela experimental constituída por uma placa de Petri. O fator principal constituiu-se das metodologias de preparo do extrato de cinamomo e o fator secundário das concentrações desses extratos, além de dois tratamentos padrões com calda bordalesa e mancozebe.

O fator primário constituiu-se das seguintes metodologias de preparo do cinamomo: 1) em meio BDA: adição de frutos e sementes secos e moídos ao meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) e posterior autoclavagem por 20 minutos a 120 °C e pressão de 1 atm; 2) Extrato aquoso em meio BDA: mistura de frutos com sementes secos e moídos à água destilada (1:10 m/v), seguido de manutenção da suspensão em repouso por 48 horas em recipiente fechado na presença de luz e filtragem com tecido fino (Bogorni, 2003), com posterior adição ao meio BDA antes da autoclavagem; 3) Extrato aquoso autoclavado: preparo semelhante à metodologia 2, com esterilização do extrato em autoclave separadamente, antes da adição ao meio BDA; 4) Extrato aquoso microfiltrado: o extrato aquoso de cinamomo foi esterilizado através da filtragem em membrana Millipore® 0,22 µm; 5) Extrato aquoso ' geladeira: preparo semelhante à metodologia 2, com suspensão em repouso por 24 horas no escuro e dentro da geladeira, seguido da filtragem com tecido fino (Seffrin et al., 2008); 6) Infusão: adição de frutos e sementes secos e moídos à água destilada fervente (1:10 m/v) em recipiente fechado por 15 minutos e filtragem (Rosal et al., 2009).

Alíquotas dos extratos da terceira, quarta, quinta e sexta metodologias foram adicionadas ao meio BDA fundente (Bastos e Albuquerque, 2004), enquanto as outras foram esterilizadas junto ao meio BDA, em autoclave.

O isolado de E. ampelina foi obtido a partir de folhas com lesões provenientes de vinhedos da região de Guarapuava-PR, o qual foi mantido em meio de cultura BDA. Após dez dias de crescimento das colônias do isolado do patógeno, discos de 5 mm de diâmetro foram retirados e colocados no centro de placas de Petri com meio BDA com os diferentes tratamentos, e incubadas em câmara de crescimento BOD a 25 ± 1 ºC, por oito dias, no escuro.

Para cada metodologia foram utilizados os seguintes tratamentos: 0, 10, 20, 30, 40 e 50 mL.L-1 de extrato de cinamomo, preparados a partir da solução padrão na proporção 1:10 (1g de de cinamomo em 9 mL de água destilada) para os extratos dois ao seis e, adicionados ( de cinamomo) conforme os tratamentos citados, diretamente ao meio BDA antes da autoclavagem para o extrato um, além de 80% de calda bordalesa na proporção 1:1:100 (sulfato de cobre:cal virgem: água) e mancozebe 2,5 g p.c..L-1 (Manzate® 800, fabricado por Du Pont do Brasil S.A.). As avaliações foram 48, 96 e 144 horas após a repicagem, por meio de duas medidas opostas do diâmetro do micélio com paquímetro digital.

Para a quantificação dos esporos, foram adicionados 10 mL de água destilada autoclavada, por placa de Petri, utilizando-se alça de Drigalski para espalhamento. Em seguida, raspou-se a superfície da colônia para a liberação dos esporos, obtendo-se a suspensão. Uma alíquota de 20 µL da suspensão foi colocada em câmara de Neubauer para determinar a concentração de esporos, ao microscópio ótico, estabelecendo-se uma média de quatro leituras (Carnaúba et al., 2007).

Os resultados foram submetidos à análise de variância e regressão polinomial ao nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2008).

Experimento em campo O experimento foi conduzido em Guarapuava, Paraná, de setembro a dezembro de 2010, em vinhedo comercial da cultivar Isabel enxertada sobre porta-enxerto 'Paulsen 1103', conduzido em sistema de espaldeira em espaçamento 2,5 x 2,0 m, com três anos de idade e manejado seguindo o sistema orgânico, onde utilizaram- se para o controle de doenças, nos três anos anteriores, quitosana, extratos aquosos de alho e cinamomo.

Para esse experimento optou-se pelo extrato aquoso de cinamomo obtido por infusão devido a sua eficiência no controle do míldio da videira (Plasmopara viticola (Berk. & M.A. Curtis) Berl & De Toni), conforme resultado de trabalhos preliminares, além de sua facilidade de obtenção pelo produtor.

Os tratamentos consistiram das diferentes concentrações do extrato de cinamomo (0, 10, 20, 30, 40 e 50 mL.L-1), com a adição de óleo mineral a 2,5 mL.L-1 (Natur' L Óleo®, Empresa Stoller do Brasil LTDA) como adjuvante, além da calda bordalesa e da testemunha absoluta somente com água. Por se tratar de um vinhedo orgânico, não foi possível utilizar o fungicida convencional mancozebe como padrão.

As pulverizações foram realizadas semanalmente, com pulverizador manual (P-1500 Brudden®, bico cone regulável), até o ponto de escorrimento, a partir do início da brotação em 21/09/2010, totalizando 15 aplicações. Com o início dos primeiros sintomas, em 26/10/2010, a severidade da antracnose foi avaliada em três folhas do ápice de quatro ramos por planta, previamente identificadas, utilizando-se a escala diagramática descrita por Azevedo (1997).

Com os dados da severidade foi determinada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), segundo Shaner e Finney (1977). No total foram realizadas oito avaliações no período de 26/10/2010 a 14/12/2010, com intervalos de sete dias. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso contendo oito tratamentos e cinco repetições, com parcela experimental constituída por uma planta.

Os resultados foram submetidos à análise de variância e quando significativo realizou-se a comparação de médias pelo teste de Tukey e análise de regressão polinomial ao nível de 5% probabilidade, através do programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimentos in vitro Para as variáveis, crescimento micelial e esporulação, houve interação significativa entre tipos e concentrações de extratos, constatando-se que os efeitos dos fatores são dependentes. Sendo que, no extrato aquoso microfiltrado, o crescimento micelial e a esporulação foram menores.

Em relação à inibição do crescimento micelial de E. ampelina, observou-se que houve efeito linear negativo das concentrações de cinamomo para todas as metodologias testadas (Figura_1).

Ao comparar as metodologias utilizadas, a maior inibição do crescimento micelial foi verificada para o extrato aquoso microfiltrado, enquanto que o pior desempenho foi observado para o extrato com em meio BDA. Os outros extratos apresentaram desempenho intermediário sobre a redução do crescimento micelial do fitopatógeno.

Chagas e Vieira (2007) explicaram que, às vezes, problemas em alcançar uma correlação linear entre a concentração e eficácia porque, em um extrato, as substâncias bioativas podem não ser distribuídas homogeneamente no interior do material, ou pode ser afetado por meio da técnica ou processo usado para produzir o extrato, o que possivelmente justificaria a baixa eficiência dos extratos com em meio BDA, por infusão, aquoso em meio BDA, aquoso autoclavado e aquoso - geladeira.

Porém, apesar da baixa inibição do crescimento micelial do patógeno gerada por alguns dos extratos de cinamomo utilizados neste trabalho, Carpinella et al.

(2005) afirmaram que o cinamomo possui atividade antifúngica, que se pela presença dos compostos escopoletina hidroxicumarina, vanilina, 4-hidroxi-3- metoxicinamaldeido e (±) pinoresinol, isolados de frutos maduros com sementes.

Adicionalmente, Jabeen et al. (2008) encontrou os seguintes compostos em extrato de folhas de cinamomo: β-amirina, ácido ursólico, ácido benzóico e 3,5- ácido benzóico dimetoxi.

Posteriormente, Yang et al. (2011) descreveram 79 compostos voláteis presentes em M. azedarach. Entre os 79 descobertos neste estudo, 64 compostos foram relatados pela primeira vez, e desses, muitos apresentam várias funções, como o ácido octanóico que é utilizado no tratamento de candidíase e infeções bacterianas.

Anteriormente, Carpinella et al. (1999) haviam demonstrado atividade fungistática e fungicida de extrato etanólico de frutos de cinamomo sobre Aspergillus flavus e Fusarium moniliforme, e Jabeen et al. (2008) relataram que o extrato de folhas de cinamomo suprimiu o crescimento in vitrode Ascochyta rabiei.

Em relação aos efeitos dos extratos testados, as melhores concentrações foram 40 e 50 mL.L-1, apresentando maiores reduções e diferindo-se da concentração de 10 mL.L-1 que se apresentou semelhante à testemunha (0 mL.L-1). Para a maior concentração testada (50 mL.L-1), o efeito do extrato aquoso microfiltrado não diferiu do efeito da calda bordalesa, ambos reduzindo o crescimento micelial do fitopatógeno em 99,27 e 99,23% quando comparados aos extratos com em meio BDA e por infusão, respetivamente, que apresentaram menor inibição (Figura_2A).

Resultados semelhantes em relação ao baixo desempenho, também foram obtidos por Zafar et al. (2002), que verificaram que o extrato aquoso de cinamomo foi desprovido de qualquer atividade antifúngica sobre vários microrganismos, assim como os extratos com em meio BDA e por infusão analisados neste trabalho. O mesmo ocorreu com Milanesi et al. (2009) que, ao analisarem o extrato de cinamomo incorporado ao meio BDA sobre o crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides, verificaram que o mesmo não se mostrou efetivo no controle.

Quando a variável tempo foi considerada, observou-se que a partir de 72 h de exposição ao extrato, houve estímulo no crescimento micelial do fitopatógeno.

Em relação à variável concentração (5, 10, 15, 20, 25 e 30%), todas as utilizadas estimularam o crescimento do fungo.

Do mesmo modo, o extrato hexânico de cinamomo demonstrou ação semelhante, apresentando propriedades antifúngicas fracas contra os microrganismos testados. Mesmo assim, o extrato hexânico ainda apresentou um efeito inibitório sobre Hyloflora ramosa (6,30 ± 0,84 mm), Aspergillus niger (5,28 ± 0,40 mm) e Fusarium chlamdosporum (5,28 ± 0,74 mm). Além disso, o extrato com clorofórmio de M. azedarach apresentou propriedade antifúngica apenas contra F.

chlamdosporum (6,60 ± 1,02 mm), e o extrato etanólico foi ativo apenas sobre H.

ramosa com uma zona de inibição de apenas 3,96 ± 0,53 mm, em comparação com o padrão de referência, em que a zona de inibição foi de 18,05 ± 1,72 mm (Zafar et al., 2002).

As concentrações de 30, 40 e 50 mL.L-1 de extrato aquoso microfiltrado reduziram o crescimento micelial em 82,2, 92,9 e 99,4%, respectivamente, as quais se igualaram a calda bordalesa e diferiram da testemunha. De acordo com Milanesi et al. (2006), resultados semelhantes foram verificados ao utilizar o extrato aquoso de cinamomo microfiltrado sobre o crescimento micelial de Fusarium solani, isolado da cultura da soja, em que as concentrações 3, 5, 7, 10, 15, 20 e 30% proporcionaram inibição do crescimento micelial entre 61 e 80%, sendo que a maior inibição foi verificada após 48 h de incubação.

Sobre a inibição da esporulação de E. ampelina, houve efeito quadrático das concentrações do extrato de cinamomo para todas as metodologias (Figura_3). As maiores reduções foram verificadas para o extrato aquoso microfiltrado, seguido do extrato aquoso autoclavado, provavelmente devido à maior extração dos compostos antifúngicos presentes nos frutos de cinamomo por meio da técnica ou processo usado para produzir esses extratos, como sugerido por Chagas e Vieira (2007).

Apesar das metodologias, extrato aquoso autoclavado, aquoso em meio BDA e infusão se igualarem quanto à redução do crescimento micelial do fitopatógeno.

O mesmo não foi observado em relação à esporulação, pois, apesar da baixa inibição de crescimento micelial, o extrato aquoso autoclavado reduziu em uma proporção muito maior a esporulação, se aproximando do melhor extrato (aquoso microfiltrado) e diferindo-se dos extratos que apresentaram um desempenho inferior, inclusive dos que se assemelharam quanto à inibição do crescimento micelial. Ou seja, apesar do extrato aquoso autoclavado não impedir o crescimento micelial do patógeno, reduziu significativamente a esporulação, atuando na disseminação e propagação do fungo em condições de campo, sugerindo- se uma boa alternativa de controle associada a outros métodos.

Além disso, neste trabalho, os efeitos de todas as concentrações do extrato aquoso microfiltrado não diferiram dos efeitos da calda bordalesa e do mancozebe, diferindo-se apenas do tratamento testemunha (0 mL.L-1). As reduções sobre a esporulação de E. ampelina com o extrato aquoso microfiltrado variaram de 77,6 a 100% desde a menor concentração (10 mL.L-1 ) até 50 mL.L-1 de extrato.

Sobre o extrato aquoso autoclavado, as concentrações de 20, 30, 40 e 50 mL.L- 1 não diferiram dos tratamentos padrões e reduziram em 43, 53, 59 e 51%, respectivamente. A concentração de 10 mL.L-1 se assemelhou ao tratamento com mancozebe e reduziu a esporulação do fitopatógeno em 40%. Todavia, apesar dos tratamentos 10, 20, 30 e 50 mL.L-1 de extrato não diferirem dos tratamentos padrões, também se assemelharam do tratamento testemunha.

Resultados inferiores foram verificados para o em meio BDA, infusão e extrato aquoso em meio BDA, que exibiram aumento de esporulação (Figura_2B), apesar do último não diferir do extrato aquoso autoclavado. Provavelmente, o baixo desempenho desses extratos sobre a esporulação do fungo é devido à rápida degradação das substâncias inibitórias do cinamomo, resultando na redução da atividade antifúngica do mesmo sobre os esporos de E. ampelina (Bavaresco, 2007).

Em conjunto, estes resultados mostram a variação da atividade antimicrobiana in vitropara diferentes extratos de cinamomo, isto é, devido a diferentes métodos de extração ou separação dos ingredientes ativos.

Experimento em campo Para os resultados de AACPD as concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50 mL.L-1 de extrato obtido por infusão apresentaram decréscimo de 51,0, 43,1, 57,6, 53,1 e 56,3%, respetivamente, em que todas as concentrações não diferiram estatisticamente dos tratamentos com calda bordalesa e óleo mineral (0 mL.L- 1 de extrato) - Figura_4.

Nesse caso, não se observou efeito aditivo do óleo vegetal ao extrato aquoso de cinamomo, como verificado por Leite (2010) quando utilizado como adjuvante ao extrato de alho sobre a severidade de doenças foliares em videira. Leite (2010) reduziu em 52% a AACPD do míldio da videira em relação à testemunha absoluta ao utilizar óleo vegetal a 2,5 mL.L-1, potencializando o extrato de alho.

Provavelmente, de acordo com os resultados obtidos neste trabalho, o óleo vegetal mascarou os efeitos do extrato de cinamomo, além de ser efetivo no controle da doença, quando aplicado separadamente. Outro fator sugere que a baixa ação do extrato pode ter ocorrido pelo uso de frutos maduros de cinamomo para o seu preparo pois, conforme Brunherotto e Vendramim (2001) sugerem, o extrato de frutos maduros de cinamomo apresenta efeito inferior ao de frutos verdes ou de folhas, devido à menor quantidade de ingredientes ativos, o que é coerente do ponto de vista de sobrevivência vegetal, uma vez que, nos frutos maduros, as sementes estão completando a sua maturidade fisiológica e, por isso, têm menor necessidade de defesa química contra herbívoros.

Porém, estudos de Xuan et al. (2005) apresentaram reduções das infeções causadas pelos patógenos Pyricularia grisea e Thanatephorus cucumeris em campos de arroz ao se aplicar extratos de cinamomo. Assim como Cogo et al. (2011), que ao pulverizarem extrato aquoso de folhas de cinamomo a 10% em plantas de café inoculadas com o fitopatógeno Cercospora caffeicola, obtiveram reduções na incidência da cercosporiose.

Cavoski et al. (2012), ao analisarem tratamentos com extrato aquoso de cinamomo nas proporções 1:5 e 1:10 (m/v) em plantas de pepino sobre o controle de nematoide Meloidogyne incognita, observaram reduções na atividade das enzimas antioxidantes catalase e peroxidase, além de desencadear a defesa do hospedeiro, sugerindo uma potencial indução de resistência gerada pelo extrato de cinamomo. Pereira (2006) explica que normalmente os indutores de resistência não atuam sobre o patógeno, contudo, em alguns casos, como provavelmente ocorreu no trabalho de Cavoski et al. (2012), os indutores podem atuar induzindo resistência e ao mesmo tempo afetar o patógeno diretamente, dependendo das dosagens utilizadas.

CONCLUSÕES A metodologia que obteve controle do crescimento micelial de Elsinoe ampelina foi o extrato aquoso de cinamomo microfiltrado, enquanto que para a esporulação tanto o extrato aquoso de cinamomo microfiltrado quanto o extrato aquoso autoclavado apresentaram reduções. As concentrações de 30, 40 e 50 mL.L-1 de extrato aquoso de cinamomo microfiltrado reduziram o crescimento micelial de E.

ampelina. A partir de 20 mL.L-1 de extrato aquoso de cinamomo microfiltrado houve inibição total da esporulação de E. ampelina. O óleo vegetal a 0,25% controlou a severidade da antracnose da videira em condições de campo, independentemente da adição de extrato de cinamomo, mascarando o seu efeito.


Download text