Resposta Fisiológica de Pinus spp. nas Primeiras Horas após Infecção com
Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Resposta Fisiológica de Pinus spp. nas Primeiras Horas após Infecção com
Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Carla Santos* e Marta Vasconcelos**
*Bolseira de Investigação
**Investigadora Auxiliar
CBQF ' Escola de Biotecnologia. Universidade Católica Portuguesa. Rua Dr.
António Bernardino de Almeida, 4200-072 PORTO
Sumário
O objectivo deste estudo consistiu na comparação da resposta à infecção com o
nemátode da madeira do pinheiro (NMP) Bursaphelenchus xylophilus entre Pinus
pinaster e Pinus pinea no estádio inicial da doença, três horas após
inoculação. O NMP é o agente causal da doença da madeira do pinheiro, tem em
Portugal como hospedeiro principal o pinheiro bravo, P. pinaster, e tem como
vector Monochamus galloprovincialis.
Actualmente, não há estudos que descrevam os efeitos da infecção do nemátode
nas plantas a um estádio inicial da doença e, no que diz respeito aos efeitos
fisiológicos e metabólicos nas plantas, verificou-se uma diminuição de 10,9% no
teor de água em P. pinaster (por comparação com árvores inoculadas com água) e
6,7% em P. pinea; relativamente à concentração de clorofilas, uma diminuição
para cerca de metade do valor controlo foi registado para ambas as espécies,
mas mais pronunciadamente em P. pinaster. Um estudo exploratório com
cromatografia gasosa também foi efectuado, que demonstrou que os compostos
voláteis produzidos permitem uma clara diferenciação entre espécies, mas não
entre inoculação controlo vs. nemátode.
Palavras-chave: Concentração de clorofilas; conteúdo de água; cromatografia
gasosa
Physiological Response of Pinus spp. In the First Hours After Infection with
Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Abstract
The purpose of this study was to compare the response to infection with the
pine wood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus between Pinus pinaster and
Pinus pinea at an initial stage of the disease, three hours after inoculation.
The PWN is the causal agent of pine wilt disease, in Portugal its main host is
the maritime pine, P. pinaster, and its vector is Monochamus galloprovincialis.
Currently there are no studies that describe the effects of nematode infection
in plants at an early stage of the disease and with regards to the
physiological and metabolic indicators of the disease response in the plants,
there was a decrease of 10.9% of water content in P. pinaster (compared with
trees inoculated with water) and 6.7% in P. pinea; in the study of total
chlorophyll concentration, a decrease to about half of the control value was
recorded for both species, but more pronounced in P. pinaster.
An exploratory study was also made with gas chromatography, which showed that
the volatile compounds produced were distinct between species, but not between
control vs. nematode-inoculated plants.
Key words: Chlorophyll concentration; water content; gas chromatography
Réponse Physiologique de Pinus spp. aux Premières Heures aprés l'Infection par
Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Résumé
Le but de cette étude était de comparer la réponse à l'infection par le
nématode du pin (NDP) Bursaphelenchus xylophilus entre Pinus pinaster et Pinus
pinea dans la phase initiale de la maladie, trois heures après l'inoculation.
Le NDP est l'agent causal de la maladie de dépérissement du pin, au Portugal
son hôte principal est le pin maritime, P. pinaster, et son vecteur Monochamus
galloprovincialis.
Actuellement, il n'existe pas d'études qui décrivent les effets de l'infection
par le nématode des plantes à un stade précoce de la maladie et en ce qui
concerne les indicateurs physiologiques et métaboliques chez les plantes, il ya
eu une diminution de la teneur en eau de 10,9% en P. pinaster (comparaison avec
les arbres inoculés avec de l'eau) et 6,7% en P. pinea; dans l'étude de la
concentration de chlorophylle totale, une diminution d'environ la moitié de la
valeur de commande a été enregistrée pour les deux espèces, mais plus prononcée
dans P. pinaster.
Une étude exploratoire a également été faite avec chromatographie en phase
gazeuse, qui a montré que les composés volatils produits permettent une nette
différenciation entre les espèces, mais pas entre le contrôle des plantes
contre les nématodes inoculés.
Mots clés: Concentration de chlorophylle; teneur en eau; chromatographie en
phase gazeuse
Introdução
O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner
and Buhrer, 1934) Nickle, 1970 é o agente causal da doença da madeira do
pinheiro (DMP) (NICKLE et al., 1981). O género, Bursaphelenchus Fuchs 1937
inclui quase 90 espécies e faz parte da Família Aphelenchoididae. Os nemátodes
que pertencem a este género podem ser micofágicos, parasitas de plantas, ou
ambos, sendo que B. xylophilus pertence à última categoria (ZHAO et al., 2008).
Esta doença mata, tipicamente, pinheiros com mais de 10 anos de idade em
períodos de tempo que podem ser entre poucas semanas a meses e, apesar de todos
os avanços alcançados nesta área, o mecanismo da doença ainda não foi
clarificado (ZHAO et al., 2008). No seu país nativo, EUA, o nemátode não é
considerado um agente patogénico, mas após a sua exportação, as consequências
foram massivas nas florestas mundiais, o que levou a um abalo grave na economia
de cada zona afectada (ZHAO et al., 2007).
Em Portugal, o NMP é transportado pelo vector Monochamus galloprovinciallis,
uma espécie endémica (NAVES et al., 2007), e o seu hospedeiro principal é P.
pinaster Ait. (MOTA et al., 1999). O pinheiro bravo é muito importante para a
economia portuguesa, na medida em que ocupa mais de um milhão de hectares das
florestas nacionais e vários estudos têm vindo a ser direccionados para o seu
melhoramento genético (AGUIAR et al. 2003; CORREIA et al. 2004). As espécies
Pinus sylvestris e Pinus halepensis também são possíveis hospedeiros do NMP,
porém a sua distribuição e abundância é limitada em Portugal (MOTA e VIEIRA,
2008). Estudos recentes, sob condições laboratoriais, demonstraram que as
populações portuguesas de M. galloprovincialis demonstram preferência por P.
sylvestris em relação a outras espécies de pinheiro (KOUTROUMPA et al., 2009).
Estas preferências alternativas podem eventualmente redireccionar o nemátode,
B. xylophilus, a infestar outros tipos de árvores, e é por isto que são
necessários mais estudos, dado que a flora portuguesa é tão diversa.
P. pinea é outra espécie de pinheiro importante em Portugal, dado que, na
natureza, não é afectada pela doença. Aparentemente, o vector não se alimenta,
nem coloniza estes pinheiros; no entanto, o nemátode é capaz de invadir,
multiplicar-se, infectar e matar esta árvore (ZHAO et al., 2008), apesar de
mais lentamente do que em P. pinaster (MOTA e VIEIRA, 2008).
Tendo em conta os riscos de dispersão da doença, foram desenvolvidos
regulamentos rigorosos para eliminar a peste, particularmente aquando da
importação de madeira e derivados (DWINELL, 1997). Após a detecção do nemátode
em pinheiro bravo português, foi desenvolvido e implementado o programa de
controlo "PROLUNP".
No que respeita à detecção visual da doença, durante os diferentes estádios de
infecção (desde o inicial ao avançado) os sintomas vão-se agravando e acabam
por resultar na morte do hospedeiro. Entre os principais sintomas encontra-se a
cessação de exsudação de resina nos caules, diminuição da fotossíntese,
degenerescência das células parenquimatosas e xilémicas, formação traumática de
canais de resina, produção de substâncias fitotóxicas, aumento da taxa
respiratória e da síntese de etileno (FUKUDA, 1997). Para além destes, o
sintoma mais crítico é o amarelecimento das agulhas, que aparece no estádio
mais tardio da infecção, até que a árvore fica castanha por completo, o que
acaba por complicar a detecção atempada da doença (GLEASON et al., 2000).
De acordo com RUTHERFORD et al. (1992), B. xylophilus move-se mais rapidamente
quando as temperaturas são elevadas, o que explica o desenvolvimento drástico
de sintomas durante o verão. Nestas condições, a árvore sofre stress hídrico e
a fotossíntese nas agulhas diminui, o que acelera o desenvolvimento dos
sintomas e conduz à morte das árvores infectadas (FUKUDA, 1997). Esta
diminuição do conteúdo de água, quer nos caules, quer nas agulhas, tem vindo a
ser estudada e ocorre usualmente pouco antes dos sintomas de infecção serem
visíveis em árvores inoculadas (TAN et al., 2005). Deste modo, o teor de água e
a sua retenção é considerado um factor de grande peso na patologia da doença do
nemátode da madeira do pinheiro (BOLLA et al., 1986) e o stress causado pelas
temperaturas elevadas é também um factor abiótico muito preponderante na
aceleração da morte do pinheiro, dado que promove a multiplicação de B.
xylophilus (SIKORA e MALEK, 1991).
Os monoterpenos são um grupo de voláteis resultantes do metabolismo secundário
das árvores e têm um papel muito importante na mediação das interacções entre
planta e ambiente, podendo induzir respostas de defesa, que ajudam as plantas a
diferenciar entre danos causados por insectos e danos mecânicos (MATEUS et al.,
2010). Determinados voláteis são comummente activados nas vias biosintéticas de
várias plantas, como o a-pineno (que estima-se fazer parte em 85% dos óleos
essenciais das pináceas), b-pineno, limoneno e mirceno (PROENÇA DA CUNHA, 2005)
e, quando infectadas, estas árvores emitem um conjunto característico de
compostos voláteis que atraem o vector Monochamus. Os óleos essenciais também
têm vindo a ser estudados como potenciais agentes de controlo contra a doença,
dado que alguns possuem actividade nematicida (KIM et al., 2008).
A cromatografia gasosa ' espectrofotometria de massa (GC-MS) é o método mais
frequentemente usado na identificação de voláteis, mas a sua aplicabilidade é
limitada, dado que os voláteis emitidos pelas árvores são altamente complexos,
o que dificulta a separação de todos os componentes (MATEUS et al., 2010). Na
maioria dos estudos, os voláteis têm vindo a ser isolados por destilação-
extracção simultânea (SDE), que inclui um solvente de extracção, que
frequentemente é co-eluído com picos menos retidos numa corrida de
cromatografia (SANTOS et al., 2006). Em alternativa, o método de microextracção
em fase gasosa de headspace (HS-SPME) tem vindo a ser implementado, dado que
dispensa a intervenção de solventes (Supleco, Bulletin 923A).
Crê-se que, à medida que a invasão do nemátode começa, uma resposta
hipersensitiva é activada, que resulta na libertação de fenólicos, síntese de
toxinas e fitoalexinas e na compartimentalização do xilema e outros tecidos,
seguido da inundação dos traqueídeos com oleoresina e substâncias tóxicas
(MYERS, 1988). Estudos recentes demonstram que estes mecanismos de defesa
contra agentes patogénicos ocorrem nas primeiras horas após infecção (BALDO et
al., 2010).
Neste trabalho foram realizados estudos sobre diferenças fenotípicas e
metabólicas entre pinheiro infectado e não-infectado das espécies P. pinea e P.
pinaster, a um ponto inicial da infecção, dado que é considerado que
imediatamente nas primeiras horas após infecção é activada uma resposta
hipersensitiva de defesa nas plantas.
Materiais e métodos
Material vegetal
As plantas utilizadas nestes estudos foram Pinus pinea e Pinus pinaster com
aproximadamente 1 ano de idade (com alturas de 50±5 cm), provenientes do
Viveiro Anadiplanta (Anadia, Aveiro; 40º26'27''N, 8º25'47''W). As árvores foram
transferidas dos recipientes para vasos com partes iguais de turfa negra (Siro
Plant) e vermiculite exfoliada e foram crescidas em ambiente controlado, numa
câmara fitoclima Aralab 10000EHF, com humidade relativa de 80% e um fotoperíodo
de 16h dia / 8h noite, com cerca de 490 mmol/m2s de intensidade luminosa. A
temperatura foi mantida a 24-26ºC durante o período de dia e a 19-20ºC durante
o período da noite.
Cultura de nemátodes
Pequenos quadrados com cerca de 1cm2 de Potato Dextrose Agar com Botrytis
cinerea, crescido a 26ºC por 7 dias, foram transferidos para 5 g de grãos de
cevada Seara®, previamente autoclavados em tubos de ensaio com 10 ml de água
desionizada. Estes tubos foram incubados nas mesmas condições anteriormente
descritas e seguidamente, pequenos pedaços de cevada com B. xylophilus isolado
geográfico HF (isolado da Região de Setúbal) crescido previamente, foram
colocados dentro dos tubos onde o fungo havia sido crescido. Os nemátodes
multiplicados foram extraídos pela técnica dos funis de Baermann (BAERMANN,
1917) antes da inoculação e, apenas nemátodes extraídos dentro de um período de
2h é que foram utilizados nas experiências subsequentes.
Inoculação e tempo de amostragem
Nos testes realizados, foram estabelecidos quatro tratamentos diferentes,
nomeadamente, árvores P. pinaster e árvores P. pinea selecionadas
aleatoriamente e inoculadas com B. xylophilus estirpe HF e árvores P. pinaster
e árvores P. pinea selecionadas aleatoriamente e inoculadas com água
desionizada (controlo). Para a determinação do conteúdo de água e extracção e
quantificação de clorofilas totais, foram utilizadas 30 réplicas biológicas;
para a análise dos compostos voláteis foram utilizadas 7 réplicas biológicas.
De acordo com a técnica descrita por FUTAI e FURUNO (1979), uma ferida de 3-
5 cm foi feita no caule da árvore com um bisturi a cerca de 40 cm acima do
nível do solo. Uma suspensão de 1000 nemátodes em 650 ml de água desionizada
foi inoculada nas feridas que, seguidamente, foram cobertas com parafilme para
evitar a secagem do inóculo e saída dos nemátodes. O mesmo procedimento foi
seguido para as árvores controlo, utilizando 650 ml de água desionizada.
Três horas após inoculação (3 hai), para cada amostra experimental, o caule
completo foi recolhido, cortado em pequenos pedaços e armazenado a -80ºC até
realização das análises futuras.
Determinação do conteúdo de água
Os caules de cada tratamento foram liofilizados por 72 h; o conteúdo em água e
a diminuição do conteúdo de água foram calculados como demonstrado por TAN et
al. (2005), pelas seguintes equações:
Conteúdo de água (%) = (peso da amostra fresca ' peso da amostra liofilizada) x
100 / peso da amostra fresca;
Diminuição do conteúdo de água (%) = (conteúdo de água da planta controlo '
conteúdo de água da planta inoculada) x100 / conteúdo de água da plana
controlo.
Extracção e quantificação das clorofilas totais
Seguiu-se o protocolo de ABADÍA et al. (1984), com algumas modificações. Foram
adicionados 12,5 ml duma solução de CaCO3 em metanol (4 g/L) a 0,5 g de agulhas
de pinheiro de cada amostra individual. Após um período de incubação de 48 h no
escuro, à temperatura ambiente, 1 ml da solução metanólica foi diluído em 25 ml
de água desionizada e a absorvância foi lida a 663 nm e 645 nm. A quantificação
espectrofotométrica de clorofilas foi calculada segundo a equação:
Análise de compostos voláteis
Foi realizada uma análise exploratória do padrão dos compostos voláteis com um
cromatógrafo de gás HP 5890A (Hewlett Packard, USA) equipado com um detector de
ionização por chama (GC-FID). A separação foi realizada numa coluna Stabilwax-
DA com 60m, 0.25mmID, 0.25µm (RESTEK), com hidrogénio como gás transportador, a
uma taxa de fluxo de 30 ml/min. A temperatura do forno foi inicialmente mantida
a 40ºC por 1 min e depois aumentada até 220ºC, numa taxa de 2ºC/min, a qual foi
mantida durante 10 min. O detector de ionização por chama foi também mantido a
220ºC.
Análise Estatística
As áreas relativas dos elementos presentes na fracção volátil da análise por CG
foram usadas para a análise de dados. O processamento destes dados foi
realizado com o programa PASW Statistics 18 (IBM, USA). Aos dados resultantes
da cromatografia gasosa, foi realizada uma análise de componentes principais
(PCA) que é uma análise estatística multivariada que permite a redução dos
dados ao explicar a variância existente entre os componentes principais, ou
seja, combinações lineares das variáveis. Deste modo, este tipo de análise
permitiu verificar se amostras correspondentes a determinado tratamento
produzem uma resposta suficientemente semelhante para se agruparem e se se cria
um padrão que as diferencie dos outros grupos (SUMNER et al., 2003).
Todas as outras análises e gráficos, respeitantes aos dados do conteúdo de água
e extracção de clorofilas, foram obtidos com Microsoft Excel e GraphPad
Software (La Jolla, USA). A normalidade dos dados foi confirmada e o teste
paramétrico t-student foi escolhido para comparar os grupos em estudo.
Resultados e discussão
Determinação do conteúdo de água
A infecção causada pelo nemátode bloqueia a condução da água e reduz a taxa de
transpiração (TAN et al., 2005). Três horas após a invasão com o nemátode, o
conteúdo de água do caule, quer em P. pinaster que em P. pinea diminuiu em
comparação com as árvores controlo (Figura 1).
Figura_1 ' Conteúdo de água do caule em P. pinaster inoculado com água (n) ou
B. xylophilus estirpe HF (p) e em P. pinea inoculado com água (l) ou B.
xylophilus estirpe HF (u). Cada valor representa a média ±desvio padrão.
Os resultados demonstraram uma diminuição do conteúdo da água de 10,9% após
inoculação com o nemátode em P. pinaster (p<0.05) e de 6,7% em P. pinea
(p>0.05), sendo que apenas as diferenças entre P. pinaster inoculado com
nemátode e controlo é que foram estatisticamente significativas. O P. pinea
como hospedeiro da DMP é ainda muito pouco estudado assim como o porquê desta
espécie parecer ter uma menor susceptibilidade ao nemátode (MOTA e VIEIRA,
2008). Mas estes resultados expressam uma clara diferença na resposta à
infecção com nemátode entre P. pinaster e P. pinea (p<0.05) o que pode indicar
que, no que se refere ao conteúdo de água nos caules, o pinheiro manso é menos
afectado do que o pinheiro bravo, o hospedeiro principal da doença em Portugal.
Isto pode sugerir, como denotado por FUTAI (2003), que a resistência de certas
espécies, como o P. taeda, pode ser parcialmente explicada por certos
repelentes hidrofílicos que fazem parte da madeira deste tipo de árvores, que
levam à agregação das espécies de Bursaphelenchus às substâncias hidrofóbicas,
enquanto a sua invasão nos tecidos hospedeiros são controlados por estas
referidas substâncias hidrofílicas.
O desenvolvimento dos sintomas a temperaturas elevadas depende do grau de
avanço da cavitação dos traqueídeos causada pela movimentação do nemátode
(RUTHERFORD et al., 1992). Os estudos de TAN et al. (2005) em pinheiro negro
japonês (P. thunbergii), com 3-4 anos de idade, foram conduzidos entre 5 e 70
dias após infecção (dai) e registaram uma diminuição percentual de 7,2% e
36,1%, a 10 e a 70 dai, respectivamente. Estudos prévios em P. sylvestris e P.
strobus com 20-30 anos (BOLLA et al., 1986) durante 3 meses, demonstraram que
estas alterações no conteúdo de água podem ser provocadas pelo bloqueio no
sistema de transporte de água das plantas, resultante da infecção com o
nemátode.
Considerando que este é um estudo nas primeiras horas após infecção, a
diminuição do conteúdo de água foi muito aguda e indica que há uma resposta
forte e imediata à infecção. Métodos para detectar a DMP no seu estádio inicial
são urgentes para evitar a disseminação entre árvores. Como demonstrado na
Figura_1, 3 horas após infecção (hai) os conteúdos de água em P. pinaster
diminuíram e pode revelar este sintoma como um possível indicador precoce para
uma árvore infectada.
Extracção e quantificação das clorofilas totais
A clorose em agulhas é um sintoma distintivo da fase avançada da DMP (FUKUDA,
1997). Na Figura 2 encontram-se os resultados da concentração de clorofilas em
P. pinaster e P. pinea, inoculados com nemátode e controlos.
Figura_2 ' Concentração das clorofilas totais de P. pinaster inoculado com água
(n) ou B. xylophilus estirpe HF (p) e de P. pinea inoculado com água (l) ou B.
xylophilus estirpe HF (u). Cada valor representa a média ± desvio padrão
Existe uma variação natural entre a pigmentação das agulhas de P. pinea e P.
pinaster, sendo mais escura em P. pinaster. Este facto está relacionado com a
maior concentração de clorofilas totais que foram extraídas desta espécie,
quando comparadas com P. pinea (p<0.0001).
Mais ainda, após infecção, a concentração de clorofilas diminuiu em ambas as
espécies, mais acentuadamente em P. pinaster. Visualmente, nenhuma alteração
foi identificada na cor das agulhas dos pinheiros após inoculação, mais
especificamente, nenhum indício de amarelecimento das agulhas foi detectado. No
entanto, como demontrado na Figura_2, após extracção, houve uma diferença
significativa nos níveis de clorofila entre pinheiros inoculados com nemátode e
os controlos, o que indica que logo 3 hai os níveis de clorofila começam
rapidamente a diminuir, de forma mais abrupta em P. pinaster. Estas diferenças
entre tratamentos na concentração de clorofilas totais foram estatisticamente
suportadas (p<0.0001) e demonstram que os valores obtidos não são um falso
positivo, provocado apenas pelas feridas realizadas para inocular as soluções.
Também as respostas entre espécies foram muito diferentes (p<0.0001).
Assim, estes resultados indicam que a diminuição da concentração de clorofila
nas agulhas dá-se num estádio precoce da doença. Deste modo, verificou-se que
os níveis de clorofila diminuem rapidamente nas primeiras horas pós infecção, o
que influencia os processos fotossintéticos e conduz à morte da árvore.
Análise de compostos voláteis
Os voláteis das plantas podem ser emitidos constitutivamente ou podem ser
induzidos sob determinadas condições ambientais e têm um papel importante na
mediação das interacções entre plantas e insectos herbívoros (MATEUS et al.,
2010).
Em estudos prévios (dados não publicados) sobre a expressão genética em P.
pinaster e P. pinea 3hai, foram isolados genes relacionados com a produção de
metabolitos secundários. Isto levou à utilização de cromatografia gasosa para
comparar os padrões dos voláteis emitidos por estas árvores inoculadas com água
ou nemátode, no mesmo tempo de amostragem acima referido. No sentido de
perceber o padrão das intercorrelações entre as variáveis em estudo
(agrupamento de amostras por espécie de pinheiro e/ou por tipo de tratamento),
foi conduzida uma análise estatística exploratória, usando a análise de
componentes principais (PCA) e o modelo resultou em dois factores principais
significativos, que explicaram 44,9% da variância nos dados, tal como
representado na Figura 3.
Figura 3 ' Análise dos padrões de voláteis de P. pinaster inoculado com água
(n) ou B. xylophilus estirpe HF (p) e de P. pinea inoculado com água (l) ou B.
xylophilus estirpe HF (u). Um total de 44,9% da variância dos dados foi
explicada por dois componentes principais significativos (24,6% da variância na
matriz X e 20,3% da variância na variável Y)
Dois grupos foram diferenciados, sendo que a maioria das amostras de P.
pinaster foram separadas das de P. pinea pelo factor discriminante com 20,3% de
peso na explicação da variância. O primeiro factor discriminante, com 24,6% de
peso, não resultou em nenhuma tendência pronunciada entre tratamentos (controlo
versus inoculação com nemátode).
SANTOS et al. (2006) realizaram análises de GC-MS de forma a verificar se seria
possível distinguir amostras de floema de P. halepensis, P. sylvestris, P.
pinaster e P. pinea provenientes da Serra da Lousã, de Alcácer do Sal e da
Serra da Ota, e concluíram, tal como no presente trabalho, que os padrões de
cada espécie são diferenciáveis e distintos. Adicionalmente, estudos de GCxGC
realizados em agulhas de 11 espécies diferentes de pinheiro adulto, localizados
em Portugal Central, resultaram numa discriminação das espécies e
caracterização química bem sucedidas (MATEUS et al., 2010). MUMM et al. (2003;
2004) analisaram também os voláteis produzidos após deposição de ovos ou
feridas mecânicas emitidos quer pelas agulhas de P. sylvestris com 35 a 45
anos, quer pelos ramos de P. nigra de 14 anos de idade, com GC-MS. Perceberam
que estes danos afectam significativamente a composição quantitativa da mistura
dos voláteis.
Estes resultados indicam que, apesar de ser possível fazer uma distinção clara
entre espécies, a produção de voláteis de novo em resposta à infecção com NMP,
3 hai, não produz um padrão diferenciável numa simples corrida de GC, apesar da
sua acção como agentes primários na defesa contra patogéneos.
Conclusões
Apesar das modificações fisiológicas analisadas serem normalmente associadas
aos estádios tardios da infecção, foi detectada uma tendência para a redução no
conteúdo da água e na concentração de clorofilas 3 h após infecção. Este
resultado é bastante revelador, dado que a infecção provocou danos quase de
imediato na árvore. Também se pode verificar que as respostas foram distintas
entre P. pinea e P. pinaster, o que é suportado pela diferença de
susceptibilidade entre espécies à doença, já demonstrado por FUTAI (2003) e que
pode estar relacionado com as relações filogenéticas dentro do seu género.
