Efeito da temperatura, pH e vestígios de Hg2+ e Pb2+ na actividade de
desidrogenases e urease num solo da região de Évora
INTRODUÇÃO
A qualidade do solo depende de propriedades físico-químicas e biológicas
relacionadas com a sua textura, composição, humidade, pH, microrganismos e
enzimas activos nele presentes, os quais podem ser influenciados pelo tipo de
culturas, mobilização do solo e aplicação de xenobióticos, como produtos
fitofarmacêuticos, poluentes de origem industrial, municipal ou outros. Os
enzimas do solo têm um papel relevante na libertação dos nutrientes necessários
ao crescimento microbiano e das plantas e na biotransformação de xenobióticos
(Dick, 1998). As actividades enzimáticas do solo podem resultar de células
activas (animais, plantas e microrganismos), células inteiras já mortas,
detritos celulares ou, ainda, de complexos enzima-argila ou colóides húmicos
(Taylor et al., 2002).
As actividades enzimáticas de desidrogenases (E.C. 1.1.1), fosfatases (EC
3.1.3.), arilsulfatase (EC. 3.1.6.1.), celulase (E.C. 3.2.1.4), β-glucosidase
(E.C. 3.2.1.21) e urease (E.C. 3.5.1.5) têm sido utilizadas, nalguns estudos,
como indicadores da qualidade do solo. Desidrogenases, por exemplo, são
enzimas endocelulares, presentes apenas nas células viáveis e a sua actividade
no solo está descrita como reflexo da actividade de microrganismos, incluindo
bactérias e fungos, pelo que é frequentemente utilizada como indicador do
metabolismo oxidativo microbiano em função do tipo, profundidade, conteúdo de
matéria orgânica e poluentes do solo (Camiña et al.1998; Trasar-Cepeda et al.,
2000; Monkiedje et al., 2002; Taylor et al., 2002; Sukul, 2006).
A urease é um enzima extracelular, também presente no interior das células,
responsável pela hidrólise da ureia no solo, com formação de ião amónio e
carbonato. A sua actividade está correlacionada com o processo de mineralização
do N no solo e a sua presença aqui é originada principalmente a partir de
plantas e microrganismos (Marzadori et al., 1998; Sinsabaugh et al., 2000).
A acumulação de metais pesados no solo em quantidades elevadas é um dos
factores de maior impacte nos seus processos bioquímicos. Alguns estudos
mostram que a presença de metais pesados inibe a actividade de diversos
enzimas do solo (Mora et al., 2005; Chaperon et al., 2007, 2008). O grau de
inibição das actividades enzimáticas do solo pelos metais pesados está
estreitamente correlacionado com o tipo de solo (Brady & Ray, 1999). Mora
et al.(2005) refere que solos contaminados com os metais As, Cd, Cu, Mn, Pb e
Zn apresentaram actividades enzimáticas de desidrogenases, arilsulfatase e β-
glucosidase muito baixas, as quais aumentaram após remediação in situ
(Sevilha, Espanha). Segundo Chaperon et al.(2007, 2008), a presença de Ag, Cu,
Pb, Zn e Hg influenciou as actividades de desidrogenases e da urease em solos
de floresta (Canadá), dependendo da concentração, da presença simultânea de
alguns destes metais e do tipo de solo.
Estudos de caracterização de actividades de desidrogenases e urease nos solos
de Portugal são muito escassos, pelo que foi objectivo do presente estudo
caracterizar a actividade enzimática de desidrogenases e da urease num solo da
região de Évora (Alentejo) e avaliar o efeito de Hg2+e Pb2+, nessas
actividades. A actividade de desidrogenases foi determinada pelo método de
vonMersi & Schinner (1991) modificado (Camiña et al., 1998) e a da urease
pelo método de Kandeler & Gerber (1988) modificado. As constantes
cinéticas, Km e Vmáx foram determinadas utilizando como substratos o p-
iodonitrotetrazolio (INT) e a ureia, para desidrogenases e urease,
respectivamente. Foi ainda avaliado o efeito da temperatura, pH e de vestígios
de Hg2+e Pb2+nas referidas actividades.
MATERIAL E MÉTODOS
Estudou-se um solo do sudoeste de Portugal situado em Évora, Alentejo
(38º36'N, 1º16'W) com cultura de olival (Olea europeaeL.) em pousio, sem
quaisquer tratamentos com pesticidas, adubos ou fertilizantes, durante os
últimos 10 anos. De acordo com a carta de solos 36 C dos Solos de Portugal,
trata-se de um solo litólico, não húmico de rochas eruptivas (Pmg) (Cardoso,
1974). As amostras foram recolhidas entre os 5 ' 15 cm de profundidade, secas
ao ar, crivadas por tamiz de malha < 2 mm e guardadas a 4ºC, para análise.
As principais características físicoquímicas do solo foram determinadas de
acordo com os métodos de referência para análises do solo (Carter, 1993;
Rowell, 1994). Os dados da textura foram obtidos por sedimentometria com raios
X (Sedigraph, 5100), corrigidos para o método da análise mecânica, sem
destruição de carbonatos. O azoto total foi determinado pelo método de
Kjeldahl, o azoto nítrico por potenciometria, utilizando um eléctrodo selectivo
de iões, e o fósforo pelo método espectrométrico de Egner-Riehm (Greenberg et
al., 1992). A capacidade de troca foi determinada pelo método do acetato de
amónio a pH = 7 (Rowell, 1994). O Ca2+foi quantificado por espectrometria de
absorção atómica em câmara de grafite e o Na+e K+por fotometria de emissão de
chama (Rowell, 1994).
A actividade de desidrogenases foi determinada em 1 g de solo (p.s.) pelo
método de vonMersi & Schinner (1991) modificado por Camiña et al.(1998),
utilizando como substrato o cloreto de 2-p-iodofenil-3-pnitrofenil-5-
feniltetrazolio (INT), que é convertido por desidrogenases em
iodonitrotetrazólio-formazão (INTF). Este foi extraído com uma mistura de
dimetilformamida e etanol, de modo a minimizar a adsorção do INTF aos minerais
do solo (Camiña et al., 1998) e quantificado a 490 nm (Taylor et al., 2002).
Foi efectuado um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adicionado o
substrato só após a adição da solução extractante.
A actividade da urease foi quantificada pelo método de Kandeler & Gerber
(1988) modificado, sendo o amónio libertado determinado pela reacção de
Berthelot, na qual o salicilato de sódio reage com o ácido dicloroisocianúrico,
na presença de nitroprussiato de sódio, formando um complexo esverdeado em
meio alcalino (Kandeler & Gerber, 1988; Taylor et al., 2002). Neste ensaio,
adicionou-se 1 g de solo (p.s.) a 0,5 mL de solução de ureia 720 mM e 4 mL de
solução tampão borato 75 mM, pH 10 e incubação a 37 ºC (b.a.) durante 2 horas,
sob agitação. A reacção foi terminada com a adição de 6mL de KCl/HCl pH ~ 2 e,
após 30 minutos, procedeu-se à leitura da absorvência a 690nm. Foi efectuado
um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adicionado o substrato só
após a adição da solução de KCl/HCl. Em todas as determinações enzimáticas,
foram efectuados 4 replicados.
O efeito da temperatura nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease
foi avaliado fazendo variar a temperatura de incubação do solo entre 20 -50 ºC
e o pH entre 6,5 e 12, respectivamente, com base em estudos prévios e nos
valores indicados na literatura para estes enzimas (Trevors, 1984; Kandeler
& Gerber, 1988; Subhani et al., 2001; Taylor et al., 2002).
As constantes cinéticas Km e Vmáx foram determinadas recorrendo à linearização
de Lineweaver-Burk, usando INT (0,25 -1,25 mM) ou ureia (80 ' 2560 mM) como
substrato, para as actividades de desidrogenases e urease, respectivamente.
Os efeitos do Hg2+e Pb2+nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease
do solo foram determinados adicionando à solução do solo, soluções de HgCl2
(0,2310,91 mM) e soluções de PbCl2 (0,14 10,91 mM). Nos ensaios em que se
observou um efeito inibitório, procedeu-se à determinação dos valores de IC50
(concentração que levou a uma diminuição de 50% na actividade enzimática, como
resposta dos microrganismos sensíveis ao respectivo metal).
Para avaliação do efeito do Hg2+e Pb2+nas actividades enzimáticas de
desidrogenases e urease, procedeu-se à análise de variância (ANOVA -One way)
para um intervalo de confiança de 95 % (P < 0,05), usando o programa SPSS®16.0
para Windows.
O efeito inibitório sobre as actividades de desidrogenases e urease provocado
por cada um dos metais em estudo foi determinado usando a correlação dose-
resposta para cada um dos metais adicionado ao solo. A Equação 1 foi utilizada
para cálculo da resposta da actividade enzimática (Greco et al., 1995)
em que A2 e A1 são, respectivamente, as respostas máxima e mínima dos enzimas
do solo obtidas com uma amostra controlo, p é o parâmetro de declive da curva
dose-resposta, X é a dose aplicada e log X0 é a concentração que corresponde a
50 % da actividade enzimática. Este modelo não linear foi ajustado utilizando o
Origin 7.1 (OriginLab®Corporation, 2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O Quadro 1, mostra que o solo apresentou uma textura franco-argilosa, com pH
6,0, baixos valores de condutividade eléctrica e de matéria orgânica, valores
estes que se encontram dentro dos limites referidos para um solo do tipo
litólico, não húmico de rochas eruptivas (Pmg), como foi o caso do solo em
estudo (Cardoso, 1974).
Quadro 1-Principais características do solo em estudo
Neste estudo, as actividades de desidrogenases e urease do solo, foram
determinadas a diferentes valores de temperatura, utilizando um valor de pH
de ensaio de 8,5 para desidrogenases e de 10,0 para a urease, valores estes
seleccionados tendo em conta estudos prévios e também o que se encontra
referido na literatura sobre o efeito do pH na actividade destes enzimas
(Trevors, 1984; Kandeler & Gerber, 1988).
Na Figura 1, estão representados os valores médio ± desvio-padrão da variação
das actividades de desidrogenases e urease no solo em função da temperatura
(Figura 1-A) e do pH (Figura 1-B).
Figura_1-Representação gráfica do efeito da temperatura (A) e do pH (B) nas
actividades de desidrogenases e urease no solo em estudo.
Os valores de temperatura para os quais se obteve a maior actividade de
desidrogenases e urease foram, respectivamente, de 40ºC e de 37ºC (Figura 1-
A). Estes valores estão muito próximos, no entanto, como se observa na referida
figura, o efeito da temperatura foi muito mais acentuado para a actividade da
urease do que para a actividade de desidrogenases, o que poderá significar
que, sendo a urease um enzima predominantemente extracelular, estará menos
protegido do que as desidrogenases face a alterações da temperatura ambiental
(Dick, 1998; Nannipieri et al., 2003).
Uma vez determinadas as temperaturas para as quais as actividades de
desidrogenases e urease foram máximas, procedeu-se a um estudo do efeito da
variação do pH sobre as actividades destes enzimas a essas temperaturas (40 ºC
e 37 ºC, respectivamente).
Os resultados deste estudo estão apresentados na Figura 1-B, mostrando que
estes enzimas apresentaram um perfil semelhante de variação da actividade em
função do pH do meio, o que poderá ser devido ao facto de, tanto nos
microrganismos (desidrogenases), como no solo (urease), existirem sistemas
tampão que moderam o impacte da variação do pH do meio na actividade destes
enzimas (Taylor et al., 2002).
Para a actividade de desidrogenases, o valor máximo foi obtido a pH 8,5,
enquanto que para a urease a actividade máxima foi obtida a pH 10,0, mostrando
que, no solo em estudo, a actividade destes enzimas face ao pH seguiu um padrão
de comportamento dentro do que está referido para estes enzimas (Dick, 1998;
Taylor et al., 2002).
Os parâmetros cinéticos das actividades de desidrogenases e urease foram
determinados a 40ºC, pH = 8,5 e 37 ºC, pH = 10, respectivamente. Para este
estudo foram usadas diferentes concentrações dos substratos ([S])
característicos destes enzimas e os correspondentes valores das velocidades
inicias de reacção (V). Os valores das constantes cinéticas, Km e Vmáx foram,
então, determinados recorrendo à equação de Lineweaver-Burk: 1/V = {(Km/Vmáx).
(1/[S]) + (1/Vmáx)}(Equação 2.), a qual usa o inverso da equação de Michaelis-
Menten (Tabatabay & Bremner, 1971). Na Figura 2, Vmáx corresponde ao valor
de 1/[S] =0 e Km ao valor de 1/V=0 da equação anterior.
Figura 2 -Representação gráfica de Lineweaver-Burk para determinação das
constantes cinéticas Km e Vmáx da reacção de desidrogenases (A) e urease (B) do
solo em estudo.
Os valores obtidos foram, para as desidrogenases, Km = 0,50 mM e Vmáx = 5,33
µmol min-1g-1e, para a urease, Km = 25,73 mM e Vmáx = 2,00x10-2µmol min-1g-1.
Utilizando a equação de Michaelis-Menten os valores obtidos para as constantes
cinéticas foram semelhantes (Km = 0,49 ± 0,17 mM; Vmáx = 5,31 ± 0,18 µmol min-
1g-1para a actividade de desidrogenases, e Km = 25,78 ± 0,27 mM; Vmáx =
2,00x10-2± 0,03x102µmol min-1g-1para a actividade da urease), o que mostra que
a equação de Lineweaver-Burk é aplicável neste caso.
Para as actividades de desidrogenases e urease, não se encontram descritos na
literatura estudos para este tipo de solos. Os resultados do presente estudo
mostram um valor de actividade de desidrogenases 102vezes mais elevado do que
os valores obtidos em outros tipos de solo. Tal diferença poderá ter-se devido
ao facto de no nosso estudo existir uma flora microbiana mais abundante do que
no caso descrito na literatura (Taylor et al.2002; Roldán et al, 2005), o que
não foi estudado em ambos os casos; termos utilizado um solo em pousio há 10
anos, pois a actividade de desidrogenases pode diminuir significativamente com
a frequência e profundidade da lavoura do solo (Roldán et al., 2005); termos
utilizado o INT, pois a maioria dos estudos publicados foram obtidos com TTC
(cloreto de 3,5trifeniltetrazónio) e com este substrato os resultados são
normalmente inferiores aos que se obtêm com INT (Trevors, 1984; Friedel et al.,
1994); ou, finalmente, termos usado uma mistura extractante constituída por
dimetilformamida/etanol, a qual permite quantificar valores mais elevados,
nomeadamente em solos com teores médios ou elevados de argila (Camiña et al.,
1998), como no solo que estudámos.
Relativamente à urease, os valores de actividade que obtivemos são da mesma
ordem de grandeza de alguns descritos por outros investigadores, embora estes
valores também sejam dependentes do tipo de solo, profundidade e vegetação
(Sinsabaugh et al., 2000; Taylor et al., 2002; Roldán et al., 2005).
A velocidade máxima, Vmáx, mede a quantidade máxima de substrato que é
transformado por uma quantidade fixa de enzima, por unidade de tempo, o que
nos permite determinar experimentalmente se uma determinada substância é capaz
de actuar modificando a actividade enzimática. Sabese que numerosas
substâncias com circulação ambiental são capazes de inibir a actividade de
desidrogenases, da urease e de outros enzimas, afectando os processos naturais
em que estes estão envolvidos e, consequentemente, a qualidade do solo.
No presente trabalho, depois de termos caracterizado as actividades de
desidrogenases e urease do solo em estudo, através da determinação do seu Vmáx
e Km, procedemos à avaliação do efeito de quantidades crescentes de Hg2+e
Pb2+sobre as actividades dos referidos enzimas, tendo em vista a determinação
da concentrações efectivas para as quais se obteria 50% de inibição dessa
actividade (IC50), parâmetro este que permite comparar o efeito deletério dos
xenobióticos sobre os microrganismos que lhes são sensíveis.
O efeito de Hg2+e Pb2+nas actividades de desidrogenases e da urease estão
ilustrados no Quadro 2., mostrando que o Hg2+diminuiu significativamente as
actividades de desidrogenases e urease (P < 0,05), enquanto que o Pb2+apenas
diminuiu significativamente a actividade da urease (P < 0,05).
Nos estudos em que se observou uma correlação dose-resposta significativa
(P<0,05), os valores de actividade foram analisados de acordo com a Equação 1,
referida anteriormente, tendo em vista o cálculo dos valores de IC50, e
construíramse as curvas dose-resposta das actividades de desidrogenases e
urease versusconcentrações de Hg2+ou Pb2+, como ilustrado na Figura 3.
Figura_3-Representação gráfica das curvas dose-resposta das actividades de
desidrogenases e urease sensíveis à presença de Hg2+e Pb2+.
A actividade de desidrogenases mostrouse sensível à presença de Hg2+, com um
valor de IC50 de 0,249 ± 0,018 mM, mas não se mostrou significativamente
sensível à presença de quantidades vestigiais de Pb2+(P > 0,05). Relativamente
à actividade da urease, para concentrações até 1,4 mM de Hg2+e 0,7 mM de Pb2+,
observou-se um efeito potenciador desta actividade. No entanto, para
concentrações mais elevadas destes metais observou-se uma diminuição da
actividade da urease, com valores de IC50 de 3,47 ± 0,17 mM e de 3,31 ± 0,45
mM, para o Hg2+e para o Pb2+, respectivamente.
Os estudos referidos na literatura que mais se aproximam do aqui descrito foram
efectuados por Chaperon & Sauvé (2007, 2008). Estes investigadores
utilizaram quantidades muito menores destes metais e outro tipo de solo com uma
ocupação diferente, tendo obtido valores de IC50 cerca de cem vezes inferiores
aos que obtivemos neste trabalho, o que pode querer significar que os enzimas
do solo que analisámos são muito mais estáveis à presença de Hg2+e Pb2+do que
no caso referido.
CONCLUSÕES
No trabalho que aqui apresentamos, diferentes concentrações de Hg2+e
Pb2+produziram, face a desidrogenases e urease, uma diminuição da actividade
enzimática, mas em nenhum caso se obteve uma inibição total das referidas
actividades. Isso mostra que num solo em pousio pode existir uma flora
resistente à acção do Hg2+e Pb2+. Além disso, observou-se que o Pb2+não inibiu
a actividade de desidrogenases, o que levanta a questão da flora microbiana do
solo estudado ou de pelo menos uma parte importante da mesma, poder vir a ter
interesse para beneficiar solos poluídos pelo Pb2+em que esta actividade seja
muito baixa. É neste sentido que os nossos estudos futuros se irão dirigir.
