Identificação e caracterização de Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) na
Região do Entre Douro e Minho (Portugal)
Introdução
A bactéria Pseudomonas syringaepv. actinidiae (Psa), agente causal do cancro
bacteriano da actinídea, foi isolada pela primeira vez em 1984 no Japão
(Takikawa et al., 1989). Desde então, e especialmente nos últimos anos, tem
manifestado elevada agressividade e uma dispersão muito rápida, tendo, nos dias
de hoje, distribuição generalizada nas principais regiões produtoras de kiwi,
incluindo Portugal (Balestra et al., 2010).
A produção de kiwi é uma importante atividade económica em diversos países,
sendo a China, a Itália e a Nova Zelândia os principais produtores mundiais
(FAOSTAT, 2014). Em Portugal, as principais regiões produtoras são o Entre
Douro e Minho e a Beira Litoral (European Commission, 2014). Em 2013, foram
produzidas 21306 t de kiwi no território nacional, das quais 16695 toneladas
foram produzidas apenas na zona Norte, tendo sido atingido um valor de 11212000
€ em exportações deste fruto (INE, 2014).
O cancro bacteriano da actinídea é considerado, atualmente, a maior causa de
perdas na produção de kiwi dado que diminui a produção dos pomares, pode levar
à morte das plantas e não são conhecidos métodos curativos (Abelleira et al.,
2014). Esta doença foi já responsável por perdas económicas importantes em
França, Espanha, Portugal, Chile, Coreia do Sul e Japão, mas principalmente em
Itália e na Nova Zelândia onde a produção de kiwi é bastante importante
(Scortichini et al., 2012). Tendo em vista a limitação da dispersão da doença,
a EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) adicionou em
2009, a doença na lista de alerta A2, lista que inclui os organismos
recomendados para regulação como organismos de quarentena (EPPO, 2012).
Entre os sintomas da doença (Figura_1), podem ser referidos especialmente a
produção de exsudados avermelhados ou esbranquiçados associados a cancros e
feridas, coloração vermelha-acastanhada por baixo da casca nos troncos e ramos
infetados, pintas e manchas necróticas angulares nas folhas, que podem ou não
apresentar um halo amarelo, necroses castanhas e abortamento de botões florais,
morte de rebentos e de plantas (Vanneste et al., 2011; Abelleira et al., 2014;
Moura, 2013).
Atualmente são conhecidas quatro populações de Psa (Psa1, Psa2, Psa3 e Psa4).
Estas populações estão presentes em diferentes países produtores de kiwi e têm
agressividades distintas (Quadro_1), causando prejuízos também distintos, pelo
que é importante conhecer a prevalência das populações de Psa numa região ou
país. As estirpes de Psa pertencentes à população Psa1 estão presentes no Japão
e em Itália (responsável pelo surto de Psa em 1992) e a sua virulência parece
variar com a região geográfica em que se encontra. Embora geneticamente as
estirpes isoladas nos dois países sejam muito semelhantes, no Japão causou
importantes perdas económicas, o que não aconteceu em Itália onde não provocou
grande impacto na produção de kiwi (Scortichini et al., 2012). Esta situação
pode sugerir que as condições climáticas ou as técnicas de produção utilizadas
nos dois países podem ter influência na agressividade com que a bactéria infeta
a planta (Scortichini et al., 2012).
As estirpes da população Psa2 encontram-se apenas na Coreia do Sul. A população
Psa3, a mais virulenta e responsável por perdas económicas importantes, está
oficialmente presente no Chile, China, Espanha, França, Itália, Portugal e Nova
Zelândia (Chapman et al., 2012). A população Psa4 caracteriza-se por causar
apenas sintomas nas folhas, não conduzindo à morte das plantas (Scortichini et
al., 2012; Cunty et al., 2014), tendo já sido isolada na Nova Zelândia,
Austrália e França, embora se pense que esteja presente em todos os países
produtores de kiwi da Europa (Cunty et al., 2014).
Este trabalho, realizado em 2013 e 2014, teve por objetivo identificar e
estudar a estrutura de populações de Psa na Região do Entre Douro e Minho
(EDM).
Material e Métodos
A partir de material vegetal com sintomas da doença proveniente de diferentes
pomares de Actinidia deliciosa, isolou-se o agente patogénico e realizou-se a
sua identificação, caracterização morfológica, fenotípica e de patogenicidade.
Obtenção da coleção e isolamento de Pseudomonas syringaepv. actinidiae
A obtenção da coleção de bactérias de Psa foi feita através da análise de
amostras de folhas, ramos, flores e caules evidenciando sintomas típicos da
doença, obtidas a partir de plantas masculinas e femininas de diferentes
cultivares de actinídea. As amostragens foram realizadas durante os anos de
2013 e 2014 em pomares de diferentes idades, localizados em vários concelhos da
região do EDM. Dos isolados obtidos, e considerando o ano do isolamento, a
cultivar, a localização geográfica dos pomares e a parte da planta utilizada,
foram selecionados para este estudo 23 isolados do EDM, descritos na Quadro_2.
Adicionalmente, incluíram-se neste estudo cinco estirpes de referência
descritas no Quadro_3. As estirpes CFBP 4909T e CFBP 7286 foram adquiridas na
coleção de culturas CFBP/CIRM (Collection Française de Bactéries associées aux
Plantes) e as estirpes K-Psa2, 10627 e 10880 foram cedidas por J. Vanneste.
Para o isolmento do patogéneo, foram selecionadas pequenas porções de tecidos
de folhas, ramos, caules ou flores, apresentando sintomas da doença. Os tecidos
foram desinfetados externamente com etanol a 95%, macerados em 5 mL de água
destilada esterilizada e, posteriormente, cerca de 50 µL da suspensão
bacteriana obtida foi inoculada em meio B de King modificado (Mohan e Shaad,
1987). As placas foram incubadas a 28ºC e observadas após 24, 48 e 72 horas de
incubação. As colónias que apresentaram morfologia idêntica à descrita para Psa
foram repicadas em meio B de King (King et al., 1954), até se obterem culturas
puras.
Caracterização morfológica e cultural
As características morfológicas e culturais das colónias foram analisadas após
48 horas do seu crescimento a 28ºC em meio B de King, no que respeita à sua
forma, consistência, tamanho, relevo, contornos das colónias, cor,
transparência, brilho e presença/ausência de pigmentos difusíveis. Na
caracterização da parede celular utilizou-se o método do KOH a 3% (Suslow,
1982), em alternativa ao método de coloração de Gram.
Caracterização Bioquímica dos isolados
Para a caracterização bioquímica dos isolados, foram efetuados os testes LOPAT
(Lelliott et al., 1966), produção de levana, oxidase, dihidrólise da arginina,
atividade pectinolítica e reação de hipersensibilidade em folhas de tabaco.
A análise da capacidade para a utilização de fontes de carbono (açúcares,
álcoois, aminoácidos e ácidos orgânicos), a determinação de propriedades
fisiológicas (sais, pH e tolerância ao ácido láctico), do poder redutor e da
sensibilidade química foi feita através do Sistema Biolog (Biolog, 2011). As
amostras foram analisadas utilizando microplacas “GEN III” inoculadas com o
fluido de inoculação “IF-A”, no qual se incorporou previamente uma suspensão
bacteriana, seguindo as recomendações do fabricante. As microplacas inoculadas
foram incubadas a 28ºC e a absorvância (590 nm) lida e registada após 24, 48 e
72 horas utilizando a Micro Estação ID System e o software MicroLogTM. Os
resultados obtidos foram analisados recorrendo ao software Past 3.04. A
comparação dos isolados bacterianos estudados utilizou o coeficiente de
Correlação (Bartko, 1966), e o método UPGMA (Unweigted Pair-Group Method using
arithmetic Averages) (Sneath e Sokal, 1973).
Caracterização dos ácidos gordos
Para a caracterização bacteriana utilizando a análise dos ácidos gordos seguiu-
se o método descrito por Stead (1992) para espécies de Pseudomonas. A
quantificação foi feita recorrendo a um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett
Packard 6890 e a identificação dos picos obtidos foi feita usando o Sistema
MIDI v. 4.5 (System for Microbiological Identification Sherlock(MIS;MIDI).
Identificação molecular dos isolados
A obtenção de ADN para a realização das amplificações por PCR foi feita
utilizando culturas bacterianas em meio B de King incubadas durante 48 horas a
28ºC. Prepararam-se suspensões bacterianas com uma concentração de 108 ufc.mL-
1 (DO600=0,5) numa solução de 10% de NaOH a 0,5M. As suspensões foram colocadas
a 95ºC durante 15 minutos, e de seguida colocadas no frigorífico a 4ºC até
utilização nas reações de amplificação.
A identificação das estirpes foi feita através de reações de PCR com o par de
primers Psa-F1/Psa-R2 (Rees-George, 2010) e de duplex-PCR com os dois pares de
primers KN-F/KN-R e AvrDdpx-F/AvrDdpx-R (Gallelli et al., 2011). Em cada reação
foi incluído um controlo negativo, em que o ADN foi substituído por água
ultrapura esterilizada, e controlos positivos utilizando ADN de estirpes de
referência de Psa. As amplificações obtidas por PCR e duplex-PCR foram
observadas através da eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão de TBE 0,5x
(Sambrook et al., 1989). Os produtos de amplificação foram corados por imersão
do gel numa solução “GelRed” (Biotium Inc.) e visualizados com luz ultra
violeta (Sambrook et al., 1989).
Análise de sequências repetitivas de ADN por BOX-PCR
Foi utilizado o primerBOXA1R, de acordo com o protocolo adaptado de Louws e
seus colaboradores (1994). Foram incluídas na análise da diversidade genética 5
estirpes representativas das 4 populações de Psa descritas no Quadro_3.
Foi também utilizado um controlo negativo, utilizando água ultra pura estéril
no lugar da suspensão bacteriana, de forma a garantir a ausência de
contaminações por ADN exógeno.
Caracterização da patogenicidade
A patogenicidade dos isolados foi testada em plantas de actinídea da cultivar
Haywardcom dois anos, durante o mês de Outubro de 2014. As plantas foram
inoculadas com dois isolados portugueses do EDM (P85 e VV12) com diferentes
origens geográficas, e com a estirpe italiana CFBP 7286. As culturas
bacterianas a inocular foram obtidas a partir de colónias puras, inoculadas em
meio B de King com 24 horas de crescimento a 28ºC. Para cada estirpe estudada,
inocularam-se 3 plantas (uma planta por vaso), pulverizando 5 folhas com uma
suspensão bacteriana (108 ufc.mL-1). Três plantas inoculados com água destilada
esterilizada, mantidos nas mesmas condições das plantas inoculadas,
constituíram o controlo negativo. As plantas foram observadas 15 dias e um mês
após inoculação e foram anotados os sintomas observados. A partir dos sintomas
observados nas folhas as bactérias foram reisoladas em laboratório seguindo o
procedimento descrito anteriormente.
Resultados e Discussão
Caracterização morfológica e cultural
As estirpes isoladas na região EDM apresentaram colónias com morfologia
bastante semelhante entre si, mostrando uma cor esbranquiçada com
transparência, lisas e margens circulares. A maior parte das colónias
apresentaram brilho e dimensões que variaram entre 4 e 6 mm de diâmetro. Apenas
uma estirpe (B65) apresentou características mucoides, dimensões superiores (7
a 8 mm de diâmetro) e uma aparência mais baça e amarelada. Relativamente à
formação de pigmentos fluorescentes visíveis sob luz ultravioleta (λ = 560 nm),
verificou-se que esta é uma característica variável entre as estirpes
estudadas.
Caracterização Bioquímica dos isolados
De acordo com a classificação das bactérias fitopatogénicas fluorescentes
proposta por Lelliott et al. (1966), todos os isolados estudados pertencem ao
grupo LOPAT Ia (Lelliott et al., 1966). O resultado da análise de 56
características fisiológicas e bioquímicas de 23 isolados do EDM e de duas
estirpes de referência (CFBP 4909 e CFBP 7286) testadas através do sistema
BIOLOG GEN III (Biolog, 2011) deu origem ao dendrograma apresentado na Figura
2.
Pode constatar-se que para um valor de similaridade de 0,972 se obtêm 2 fena e
3 estirpes não agrupadas. O fenon 1 agrupa 15 estirpes portuguesas e a estirpe
italiana CFBP 7286 pertencente à população Psa3. O fenon 2 agrupa 6 estirpes
portuguesas. As estirpes B65, AL14 e CFBP 4909T encontram-se isoladas.
As estirpes isoladas na Região EDM mostraram ser bioquímica e fisiologicamente
semelhantes à estirpe tipo de Psa CFBP 4909T e à estirpe italiana CFBP 7286.
Todas elas apresentaram a capacidade de utilizar sacarose, mio-inositol,
glicerol, L-alanina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-serina, ácido D-
glucónico, ácido D-glucurónico, ácido múcico, ácido quínico, ácido D-sacárico,
ácido cítrico, ácido D-málico, ácido L-málico, ácido gama-aminoburítico e ácido
acético. Estas apresentaram ainda sensibilidade química quando expostas a NaCl
8%, minociclina, cloreto de lítio, butirato de sódio e bromato de sódio. No
entanto, foi possível observar variabilidade fenotípica entre as estirpes de
Psa portuguesas através de substratos para os quais a sua capacidade de
utilização foi variável, tais como: α-D-glucose, D-manose, D-fucose, inosina,
D-sorbitol, D-manitol, D-arabitol, Mio-inositol, D-serina, ácido L-
piroglutâmico, pectina, ácido D-galacturonico, ácido D-glucurónico, metil-
piruvato, ácido bromo-succínico e ácido acetoacético.
Caracterização dos ácidos gordos
As estirpes estudadas apresentaram um perfil de ácidos gordos semelhante ao de
estirpes representantes da população Psa3 isoladas em Espanha, apresentando
índices de similaridade (IS) superiores a 0,700. As estirpes do EDM
apresentaram dois picos distintivos para os ácidos gordos 16:0 e Sum In Feature
3 (que corresponde aos ácidos gordos 16-1 w7c e/ou 16-1 w6c, que não são
possíveis de diferenciar através do sistema utilizado). A estirpe B65 foi uma
exceção, apresentando um perfil de ácidos gordos distinto e um IS inferior a
0,500.
Identificação molecular dos isolados
As estirpes portuguesas estudadas foram identificadas molecularmente pela
reação de PCR com os primers PsaF1/R2 (Rees-George, 2010), onde foi amplificado
o fragmento esperado de 280 pb (pares de bases) e pela reação de duplex-PCR,
com os 2 pares de primers KN-F/R e AvrDdpx-F/R, onde se verificou a
amplificação dos dois fragmentos esperados de 226 e 492 pb para 22 isolados do
EDM e para as estirpes de referência estudadas (Figura_3). Foi exceção a
estirpe B65, para a qual não se obtive amplificação destes fragmentos.
Análise de sequências repetitivas de ADN por BOX-PCR
A comparação dos padrões de fragmentos de ADN genómico amplificados com o
primer BOXA1R permite verificar que se obtiveram entre 15 e 20 bandas
polimórficas, com tamanhos que variaram entre 216 pb e 4038 pb. Da análise dos
padrões de fragmentos de ADN genómico amplificados, é possível verificar que as
quatro populações de Psa apresentam padrões diferentes entre si. As estirpes
representantes das populações Psa1 e Psa2 apresentam um perfil genético muito
idêntico, caracterizando-se pela presença de duas bandas distintivas de 300 e
700 pb, e uma banda adicional com cerca de 2500 pb na estirpe da população Psa2
(Figura_4), que as permite diferenciar das restantes populações de Psa. A
estirpe 10880 isolada na Nova Zelândia, pertencente à população Psa4,
distingue-se das restantes populações por apresentar 3 bandas, únicas desta
população, de 2100, 380 e 300 pb, e ainda pela ausência das bandas de 210 e
1000 pb.
Com exceção da estirpe B65, as estirpes isoladas no EDM, apresentam um perfil
BOX-PCR semelhante ao da estirpe italiana (CFBP 7286) e da Nova Zelândia
(10627) da população Psa3, o que permite caracterizá-las como pertencentes a
esta população. Este conjunto de estirpes distingue-se das estirpes das
restantes populações Psa1, Psa2 e Psa4 por apresentarem duas bandas adicionais
de 200 e 750 pb (Figura_4). No entanto, as estirpes CFBP 7286 e 10627
apresentam variabilidade genética entre si, pois a estirpe isolada na Nova
Zelândia é caracterizada pela presença de bandas com 300, 350 e 450 pb,
ausentes na estirpe italiana. A análise da diversidade genética obtida por BOX-
PCR evidencia igualmente a existência de variabilidade no interior da população
portuguesa de Psa da região EDM. As estirpes AL114b, AL116, Am63, F12 e F62
caracterizam-se por apresentarem bandas com 300, 350, 450, 2100, 2200, 2400 pb
e 2500 pb (dados não apresentados), que as restantes estirpes de Psa3 isoladas
em Portugal e em Itália não apresentam. A estirpe isolada na Nova Zelândia
apresenta apenas três (300, 350 e 450 pb) das sete bandas referidas.
A estirpe B65 apresenta um perfil BOX-PCR diferente de todas as outas estirpes
incluídas nesse estudo.
Caracterização da patogenicidade
Os resultados obtidos relativos à patogenicidade do conjunto de bactérias
testadas mostraram que todos os isolados foram patogénicos em actinídea. Os
sintomas causados pelas estirpes P85, VV112 e CFBP 7286 foram idênticos aos
previamente descritos por outros autores para Psa3 (Gallelli et al., 2011;
Vanneste et al., 2013). Os sintomas caracterizaram-se pela formação de manchas
necróticas rodeadas por halo amarelo nas folhas pulverizadas com a suspensão
bacteriana após 15 dias da inoculação. As caraterísticas dos isolados obtidos
após reisolamento foram idênticas às das bactérias inoculadas em folhas de
actinídea.
Conclusões
Com este estudo, foram caracterizadas 23 isolados obtidos de plantas de
actinídea com sintomas de cancro bacteriano na região de Entre Douro e Minho. A
caracterização através dos testes LOPAT, perfil de ácidos gordos, reação PCR
com os primers PsaF1/R2 (Rees-George et al., 2010) e reação de duplex PCR
(Gallelli et al., 2011), permitiu identificar 22 isolados como Psa. A análise
do perfil genético por BOX-PCR, mostrou que a população de Psa que prevalece
nesta região é a população Psa3, a mais virulenta e responsável pelo atual
surto da doença na Europa e na Nova Zelândia. O conjunto dos resultados obtidos
com a estirpe B65 não são conclusivos, tratando-se de uma estirpe atípica com
características que se aproximam das descritas para a População Psa4.
