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BrBRCVAg0100-29452001000300003

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National varietyBr
Year2001
SourceScielo

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CULTURA IN VITRO DE EMBRIÕES ZIGÓTICOS DE AÇAIZEIRO CULTURA IN VITRODE EMBRIÕES ZIGÓTICOS DE AÇAIZEIRO1

INTRODUÇÃO O açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) é uma palmeira tipicamente tropical e está distribuída geograficamente na América do Sul, principalmente no Brasil, nos Estados do Pará, Amazonas, Acre, Amapá e Maranhão (Kahn, 1997). É uma planta dominante em áreas de mata do estuário amazônico, fazendo parte da vegetação de terra firme, várzea e igapó, sendo mais comum em áreas de várzeas, onde chega a formar populações homogêneas (Jardim et al., 1995).

Dentre as diversas espécies nativas da região Amazônica, o açaizeiro destaca-se com grande potencial de exploração socioeconômico,visto quepode ser utilizado integralmente para a exploração econômica de frutos, palmito e celulose. De seus frutos, obtém-se um suco denominado de açaí, que tem grande aceitação no mercado regional e, atualmente, devido ao seu excelente valor nutritivo e calórico, vem conquistando os mercados nacional e internacional, sendo comercializado "in natura", como suco gelado, na fabricação de geléias, sorvetes e picolés (O Sabor..., 1992).

A propagação in vitro constitui-se numa ferramenta de grande importância para plantas com dificuldade de serem multiplicadas vegetativamente (Robles, 1983), como é o caso das palmeiras e, mais especificamente, do açaizeiro, onde o pegamento de perfilhos é menor que 1 %. Esta técnica tem despertado interesse por facilitar a produção de mudas de material elite em escala comercial, por produzir plantas livres de patógenos e acelerar programas de melhoramento que, no caso de palmeiras, são demorados e complexos em virtude do longo ciclo, hábito de crescimento e ausência de métodos convencionais de propagação vegetativa em virtude da ausência de câmbio vascular em monocotiledôneas.

Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a cultura de embriões, por tentar reproduzir in vitro o normal desenvolvimento de embriões, apresenta-se como uma ferramenta para o controle da embriogênese, o resgate de embriões interespecíficos, quando apresentam alguma incompatibilidade, a produção de haplóides, a quebra de dormência e a produção de plântulas assépticas, além de elucidar alguns problemas como nutrição do embrião no óvulo entre outras aplicações (Collins & Grosser, 1984; Hu & Ferreira, 1998).

Conforme relatado por Hu & Ferreira (1998), embriões excisados no estádio maduro ou próximo a este são quase autotróficos e, em geral, dependendo da espécie, não necessidade de suplementação de fonte de energia, podendo germinar e crescer num meio inorgânico, e os reguladores de crescimento tornam- se dispensáveis.

Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o efeito da adição de ANA e BAP no meio de cultura e estabelecer um protocolo para a conversão in vitro de embriões zigóticos de açaizeiro.

MATERIAL E MÉTODOS O estudo foi conduzido no Laboratório de Recursos Genéticos e Biotecnologia da Embrapa Amazônia Oriental, em Belém-Pará. Frutos maduros, obtidos da coleção de germoplasma de açaizeiro da Embrapa Amazônia Oriental e com peso médio de 2,35 g, foram lavados em água corrente e submetidos ao despolpamento em água a 40ºC.

As sementes foram desinfestadas em câmara de fluxo laminar, com a imersão em álcool etílico a 70 % por dois minutos e, em seguida, em solução de NaClO a 2 % por 20 minutos sob agitação e, posteriormente, foram lavadas quatro vezes em água destilada e autoclavada.

Os embriões zigóticos, excisados de sementes assépticas sob câmara de fluxo laminar, foram inicialmente inoculados, em tubos de ensaio contendo 10 mL de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), modificado pela ausência de vitaminas e aminoácidos, suplementado com 0,6 % de ágar e 0,25 % de carvão ativado. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 e, em seguida, submetido à esterilização autoclave a 120ºC durante 15 minutos.

As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 26º± 2ºC, umidade relativa do ar média em torno de 70 % e fotoperíodo de 16 horas de luz branca fria sob 52 µmol.m-2.s-1 de irradiância/ oito horas de escuro.

Aos três dias da inoculação, foi realizada a avaliação quanto às percentagens de contaminação por microorganismos e de oxidação. Em seguida, os embriões foram transferidos para tubos de ensaio com 10 mL de meio MS modificado pela presença de 0,17 g.L-1 de NaH2PO4, com 0,6 % de ágar, 0,25 % de carvão ativado e 3 % de sacarose, suplementado com diferentes combinações de ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP), ajustando-se o pH a 5,8 antes da autoclavagem.

Foram testadas três concentrações de ANA (0,54; 2,68 e 5,37 mM) combinadas com quatro de BAP (0,44; 1,11; 1,55 e 2,22 mM) e uma testemunha adicional (sem regulador de crescimento), perfazendo um total de 13 tratamentos.

O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições. Cada unidade experimental foi constituída de 10 tubos de ensaio, contendo um explante cada.

Aos 10 dias após a inoculação, avaliou-se a percentagem de conversão de embriões zigóticos em plântulas e, aos 48 dias, a percentagem de plântulas anormais, o comprimento da parte aérea (mm) e o número de raízes por plântula.

Como plântulas anormais, foram consideradas aquelas que apresentavam ausência ou crescimento atrofiado da parte aérea, do sistema radicular atrofiado e do haustório. As variáveis foram submetidas à análise de variância pelo teste F e as médias comparadas pelo agrupamento de Skott & Knott, em nível de 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Na primeira semana de cultura, observaram-se o intumescimento dos embriões zigóticos e o início da expansão da lâmina cotiledonar na região basal, estrutura correspondente ao haustório que, devido a sua atividade digestiva, substitui progressivamente o albúmen no processo de germinação. Os tecidos do cotiledonar apresentavam-se intumescidos e avermelhados. Aos 14 dias, foi observada a emissão da radícula e do coleóptilo cotiledonar a partir da região apical periférica. Na terceira semana, verificaram-se a formação do pecíolo a partir do coleóptilo, o início da expansão do limbo foliar e a emissão de raízes secundárias (Figura_1A). Nas plântulas normais, observou-se o rápido crescimento do haustório que, aos 60 dias, se apresentava com coloração branca e consistência esponjosa, sendo que, nas plântulas anormais se apresentava atrofiado (Figura_1B).

A análise de variância detectou efeitos significativos da interação "ANA x BAP" para o comprimento da parte aérea (P = 0,01) e do ANA para a percentagem de plântulas normais (P = 0,05) (Tabela_1).

O contraste "Fatorial vs Testemunha" (y = xF - xTe) foi significativo, sendo que os valores da estimativa do contraste para todas as variáveis avaliadas foram positivos (Tabela_1), ou seja, em média, os tratamentos constituídos da combinação de ANA e BAP foram superiores à testemunha.

Observa-se, na Figura_2A, que as maiores percentagens de conversão de embriões zigóticos e formação de plântulas normais foram verificadas, em média, em todos os tratamentos constituídos da presença de ANA e BAP quando comparado com a testemunha. Estes resultados concordam com Lemos et al. (1999), que observaram apenas 25 % de conversão de embriões de Euterpe oleracea Mart., com a formação de apenas 12,5 % de plântulas normais na ausência de ANA e BAP. Llano-Agudelo et al.(1995) obtiveram 85,7 % e 83,3 % de conversão de embriões zigóticos maduros de Persea americana Mill cv. Americana em meio MS suplementado com 0,3 mg.L-1de AIB e 1,0 mg.L-1 de KIN e 0,1 mg.L-1de AIB e 0,3 mg.L-1 de KIN, respectivamente. Entretanto, Yokoo et al. (1992) obtiveram a formação de plântulas completas, a partir de embriões zigóticos de Euterpe oleracea Mart. e do híbrido Euterpe oleracea x Euterpe edulis, em meio MS modificado na ausência de reguladores de crescimento.

Conforme Hu & Ferreira (1998), embriões excisados no estádio maduro ou próximo a este são quase autotróficos e, em geral, dependendo da espécie, não necessidade de suplementação de fonte de energia, e os reguladores de crescimento tornam-se dispensáveis. Entretanto, no presente trabalho, ficou evidenciada a necessidade de enriquecimento do meio com reguladores de crescimento considerando que, na ausência destes, obteve-se 55 % de conversão de embriões e a formação de 45,42 % de plântulas anormais (Figuras_2A e 2B).

Provavelmente, além da espécie e do estádio de desenvolvimento dos embriões, o nível endógeno de fitormônios nos explantes deve ser considerado na cultura de embriões.

As concentrações de 0,54 e 2,68 mM de ANA promoveram, em média, maior formação de plântulas normais quando comparado com o nível de 5,37 mM de ANA (Figura 2B). Elevadas concentrações de auxinas induzem, predominantemente, a formação de raízes em detrimento da formação da parte aérea, conforme relatado por Skoog & Miller (1957), podendo este fato ter contribuído para a maior conversão de embriões em plântulas anormais em elevada concentração de ANA.

O maior crescimento da parte aérea foi induzido pela presença de 2,68 mM de ANA, combinado com 1,11; 1,55 e 2,22 mM de BAP (Figura_2C). Em concentração elevada de ANA (5,37 mM), foi observado o menor desenvolvimento da parte aérea das plântulas em todas as combinações de BAP. Não foram verificadas diferenças significativas (P > 0,05) entre as concentrações de ANA e BAP para o número de raízes por plântula; entretanto, estes tratamentos apresentaram desempenho superior quando comparados à testemunha (Figura_2D).

CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos e nas condições em que o trabalho foi conduzido, pode-se concluir: 1 - É possível a conversão in vitro de embriões zigóticos, isolados de sementes maduras de açaizeiro, em plântulas completas e normais.

2 - A concentração de 2,68 mM de ANA, combinada com 1,11; 1,55 ou 2,22 mM de BAP, promove o melhor crescimento da parte aérea das plântulas.

3 - É necessária a presença de ANA e BAP no meio de cultura para a conversão de embriões zigóticos e para o crescimento inicial de plântulas cultivadas in vitro.


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