BrBRCVHe0004-28032006000300006

Estudo clínico-patológico, da proliferação celular e da apoptose no adenocarcinoma gástrico da cárdia

INTRODUÇÃO O câncer gástrico ainda é uma importante causa de mortalidade no mundo, embora sua incidência esteja em declínio nas últimas décadas. Representa a terceira neoplasia maligna mais freqüente no mundo e incide duas vezes mais em homens do que em mulheres. Cerca de dois terços dos casos ocorrem em países em desenvolvimento(27).

No Brasil, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) de 2005(11), representa o terceiro tipo de câncer mais letal nos homens e o quinto nas mulheres, com previsão de 11.145 óbitos, excluindo-se o câncer de pele não- melanoma. Nessa estatística, perde apenas para o câncer de mama feminina, pulmão, próstata, cólon e colo uterino.

No resto do mundo, dados estatísticos revelam maior incidência nos países como o Japão, China, países da América Central e Sul, Leste da Europa e, em menor grau, nos países como América do Norte, Norte da Europa, Austrália, Nova Zelândia e Índia(36).

Nas últimas décadas, tem ocorrido declínio na incidência do câncer gástrico, particularmente do terço distal do estômago, o que pode ser explicado pela redução na prevalência de fatores de risco, tais como mudança de hábitos alimentares, com aumento da ingesta de alimentos ricos em vitaminas A, C e E, como frutas e verduras frescas, concomitante à diminuição do consumo de sal e tratamento da gastrite crônica pelo Helicobacter pylori(38).

Por outro lado, particularmente no mundo ocidental, houve aumento da incidência do câncer do terço proximal do estômago. Alguns dados mostram prevalência maior no sexo masculino, forte associação com hérnia de hiato, refluxo gastroesofágico, esôfago de Barrett, obesidade, elevada classe social, etilismo e tabagismo(15).

Ainda quanto à origem, acredita-se que o H. pylori tenha menor importância na sua etiopatogênese, quando comparado ao carcinoma do terço distal do estômago.

Há evidências de que essa bactéria possa exercer fator protetor no carcinoma da cárdia, talvez pela menor produção de ácido, que ocorre em indivíduos com tempo prolongado de infecção e, conseqüentemente, proteção ao refluxo gastroesofágico (2).

Trata-se de neoplasia de comportamento mais agressivo, com prognóstico aparentemente pior que os tumores de terço distal, menor taxa de ressecabilidade, sendo que a sobrevivência global varia de 5% a 15% em 5 anos (15).

Em 1987, foi proposta uma classificação topográfica para os tumores da junção gastroesofágica. Definiu-se que câncer da junção esôfago-gástrica é aquele localizado desde 5 cm acima da transição esôfago-gástrica até 5 cm abaixo. O tipo I é o câncer do esôfago distal, o tipo II é o câncer da cárdia verdadeira e o tipo III, o subcárdico(31).

Como em outras neoplasias, o prognóstico do câncer gástrico está diretamente ligado ao seu estádio evolutivo, sendo pior, obviamente, nas fases mais avançadas. A infiltração tumoral na parede gástrica, o comprometimento peritonial e das margens de ressecção cirúrgica, a propagação linfática regional, o tamanho do tumor e o grau de diferenciação histológica constituem fatores relacionados com o prognóstico e aceitos, universalmente, como estádio cirúrgico(4). No entanto, destacam-se ainda alterações histopatológicas e de cinética celular, que estariam relacionados ao prognóstico desses doentes(8).

Objetivos Tendo em vista o aumento na incidência do câncer da cárdia nas últimas décadas, este trabalho visou estudar os aspectos clínico-patológicos, de proliferação celular e de apoptose no adenocarcinoma da cárdia, e suas eventuais influências no prognóstico destes doentes.

CASUÍSTICA E MÉTODOS Casuística No período entre janeiro de 1988 e dezembro de 2001, 75 pacientes foram submetidos a gastrectomia total por adenocarcinoma, na Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital São Paulo da Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM). Destes, 40 casos em topografia da cárdia puderam ser analisados, retrospectivamente.

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP-Hospital São Paulo, em 27 de setembro de 2002, registrado sob o número 0809/02.

Discriminou-se idade, sexo, recidiva local, evolução, levando-se em consideração a presença ou ausência de metástase ao diagnóstico e tempo de sobrevivência.

Foram considerados critérios de exclusão para o estudo: neoplasia precoce e doentes com tratamento radio e/ou quimioterápico pré-operatório. Foram considerados fatores de exclusão para análise da sobrevivência: doentes com metástase à distância ao diagnóstico, com morte perioperatória e aqueles que faleceram de outras causas não relacionadas ao câncer gástrico.

Métodos Tipo de cirurgia Todos os tumores eram cárdicos ou subcárdicos, não sendo abordados aqueles de terço esofágico inferior. A cirurgia realizada foi a gastrectomia total, omentectomia e linfadenectomia D2, com reconstrução pela técnica de anastomose esôfago-jejunal em Y-de-Roux. A peça cirúrgica foi colocada em solução de formol a 10% e encaminhada para exame anatomopatológico.

Anatomia patológica Ao exame macroscópico, não foi possível distinguir os tumores em tipo II ou III da classificação de Siewert, por serem todos avançados. Os fragmentos representativos foram incluídos em blocos de parafina, com cortes histológicos de 5 µm e corados pela hematoxilina-eosina (H-E).

Na análise histopatológica, os tumores foram classificados segundo o tipo histológico de Laurén (intestinal ou difuso) e padrão de crescimento de Ming.

Caso os tumores apresentassem os dois padrões histológicos (intestinal e difuso), optou-se pelo tipo predominante. Na mucosa adjacente ao tumor, analisou-se a presença ou ausência de metaplasia intestinal, de displasia epitelial e a pesquisa da bactéria H. pylori foi realizada pela coloração Giemsa modificada.

Para avaliação do grau de infiltração da neoplasia na parede gástrica, seguiu- se a classificação TNM, proposta pela União Internacional Contra o Câncer (American Joint Committee on Cancer, 1992). Embora houvesse uma versão atualizada datada de 2002, optou-se por usar a versão antiga, uma vez que, por se tratar de estudo retrospectivo, de acordo com os novos critérios, haveria um subestádio dos linfonodos. Todos os tumores eram avançados, ou seja, com comprometimento da túnica muscular própria, no mínimo. Para efeito de análise, a amostra foi subdividida em dois grupos: estádio menos avançado (I / II) e estádio mais avançado (III / IV).

Quanto ao comprometimento linfonodal, dividiu-se a amostra em dois grupos: ausência ou presença de metástase ganglionar. A relação entre o número de linfonodos comprometidos e o número total de linfonodos, multiplicado por 100, foi denominada de percentual de linfonodos acometidos.

Proliferação celular: PCNA O estudo imunoistoquímico foi realizado por meio da técnica estreptoavidina- biotina-peroxidase, utilizando-se o anticorpo anti-PCNA (clone PC10 Dako, código M0879), na diluição de 1:8000, em cortes histológicos de 4 µm de espessura e em lâminas com silano. O controle positivo reagiu normalmente. Foi considerada positiva a célula cujo núcleo exibisse colorido castanho, independente da sua intensidade (Figura_1). Avaliou-se quantitativamente em 10 campos consecutivos de grande aumento (CGA), selecionando-se inicialmente, as áreas mais positivas sob o aumento de 100x e, posteriormente, até completar o total de 500 células neoplásicas avaliadas. Da relação entre as células neoplásicas positivas e negativas, multiplicada por 100, obteve-se o percentual de imunoexpressão de cada caso.

Apoptose A contagem dos corpúsculos apoptóticos foi feita em cortes histológicos corados ao H-E, em 10 CGA e em 500 células neoplásicas. Foram consideradas apenas as células claramente identificadas pelos critérios de KERR et al.(16): citoplasma eosinofílico e condensação cromatínica, presença de fragmentação nuclear, com ou sem formação de vesículas, na ausência de reação inflamatória ao redor (Figura_2). Caso houvesse dúvida em relação à morfologia, esta era confirmada sob o aumento de 1000x em imersão. Iniciou-se o estudo quantitativo nas áreas mais celulares e posteriormente, nos demais campos consecutivos.

[/img/revistas/ag/v43n3/06f2.jpg]

Análise quantitativa Tanto a imunoexpressão do PCNA, como a contagem dos corpos apoptóticos, foram avaliadas quantitativamente, utilizando-se um programa de análise de imagens equipado com o software Image-Pro Plus, versão 3.0, para Windows, da media Cybernetic. As imagens foram obtidas através de um microscópio Olympus Bx40 acoplado a uma videocâmara Sony CCD-IRIS, modelo DXC-107 e transferidas para um computador (Pentium 233 Mhz) com placa digitalizadora de imagens.

Evolução dos doentes O acompanhamento ambulatorial dos doentes era semestral, com consulta clínica, solicitação de endoscopia digestiva alta, ultra-sonografia de abdome total ou tomografia computadorizada para identificação de recidiva. O menor tempo de avaliação da sobrevivência foi de 3 anos.

Análise estatística Para as comparações entre as variáveis foram utilizados testes t de Student e de Mann-Whitney. Para a correlação entre as variáveis, utilizou-se o índice de correlação de Pearson. Para o tempo de sobrevivência, foram construídas curvas de Kaplan-Meier e realizados testes de Log-rank e Breslow. Em relação às variáveis quantitativas, optou-se como valor referencial a mediana, no sentido de se homogeneizar as amostras a serem comparadas.

O Modelo de Regressão de Cox foi utilizado para analisar conjuntamente os efeitos das variáveis na sobrevida. O programa estatístico utilizado foi o SPSS versão 11.0 e o nível de significância adotado foi menor a 0,05.

RESULTADOS Dos 40 casos, as margens de ressecção cirúrgica estavam comprometidas no segmento proximal em quatro casos e no segmento distal em três. Havia metástase à distância ao diagnóstico (M1) em cinco casos.

Houve predomínio do sexo masculino (72,5% dos casos) sobre o feminino (27,5%).

O doente mais jovem tinha 33 anos e o mais velho 82. A idade média foi de 61,08 anos, com mediana de 63.

Houve predomínio do tipo histológico difuso de Laurén (55%) sobre o tipo intestinal (45%). O padrão de crescimento tumoral, segundo Ming, tipo infiltrativo (72,5%) predominou sobre o tipo expansivo (27,5%).

Houve predomínio de casos com metástase ganglionar (N1 e N2), correspondendo a 70% sobre aqueles sem metástase (N0), representados por 30% dos casos. Para oslinfonodos acometidos por metástase, o percentual médio foi de 41%, com valor mediano de 38% linfonodos. Os estádios mais avançados (III e IV) predominaram sobre os menos avançados (I e II).

Na mucosa adjacente ao tumor, a metaplasia intestinal esteve presente em 14 casos (36,8%) e a pesquisa para bactéria H. pylori resultou positiva em 13 casos (34,2%), sem haver correlação significativa entre estas variáveis, conforme mostra a Tabela_1. Não se detectou, em nenhum caso, displasia epitelial na mucosa adjacente.

O número médio de células neoplásicas positivas para o PCNA foi de 275,05 (10 CGA), e de 409,33 (500 células), perfazendo 81,86%. O índice apoptótico médio foi de 7,05 (10 CGA) e de 11,40 (500 células), perfazendo 2,28%. Houve correlação positiva entre o índice de PCNA e de apoptose, avaliados em 10 CGA (P = 0,0001). O índice apoptótico e de PCNA em 10 CGA, mostraram correlação positiva com os tumores de tipo intestinal (Tabela_2).

Quanto à sobrevivência, excluindo-se os cinco pacientes que apresentavam metástase à distância ao diagnóstico, o tempo médio livre de óbito foi de 28,41 meses. Em análise univariada, obteve-se resultados significativos apenas para idade, ou seja, quanto maior a idade do paciente com carcinoma gástrico, pior a sua sobrevida(P = 0,0367 - Gráfico_1). Embora não houvesse resultado significativo, houve tendência para as variáveis metástase linfonodal (P = 0,062) e estádio (P = 0,0604), como mostra a Tabela_3.

Ainda em análise univariada, também não se obteve resultado significativo para as variáveis PCNA e apoptose, em 10 CGA e em 500 células, embora houvesse tendência para a apoptose quando avaliada em 10 CGA (P <0,2), como indica a Tabela_4.

Em análise multivariada, as variáveis consideradas significantes foram a idade (P = 0,033) e apoptose em 10 CGA (P = 0,022), como mostra a Tabela_5.

DISCUSSÃO Trata-se de estudo retrospectivo com objetivo de analisar aspectos clínico- patológicos de proliferação celular e apoptose em 40 casos de carcinoma gástrico da cárdia. Outros estudos, considerando a topografia da cárdia, compreendem casuística similar ou pouco superior a presente, como o de LARDENOYE et al.(19), com 49 pacientes, e o de ERTURK et al.(7), com 60.

A análise da apoptose por meio da contagem dos corpúsculos apoptóticos à microscopia óptica, com a coloração H-E, tem sido adotada por diversos autores, desde quando os critérios morfológicos foram descritos por KERR et al.(16) até os dias atuais, sendo considerado método bastante fidedigno e reprodutível(8).

Para a análise da sobrevivência (tempo médio livre de óbito), optou-se por excluir apenas os doentes que apresentassem metástase à distância ao diagnóstico(29) e os com morte durante o ato cirúrgico(25), fato este ausente nos casos deste estudo. Também não se excluíram os pacientes que tiveram margens de ressecção cirúrgica comprometidas microscopicamente porque, embora a literatura refira menor tempo de sobrevivência nesses casos, margem comprometida é considerada como doença residual, com risco de recidiva local.

PAPACHRISTOU et al.(26) consideram a recidiva da neoplasia o evento mais importante nos tumores em estádios iniciais (I e II), particularmente da cárdia, onde a cirurgia é intencionalmente curativa, pois pacientes em estádios mais avançados, como os desta casuística, geralmente morrem em decorrência das metástases, antes da recurrência do tumor na anastomose cirúrgica. Neoplasia microscópica residual, principalmente em margem proximal, tem sido relatada em percentual elevado nos pacientes operados por carcinoma da cárdia, sendo de 23% a 31,3%(1, 13).

Obteve-se predomínio no sexo masculino (72,5%) em relação ao feminino (27,5%), com idade média de 61,08 anos. Percentual muito semelhante foi encontrado em outros estudos retrospectivos clínico-patológicos similares, com carcinoma do terço proximal gástrico, com idade média variando de 57,8 a 69,7 anos(7, 19).

Esta casuística teve número pouco maior do tipo histológico difuso (55%) sobre o intestinal (45%), com predomínio do padrão de crescimento infiltrativo (72,5%) sobre o expansivo. Outros trabalhos mostram predomínio ora do difuso (17), ora do intestinal(1, 13), e até mesmo distribuição equivalente(7). Nesses estudos não houve especificação do padrão de crescimento tumoral de Ming, muito embora, de modo geral, exista associação entre o tipo intestinal e expansivo, assim como entre o tipo difuso e o infiltrativo(3). Essa associação foi também comprovada no presente estudo.

Houve maior número de casos em estádios mais avançados da doença (67,5% em estádios III e IV). Esses resultados estão de acordo com os de BRUNO et al.(1) que, ao compararem carcinomas da cárdia, antro e de coto gástrico, tiveram maior percentagem de casos em estádio mais avançado (T3 - 68,8%) para o primeiro tipo. ERTURK et al.(7) notaram predominância de tumores infiltrando até a serosa (T3), com linfonodos acometidos (82%) e, portanto, em estádio mais avançado (III - 64%).

Quanto à mucosa adjacente ao tumor, não se encontraram correlações significativas quanto à presença ou ausência da metaplasia intestinal e/ou do H. pylori, assim como também não se encontrou displasia epitelial associada em nenhum dos casos. De fato, a presença de gastrite crônica na mucosa adjacente, bem como dessa bactéria, está mais freqüentemente associada aos tumores gástricos não-cárdicos, em relação aos cárdicos e de esôfago distal, sendo que o índice de positividade para o H. pylori em tumores cárdicos, referido na literatura como sendo de 34%, foi similar ao deste estudo(6). A presença de metaplasia intestinal e/ou displasia também é considerada achado menos comum na mucosa adjacente aos carcinomas da cárdia, quando comparado aos adenocarcinomas originários em esôfago de Barrett(9). Por terem sido analisados somente os tumores cárdicos e subcárdicos, o resultado desta série está de acordo com SIEWERT et al.(32), que referem a metaplasia intestinal como sendo evento mais associado ao carcinoma da cárdia tipo I, infreqüente no tipo II e raro no tipo III.

O índice apoptótico foi de 7,05 (10 CGA) e de 11,40 (2,28%), em 500 células.

Esse índice foi maior no tipo intestinal (9,00) em relação ao difuso (5,45).

Houve forte correlação entre o PCNA e a apoptose. Essa associação também foi descrita em outras neoplasias malignas, tais como de mama(28), ovário(40) e também em carcinoma gástrico(10, 14, 18). Índices apoptóticos similares aos da presente casuística foram descritos como em 2,05%(8, 10).

Na literatura, encontrou-se índice apoptótico médio pouco menor que o deste estudo, referido em 1,58%(12, 18) e maiores, sendo de 8,1% nos carcinomas mais diferenciados (grau 1 e grau 2) e de 4,7% naqueles pouco diferenciados (grau 3) (14, 34).

O índice médio PCNA nesta série em 500 células, foi de 81,86%, maior do que aquele obtido por outros autores, que variaram de 23% a 49%(6, 12, 23, 35).

Neste estudo, o tempo médio livre de óbito foi de 28,41 meses. Tempo médio de sobrevivência similar ao desta série foi encontrado em doentes operados por carcinoma da cárdia(7) ou pouco inferiores como de 23 meses(1, 19). DEMIRKAN et al.(3), em estudo comparativo entre tumores proximais e distais gástricos, encontraram sobrevivência menor para os tumores de terço proximal (22,0 meses), em relação aos distais (40,0 meses).

Em análise univariada e multivariada, a idade acima de 63 anos mostrou correlação negativa significativa com o tempo médio livre de óbito. Diversos trabalhos têm mostrado o mesmo, ou seja, idade acima de 63 anos comportou-se como fator prognóstico independente(7, 12, 13).

A presença de metástase linfonodal e o estádio (I/II e III/IV), ambos relacionados entre si, não tiveram correlação significativa com o tempo livre de óbito. No entanto, na análise univariada, houve tendência para os dois primeiros parâmetros (P = 0,0621 e 0,0604, respectivamente), resultado esse que, provavelmente, seria significativo se a presente casuística fosse maior.

Essas correlações já estão bem estabelecidas na literatura, com diversos trabalhos mostrando a importância do estádio no prognóstico do câncer gástrico (3, 4, 13).

Quanto à proliferação celular tumoral, não se encontrou correlação entre o PCNA e o tempo livre de óbito, quando analisado em 10 CGA ou em 500 células. O mesmo resultado foi observado em estudos em carcinoma gástrico(24, 30). Ao contrário, MAEDA et al.(22, 23) e ELPEK et al.(6) encontraram pior prognóstico para os casos em que os tumores tinham elevado índice de proliferação celular.

Com relação à apoptose, embora não fosse encontrada correlação, em análise univariada, entre essa e o tempo de sobrevivência, o resultado foi significativo em análise multivariada. Diversos estudos têm mostrado a correlação positiva entre a apoptose e a proliferação celular e que elevado índice apoptótico associa-se com piora do prognóstico em vários tipos de carcinomas, como de mama(21), estômago(10), cólon(33) e pulmão(37).

Em carcinomas gástricos, estudos da apoptose por meio de suas proteínas indutoras, como a FasL e Caspase-3, mostraram correlação positiva entre a expressão das mesmas com o tamanho da neoplasia e a presença de metástase linfonodal(12, 39) e, conseqüentemente, pior prognóstico. Outros trabalhos, envolvendo proteína inibidora da apoptose, como o Bcl-2, mostraram correlação negativa entre a expressão da proteína com o índice apoptótico, com conseqüente melhor sobrevivência dos doentes(20).

CONCLUSÕES O adenocarcinoma gástrico da cárdia ocorreu preferencialmente em indivíduos do sexo masculino, com idade média de 61 anos, com predomínio do tipo histológico difuso, infiltrativo e em estádios mais avançados da doença. Houve correlação positiva entre a apoptose e a proliferação celular tumoral. A sobrevivência dos doentes ainda é baixa, sendo de 28,41 meses em média. Tanto a idade como a apoptose foram fatores prognósticos independentes no adenocarcinoma da cárdia.