Alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado de ratos submetidos a
manipulação tímica com células não-parenquimatosas
EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGY GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTALINTRODUÇÃO
A maior indicação do transplante de pâncreas ou de ilhotas de Langerhans é o
diabetes mellitus do tipo I, doença em que as células beta das ilhotas de
Langerhans são destruídas por processo auto-imune, resultante de inter-relação
complexa entre fatores genéticos e ambientais desconhecidos(7).
Os resultados do transplante vascularizado de pâncreas têm melhorado nos
últimos anos, no entanto, a cirurgia e a necessidade de imunossupressão
continuam sendo responsáveis pela significativa morbimortalidade do
procedimento(20).
Desde que muitos dos problemas relacionados com este procedimento terapêutico
são inerentes da técnica cirúrgica ou da porção exócrina do pâncreas
transplantado, a simples implantação de ilhotas purificadas de Langerhans,
seria uma alternativa viável.
Muito tem sido feito nos últimos 20 anos, para o aperfeiçoamento das técnicas
de transplante de ilhotas de Langerhans: a grande atração desta modalidade
terapêutica é de que as ilhotas podem ser injetadas, por via endovenosa, em
órgão bem vascularizado (como por exemplo o baço ou o fígado), evitando-se
assim, a necessidade de intervenção cirúrgica, como também, as inconveniências
imunológicas e inflamatórias conseqüentes do transplante de tecido exócrino
pancreático(4, 5).
Apesar dos resultados encorajadores em roedores, o transplante alogênico de
ilhotas de Langerhans em grandes animais como também no homem, não tem
demonstrado produção significativa de insulina por longos períodos(18, 24). Por
outro lado, o transplante de ilhotas de Langerhans vem enfrentando dificuldades
não só na rejeição imunológica, como também problemas anatômicos específicos
(26).
Um dos principais problemas da perda do enxerto é a rejeição aguda. O grande
passo para a sua solução foi dado por POSSELT et al.(23), que obtiveram pela
primeira vez a tolerância ao alotransplante das ilhotas de Langerhans em ratos,
inoculando no timo destes animais as mesmas ilhotas transplantadas em outro
órgão, associando dose única de soro anti-linfocitário, por via sistêmica.
Recentemente o presente grupo apresentou os efeitos da inoculação de células
dendríticas (apresentadoras de antígenos) no timo de ratos submetidos ao
alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado, não conseguindo aumento na
tolerância imunológica, mas aceleração no processo de rejeição aguda(6).
Nesta mesma linha de investigação, trabalhando com células apresentadoras de
antígenos, propõe-se ao estudo dos efeitos da inoculação de células não-
parenquimatosas no timo de ratos submetidos ao alotransplante de ilhotas de
Langerhans no fígado.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado em 64 Rattus albinus, sendo 48 doadores fêmeas, da raça
Wistar (RT1u) e 16 receptores machos, da raça Lewis (RT11). Água e dieta foram
administrados ad libitum.
Para a separação das ilhotas de Langerhans, foram utilizados ratos fêmeas,
Wistar (RT1u), de peso corpóreo entre 120 e 210 g. Para receptores das ilhotas
de Langerhans utilizaram-se ratos machos, Lewis (RT11), com peso corpóreo entre
160 e 230 g, em que o diabetes foi induzido por injeção, na veia peniana, de
estreptozotocina.
A digestão do pâncreas, o método de purificação de ilhotas de Langerhans, sua
separação, contagem e identificação bem como a indução do diabetes mellitus já
foram descritos previamente(5).
Os procedimentos cirúrgicos para retirada do pâncreas do doador bem como para o
transplante de ilhotas de Langerhans no receptor também foram descritos
previamente(6).
Separação e purificação das células não-parenquimatosas do fígado
Ratos fêmeas, da raça Wistar (RT1u), foram utilizados como doadores de células
não-parenquimatosas. O método utilizado para separação e purificação dessas
células, foi o descrito por KROKOS et al.(16) e está assim resumido:
Após anestesia por inalação com éter etílico, o animal era submetido a
laparotomia mediana, sendo a veia porta e a veia cava infra e supra-hepática
expostas. Canulava-se a veia porta com cateter de polietileno fino, sendo a
veia cava infra-hepática ligada com fio de algodão 4-0.
Concomitantemente à secção da veia cava supra-hepática, por onde o animal era
exsanguinado, injetava-se na veia porta, de 4 a 6 mL de solução de colagenase
resfriada, sendo observada distensão da cápsula do fígado e mudança da
coloração do parênquima hepático.
O fígado era, então, retirado do animal doador e colocado em frasco que
continha a mesma solução de colagenase, sendo então, transportado para o
laboratório, onde era macerado e transformado em suspensão, após a digestão
pela colagenase.
O sobrenadante obtido dessa suspensão era rico em células não-parenquimatosas.
Um g do sedimento dessa suspensão era purificado por centrifugação, num
gradiente de 16% de metrizamide, na rotação de 2.670 por grama durante 45
minutos à temperatura de 4º C.
As células da interface entre as soluções eram removidas e lavadas por várias
vezes, com solução de Hanks; 1 x 106 células não-parenquimatosas purificadas
eram colocadas em seringa totalizando-se volume de 20 µL, para posterior
injeção no timo dos animais receptores.
Os tipos celulares contidos nessa suspensão de células apresentadoras de
antígenos (células não-parenquimatosas) eram avaliados por coloração
imunoistoquímica usando-se anticorpos monoclonais, como descrito por BARCLAY
(2).
Mais de 70% das células eram positivas para ED2 e 3 (anticorpos monoclonais
específicos para células de Kupffer) e diferentes tipos de macrófagos em ratos.
Assim, essa suspensão de células não-parenquimatosas continha, aproximadamente,
60% de células de Kupffer, 30% de macrófagos, alguns linfócitos T e B, células
endoteliais e raros hepatócitos.
Inoculação de células não-parenquimatosas
Após a separação e purificação das células não-parenquimatosas do fígado dos
animais doadores (WAG - RT1u), suspensão celular contendo 2 x 106 células,
diluídas em 20 µL de solução de Hanks, eram injetadas em cada lobo do timo dos
animais receptores (Lewis - RT1l). Utilizava-se para esse procedimento seringa
de insulina e agulha de 0,33 mm x 13 mm B-D (EUA). A inoculação dessas células
no timo era realizada 7 dias antes do transplante de ilhotas de Langerhans e 3
dias antes da indução do diabetes mellitus.
Ao final deste ato, 1 mL de soro anti-linfocitário era injetado na cavidade
peritonial.
Injeção intraperitonial de soro anti-linfocitário
Junto à inoculação das células não-parenquimatosas no timo dos animais, 1 mL de
soro anti-linfocitário (Accurate Scientific Company, Westbury, EUA), era
injetado na fossa ilíaca direita dos animais receptores (Lewis - RTIl),
utilizando-se seringa de insulina de 1 mL e agulha de 12 mm x 0,4 mm, 7 dias
antes do transplante de ilhotas de Langerhans e 3 dias antes da indução do
diabetes mellitus.
Grupo alogênico - solução de Hanks (Controle)
Oito ratos machos, da raça Lewis (RT1l), pesando entre 140 e 320 gramas, foram
usados como receptores para o transplante de ilhotas de Langerhans de doadores
fêmeas da raça Wistar (RT1u).
Três dias antes da indução do diabetes, os animais haviam sido submetidos a
injeção intra-tímica de 20 µL de solução de Hanks em cada lobo do timo.
O diabetes foi induzido nos ratos por injeção endovenosa, na veia peniana, de
estreptozotocina (60 mg/kg ). Quatro dia depois da indução do diabetes, o
animal era anestesiado com a associação Hypnorm intramuscular (0,04 mL/100 g de
peso corpóreo) e Diazepan intraperitonial (0,05 mL/100 g de peso corpóreo ),
colhendo-se amostra sangüínea da veia da cauda do rato, para a dosagem da
glicemia antes da laparotomia.
O estômago, o intestino delgado e o grosso eram envolvidos em gaze úmida e
afastados para o lado direito do abdome. A veia porta era visualizada e
puncionada com Butterfly nº 23 (Venisystems, TM, Abbott, Ireland Ltd.), com
agulha de 19,1 mm e diâmetro de 0,5 mm.
As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS eram aspiradas em seringa de 1 mL com
solução salina e injetadas, via veia porta, no fígado. Após a injeção, a agulha
era retirada da veia porta e esponja de material absorvível (Spongostan e
Standard 70 x 50 x 10 mm, Ferrosan - Denmark) era colocada no local da punção,
comprimindo-se o vaso suavemente por 2 minutos, para evitar-se o sangramento.
O abdome era, então, fechado em dois planos de sutura contínua, usando-se
algofil 4-0 para o plano muscular e para a pele. O animal era acompanhado
diariamente, no pós-operatório.
Os níveis da glicemia foram medidos antes do transplante e valores acima de 15
mmol/L (em 2 dias consecutivos ) confirmavam o estabelecimento do diabetes e/ou
rejeição aguda após o transplante das ilhotas.
Grupo alogênico - células não-parenquimatosas
Oito ratos machos da raça Lewis (RT1l) pesando entre 160 e 230 g foram usados
como receptores de ilhotas de Langerhans de doadores fêmeas da raça Wistar
(RT1u).
Três dias antes da indução do diabetes, haviam sido submetidos a injeção intra-
tímica de 2 x 106 células não-parenquimatosas em 20 µL de solução salina, em
cada lobo do timo.
O diabetes era induzido por injeção endovenosa, na veia peniana, de
estreptozotocina (60 mg/kg). Quatro dias depois da indução, o animal era
anestesiado com a associação Hypnorm intramuscular (0,04 mL/100 g de peso
corpóreo) e Diazepan (0,05 mL/100 g de peso corpóreo), colhendo-se uma amostra
sangüínea da veia da cauda do rato, para dosagem da glicemia antes da
laparotomia.
O estômago, o intestino delgado e o grosso eram envolvidos em gaze úmida e
afastados para o lado direito do abdome. A veia porta era visualizada e
puncionada com Butterfly nº 23 (Venisystems, TM, Abbott, Ireland Ltd ), com
agulha de 19,1 mm e diâmetro de 0,5 mm.
As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS eram aspiradas em seringa de 1 mL com
solução salina e injetadas, via veia porta, no fígado. Após a injeção, a agulha
era retirada da veia porta e esponja de material absorvível (Spongostan e
Standard 70 x 50 x 10 mm, Ferrosan - Denmark) era colocada no local da punção,
comprimindo-se o vaso suavemente por 2 minutos, para evitar-se o sangramento.
O abdome era, então, fechado em dois planos de sutura contínua usando-se
algofil 4-0 para o plano muscular e para a pele. O animal era acompanhado
diariamente, no pós-operatório.
Os níveis de glicemia foram medidos antes do transplante e valores acima de 15
mmol/L (em 2 dias consecutivos) confirmavam o estabelecimento do diabetes e/ou
rejeição aguda após o transplante de ilhotas.
Análise estatística
Utilizou-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney na comparação entre as
glicemias antes e depois do transplante de ilhotas de Langerhans dos seguintes
grupos: controle (solução de Hanks) x (células não-parenquimatosas). Para todo
o estudo foi considerado o nível de significância de 5%.
RESULTADOS
Grupo alogênico - (WAG-Lewis) ' Controle - Solução de Hanks
Cirurgia do doador
Com o método de purificação e separação das ilhotas de Langerhans obteve-se
3.637 ± 783,3 ilhotas com pureza de 85,12 ± 3,52% (Tabela_1).
Cirurgia do receptor
A dose de estreptozotocina utilizada para a indução do diabetes mellitus, nos
animais deste grupo, foi de 11,51 ± 3,39 mg, obtendo-se níveis de glicemia
sérica de 26,48 ± 7,07 mmol/L (Tabela_1).
O transplante de 3 637 ± 783,3 ilhotas de Langerhans no fígado destes animais,
normalizou a glicemia que chegou a 7,21 ± 0,57 mmol/L no 2º dia do pós-
operatório (diferença significante com relação ao pré-operatório). Do pós-
operatório (P.O.) imediato até o 8º dia P.O., a glicemia não se elevou
significativamente, porém a partir do 10º dia P.O. houve aumento significativo
deste parâmetro, o que pode ser compatível com rejeição aguda do enxerto
(Tabela_1). A demonstração gráfica destes valores pode ser observada na (Figura
1).
O tempo médio de sobrevida das ilhotas transplantadas está na Tabela_2.
Grupo alogênico - (WAG-Lewis) - Células não-parenquimatosas
Cirurgia do doador
Com o método de separação e purificação das ilhotas de Langerhans obteve-se 3
270 ± 770 ilhotas com pureza de 84,25 ± 2,76% (Tabela_3).
Com o método de separação e purificação das células não-parenquimatosas do
fígado obteve-se 2 x 106 células (Tabela_3).
Cirurgia do receptor
A dose de estreptozotocina utilizada para a indução do diabetes mellitus nos
animais deste grupo, foi de 12,06 ± 1,86 mg, obtendo-se níveis de glicemia
sérica de 34,72 ± 7,04 mmol/L (Tabela_3).
O transplante de 3.270 ± 770 ilhotas de Langerhans no fígado destes animais,
reduziu significativamente a glicemia que chegou a 17,95 ± 5,33 mmol/L no 2º
dia P.O., por outro lado houve aumento significativo de seus níveis nos dias
subseqüentes, o que é compatível com o quadro de rejeição aguda e certamente
precoce (Tabela_3). A demonstração gráfica destes valores pode ser observada na
Figura_2.
A média e o desvio padrão das glicemias do grupo controle (solução de Hanks)
comparados ao de células não-parenquimatosas, estão representados na Tabela_4.
DISCUSSÃO
O método de isolamento, purificação e transplante isogênico das ilhotas de
Langerhans em ratos já fora descrito(5); assim, passou-se à investigar o
transplante alogênico (entre espécies), em animais manipulados no timo com
injeção de células alogênicas apresentadoras de antígenos como as células
dendríticas extraídas do baço(6) e no presente estudo, com células não-
parenquimatosas hepáticas com intuito de induzir-se tolerância imunológica.
Optou-se pela utilização de ratos da raça Wistar, como doadores de células
(ilhotas de Langerhans e células não-parenquimatosas hepáticas), com complexo
de histocompatibilidade maior ou haplotipo (RT1u) e ratos da raça Lewis, como
receptores, também, com haplotipo conhecido (RT1l) e incompatíveis.
No grupo controle seriam transplantadas as ilhotas de Langerhans, dos ratos da
raça Wistar, em ratos da raça Lewis diabéticos (por injeção de estreptozotocina
endovenosa) já imunossuprimidos, com dose única de soro anti-linfocitário, e
manipulados no timo apenas com injeção de solução tampão de Hanks, 7 dias antes
do transplante.
Neste grupo injetava-se estreptozotocina, na veia peniana dos animais
receptores, 4 dias antes do transplante de ilhotas de Langerhans, na dosagem de
11,51 ± 3,39 mg. A dose era suficiente para a indução do diabetes, mostrando
que a glicemia sérica, no dia do transplante (dia 0), era de 26,48 ± 7,07 mmol/
L, significantemente superior aos valores pré-operatórios.
O transplante de 3.637 ± 783,3 ilhotas de Langerhans no fígado, via veia porta,
foi eficiente para a normalização da glicemia que até o 4º dia P.O., manteve-se
igual aos valores pré-operatórios. A partir daí, iniciou-se o processo de
provável rejeição aguda que se estabeleceu, definitivamente, a partir do 9º dia
P.O., quando a glicemia sérica superou os níveis de 15 mmol/L, chegando no 10º
P.O. à 20,01 ± 10,15 mmol/L, o que é, significantemente superior aos níveis
encontrados até o 4º dia P.O., como demonstra a Figura_1.
Sabendo-se que o alotransplante (WAG-Lewis) das ilhotas de Langerhans, em
receptores imunossuprimidos com soro anti-linfocitário, eram rejeitadas no 9º
P.O., restava investigar se a inoculação de células não-parenquimatosas,
extraídas do fígado dos ratos doadores, atuariam como moduladoras da resposta
imunológica, uma vez que em estudo anterior verificou-se que células
dendríticas extraídas do baço aceleraram a rejeição ao transplante de ilhotas
de Langerhans no fígado de ratos, ao invés de induzir a tolerância imunológica
(6).
O rationale para esta inferência seria que as células apresentadoras de
antígenos (células não-parenquimatosas hepáticas), provindas dos animais
doadores, quando injetadas no timo dos animais receptores, entrariam em contato
direto com este órgão e, por conseguinte, com os linfócitos T e B, que por
certo são os responsáveis pela aceitação ou rejeição dos transplantes de
órgãos.
Supondo-se que durante a gênese e maturação, no timo, dos linfócitos T e B
estes reconhecessem as células apresentadoras de antígenos (células não-
parenquimatosas hepáticas) como próprias, provavelmente não rejeitariam as
ilhotas de Langerhans que, posteriormente, seriam transplantadas, provindas,
também, dos mesmos doadores, conseguindo-se com isto a obtenção de um estado de
não resposta imunológica ou tolerância ao transplante, como conseguiu POSSELT
et al.(23), quando injetou as próprias ilhotas de Langerhans, que seriam
transplantadas posteriormente, no timo dos animais receptores.
O presente grupo de estudo baseou-se no alotransplante de ilhotas de Langerhans
com inoculação tímica de células não-parenquimatosas.
Uma semana antes do alotransplante das ilhotas os animais receberam, em cada
lobo do timo, 2 x 106 células não-parenquimatosas purificadas, ao mesmo tempo
em que era administrado, intraperitonialmente, o soro anti-linfocitário.
A injeção de 12,06 ± 1,86 mg de estreptozotocina na veia peniana dos animais, 4
dias antes do alotransplante, elevou a glicemia sérica a níveis de 34,72 ± 7,04
mmol/L, o que é significantemente superior aos níveis pré-operatórios,
tornando-os, assim, ratos diabéticos.
O transplante de 3 .270 ± 770 ilhotas no fígado, por via portal, fez com que a
glicemia sérica tivesse queda significante (17,95 ± 5,33 mmol/L) no 2º dia
P.O., porém ainda um pouco acima dos limites da normalidade adotados no
presente estudo.
Com isso, pode-se observar que ou a glicemia sérica após o transplante das
ilhotas nunca chegou a níveis inferiores a 15 mmol/L ou os animais iniciaram o
processo de rejeição aguda no 1º dia P.O., caracterizando-se com isso, o mesmo
fato ocorrido com o grupo de estudo das células dendríticas(6) ou seja,
rejeição aguda precoce.
O mecanismo celular envolvido na rejeição aguda dos alotransplantes é complexo
e o papel preciso das várias subpopulações de células T neste processo ,
continua obscuro.
Muitos estudos têm mostrado que as células CD+4 são os pivôs da indução da
rejeição(12, 14), enquanto outros estudos têm também identificado a ativação
dependente das células CD+4 das células T citotóxicas (CD+8) como um importante
mecanismo efetor na rejeição dos alotransplantes com complexo de
histocompatibilidade, classe I e classe II, incompatíveis(14, 17, 19).
A expressão celular do antígeno do complexo de histocompatibilidade maior
classe II é considerada como mecanismo envolvido na iniciação ou na perpetuação
da destruição mediada imunologicamente que ocorre em doenças auto-imunes(3) e
na rejeição de alotransplantes(21).
No transplante de ilhotas, um decréscimo nas células das ilhotas que expressam
antígenos classe II está correlacionado com o prolongamento da sobrevida dos
enxertos(8).
Dentro das ilhotas de Langerhans, células classe II positivas residem com
células endócrinas que normalmente não expressam antígenos classe II, porém
apenas pequenos níveis de antígenos classe I(13, 15).
Essas células classe II positivas "leucócitos passageiros", células dendríticas
ou apresentadoras de antígenos são necessárias para a apresentação do antígeno
para o hospedeiro ou na produção de um co-estimulador (citokina primária ou
secundária) para ativação do processo do antígeno pelo hospedeiro, que
resultaria na iniciação da rejeição do enxerto(15).
As ilhotas podem ser preparadas de pâncreas de ratos neonatos que estão sem
células apresentadoras de antígenos como também transplantadas contra grande
diferenças de antígenos de histocompatibilidade, sem rejeição ou
imunossupressão(13, 15).
A rejeição de alo-ilhotas de Langerhans isoladas mostra um número de achados
que são típicos da rejeição de órgãos vascularizados, como também de outros
alotransplantes como: controle genético(22), latência(9, 10, 11, 25),
dependência da dosagem(9, 11), expressão sistêmica(10), dependência da célula T
(25).
Descarta-se a possibilidade de "primary non-function" neste grupo (células não-
parenquimatosas) visto que houve queda significativa dos valores glicêmicos
antes e depois do alotransplante de ilhotas. Outro fator que poderia colaborar
para explicação deste fato é que quando se compara a glicemia no dia do
alotransplante de ilhotas (dia 0) entre os três grupos (controle x células não-
parenquimatosas), verifica-se que a do grupo de células não-parenquimatosas é,
em média, a mais elevada que os demais sendo esta diferença estatisticamente
significante. Portanto, a queda da glicemia foi importante, porém como estes
animais partiram de um patamar mais elevado, talvez o número de ilhotas
transplantadas tenha sido insuficiente para normalizar níveis glicêmicos tão
elevados.
O tempo médio de sobrevida das ilhotas de Langerhans, neste grupo, não foi
superior a 2 dias, denotando também que a inoculação de células não-
parenquimatosas no timo destes animais, ao contrário de possibilitar a melhor
aceitação do enxerto como se supunha inicialmente, levou a aceleração do
processo de rejeição aguda por estes animais.
Para se ter uma idéia do conjunto dos grupos de alotransplante de ilhotas de
Langerhans estudados e de suas respectivas alterações glicêmicas pode-se
observar a Figura_2.
Por fim, apesar deste estudo não ter obtido a indução de tolerância nos
alotransplantes de ilhotas de Langerhans como está demonstrado acima, deve-se
por questão de justiça e homenagem histórica mencionar que o fenômeno da
tolerância imunológica foi descrito, pela primeira vez, por BILLINGHAM et al.
(1), sustentando a promessa que os transplantes clínicos poderiam ser feitos
sem o uso da imunossupressão.
Deste modo, após a observação dos resultados deste estudo, fica aberta esta
linha de pesquisa, na área de imuno-modulação de transplantes de ilhotas de
Langerhans, experimental e clínico, na esperança de que futuros pesquisadores
dediquem-se a esta causa, o que por certo, em futuro próximo, contribuirá de
modo definitivo para o controle do diabetes mellitus, poupando-se, com isso, o
sofrimento e a dor de milhões de pacientes afetados por esta doença, em todo o
mundo.