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Esofagites em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida: estudo histológico e imunoistoquímico ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL ARTICLE

Esofagites em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida. Estudo histológico e imunoistoquímico

Esophagitis in patients with acquired human immunodeficiency syndrome. An histological and immunohistochemistry study

Ana Paula Aguiar VidalI; Vera Lucia Nunes PannainII; Adriana Marques Caroli de Freitas BottinoII IServiço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro IIDepartamento Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ Correspondência

INTRODUÇÃO Os sinais e sintomas relacionados ao sistema digestório são freqüentes em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), sendo referidos em 50% a 90% dos casos, com predominância de colites seguidas de esofagites(14, 16, 19). Nos pacientes com AIDS, é de fundamental importância o estudo das formas de apresentação e a caracterização do agente etiológico das esofagites infecciosas, tendo em vista a sua morbidade e contribuição para a redução da sobrevida(1, 10, 12, 25, 49).

Os agentes infecciosos mais comumente encontrados são Candida sp(3), os vírus: citomegalovírus (CMV), herpes simples (HSV)(4, 32, 38), Epstein-Baar (EBV)(44), papiloma vírus humano (HPV)(48), vírus da imunodeficiência humana (HIV)(29), as micobactérias(18) e os protozoários Cryptosporidium sp e Pneumocystis carinii (25). As infecções podem apresentar-se isoladas ou concomitantes(4).

A endoscopia digestiva é o procedimento de eleição para o diagnóstico das lesões esofagianas. Trata-se do método mais sensível e específico, que permite a retirada de material para exames laboratoriais(7, 33).

A disponibilidade de medicamentos anti-retrovirais mais eficientes diminuiu a incidência das infecções oportunistas no sistema digestório nesses pacientes, as quais têm se mantido em remissão mesmo sem o uso de antibióticos profilaticamente(31, 33). Entretanto, a interrupção do tratamento é problema freqüente em países em desenvolvimento, o que torna essa avaliação difícil(9, 13, 53). A série aqui apresentada tem o perfil das esofagites antes da introdução da terapia anti-retroviral com os poliquimioterápicos.

Objetivos Foram estudadas biopsias esofagianas de pacientes com AIDS com os objetivos de: graduar histologicamente as esofagites, identificar os agentes associados, tais como Candida sp, citomegalovírus, herpes vírus e micobactérias, identificar, através da imunoistoquímica, os agentes: CMV, HSV I e II, EBV, HPV e HIV, verificar a contribuição da imunoistoquímica para o diagnóstico dos agentes infecciosos, verificar a associação entre os achados histológicos e endoscópicos, assim como a influência do número de fragmentos na caracterização dos agentes etiológicos.

MÉTODOS Foram analisadas, retrospectivamente, biopsias de esôfago de 227 pacientes com AIDS, registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, realizadas no período de 1990 a 1995.

As amostras foram analisadas utilizando-se as colorações de hematoxilina-eosina (H-E), ácido periódico de Schiff (PAS), Ziehl-Nielsen e a impregnação pela prata de Grocott. Na graduação histológica da inflamação esofagiana utilizaram- se os critérios definidos por BONACINI et al.(4), que consideram a relação entre a área total do espécime e a área ocupada pelo infiltrado inflamatório, atribuindo os seguintes graus: 0 (normal), ausência de inflamação; 1 (leve): corresponde à ocupação de até 15% da área; 2 (moderada): até 50%; 3 (acentuada): mais de 50%. O diagnóstico etiológico das esofagites foi realizado quando se encontraram microorganismos como: esporos ou pseudohifas compatíveis com Candida sp nas colorações de H-E, PAS ou prata; micobactérias na coloração de Ziehl-Nielsen ou efeitos citopáticos virais seguindo as definições morfológicas já estabelecidas para CMV por Cowdry(15, 17), HSV(38) e HPV(8, 47). As formas de inclusões atípicas encontradas em alguns casos de CMV quando as células apresentavam: cariomegalia (cerca de 2 a 3 vezes o tamanho normal) sem evidência de inclusão nuclear, anfofilia e grânulos eosinofílicos citoplasmáticos, foram incluídas nos diagnósticos desta casuística como suspeitas, porém não conclusivas para CMV, segundo descrito na literatura(38).

Submeteram-se 215 casos a pesquisa pela imunoistoquímica. A seleção dos casos teve como critério a disponibilidade de material no bloco de parafina para a confecção de cortes de forma a minimizar os erros de amostragem. Utilizaram-se anticorpos (Ac) Dako A/S DK. Os agentes virais estudados são abaixo especificados: Ac anti-citomegalovírus, monoclonal clone DDG9, CCH2, soro anti- camundongo na diluição de 1:30; Ac anti-HSV tipo I monoclonal, soro anti-coelho na diluição de 1:800; Ac anti-HSV tipo II monoclonal soro anti-coelho na diluição de 1:800; Ac anti-papiloma vírus policlonal bovino, clone BPV-1, soro anti-camundongo, pré-diluido; Ac anti-EBV, monoclonal, clone LMP, CSI-4 soro de camundongo, na diluição de 1:400; Ac anti-HIV, monoclonal, clone p24, Kal-1, soro anti-camundongo, na diluição de 1:5. Os cortes foram desparafinados e hidratados. A recuperação antigênica ocorreu em solução de ácido cítrico a 0,01 M, pH 6.0, em duas incubações de 9 minutos em forno de microondas. A peroxidase endógena foi bloqueada em solução de peróxido de hidrogênio a 6% em etanol, em dois banhos de 5 minutos. O bloqueio da reação inespecífica foi feito com albumina bovina diluída a 1% em TBS por 20 min em estufa a 37ºC. Os cortes foram incubados com os anticorpos em câmara úmida a 4ºC por 18 horas. Seguiu-se a incubação com Ac secundário, componente do conjunto ABC Vectastain pK4001 e pK 4002 (Vector, EUA) conjugado com biotina IG de cavalo anti-camundongo ou IG suíno anti-coelho de acordo com o Ac primário, na diluição de 1:200, em câmara úmida a 37ºC, por 30 minutos. Entre as incubações foram feitas lavagens com tampão PBS, pH 7.4. A reação foi detectada através da incubação com o sistema estreptoavidina-biotina-peroxidase (ABC Vector duet mouse/rabbit-Vector, EUA) na diluição de 1:200 em PBS. A revelação deu-se em substrato cromógeno-DAB 60 mg% em PBS + 2 mL de peróxido de hidrogênio a 10% por 5 minutos a 37ºC. Os cortes foram contra corados pela hematoxilina de Harris.

Os dados de gênero, idade e achados endoscópicos foram obtidos através de consulta aos prontuários e correlacionados aos achados histológicos.

De acordo com o número de fragmentos presentes nas amostras, foram estabelecidos dois grupos: um deles, menor ou igual a 3 (1-3) e outro, maior que 3 (4-6) fragmentos.

A análise estatística foi realizada pelo teste de qui-quadrado ou pelo teste exato de Fisher sendo considerados significantes os valores de P<0.05.

RESULTADOS Entre os 227 pacientes com biopsias esofagianas, 181 (79,7%) eram do gênero masculino e 46 (20,3%) do feminino, com proporção de 4:1. A idade média foi de 35 anos para os dois grupos. Foram identificados critérios histológicos para o diagnóstico de esofagite em 209 casos, sendo distribuídos quanto ao grau de inflamação, da seguinte forma: 53 (25,3%) grau I, 37 (17,7%) grau II e 119 (57%) grau III.

Ao exame endoscópico havia alteração da mucosa esofagiana em 223 pacientes (98,2%). A distribuição dos aspectos endoscópicos mais freqüentemente encontrados está descrita na Tabela_1. Encontraram-se as seguintes associações significativas entre o diagnóstico histopatológico e os aspectos endoscópicos: esofagite por Candida sp e placas em 89% (P<0,0001), esofagite por Candida sp e enantema em 49% (P = 0,05), esofagite por CMV e úlceras em 67% (P = 0,01) e esofagite inespecífica e úlceras em 58% dos casos (P = 0,013).

A distribuição dos diagnósticos da endoscopia está descrita na Tabela_2. Houve associação significativa entre o diagnóstico endoscópico e histológico para: esofagite (P = 0,04), Candida sp (P<0.0001) e CMV (P = 0,045). Outra importante associação significativa observada foi a suspeita de CMV à endoscopia e o diagnóstico histopatológico sugestivo de vírus (P = 0,001).

Na análise das colorações de rotina, em 111 casos foi identificado o agente etiológico. Destes, ocorreu associação de agentes em 10 casos. A esofagite inespecífica (n = 97) e a esofagite por Candida sp, isolada ou em associação, (n = 70) foram as mais freqüentes, enquanto que a esofagite viral mais freqüente foi pelo CMV (Figura 1), isolado ou em associação (n = 23) (Tabela 3).

Quando associados os resultados obtidos à imunoistoquímica com as técnicas convencionais de coloração, houve mudança no perfil dos diagnósticos. No total de biopsias estudadas, passou-se a ter critérios para diagnóstico histológico de esofagite em 209/227 (92%). O acréscimo de um caso no conjunto das esofagites ocorreu em função da positividade para CMV à imunoistoquímica em um caso previamente classificado como sem inflamação.

Além deste caso, as principais mudanças observadas nos diagnósticos após a aplicação da imunoistoquímica decorreram da melhor identificação de infecção pelo CMV, cujos casos de infecção isolada passaram de 19 para 30/227. Também os casos de associação do CMV com outros agentes passaram de 4 para 10/227 (Tabela 3). Houve casos de diagnóstico de CMV somente por colorações de rotina nas quais não foi possível realizar a imunoistoquímica. Esses casos tiveram seus diagnósticos mantidos na soma final.

O HSV I (Figura_1) foi positivo à imunoistoquímica em 6 casos e o HSV II em 13 casos, sendo que em todos os casos onde o HSV I foi identificado, também ocorreu positividade para o HSV II. Da mesma forma que para o CMV, o número de diagnósticos de HSV, isolado ou em associação, aumentou de 7 para 13/227 após a aplicação da imunoistoquímica (Tabela_3).

A identificação do CMV e do HSV à imunoistoquímica reduziu do número de esofagites inespecíficas (97 para 90/227) e de diagnósticos sugestivos de infecção viral (12 para 8/227). Por outro lado, possibilitou melhor caracterização da concomitância de agentes etiológicos nas esofagites, com associação de agentes virais entre si e/ou com Candida sp (10 para 15/227).

Desta forma, houve redução do número de casos isolados de Candida sp de 60 para 56/227 (Tabela_3). Não foi encontrada imunorreatividade para os antígenos de EBV, HPV e HIV.

As amostras foram representadas por três fragmentos, ou menos (1-3), em 178 (78,5%) dos casos e por mais de três fragmentos (4-6) em 49 (21,5%). A distribuição dos diagnósticos histológicos nos dois grupos não apresentou significância estatística.

DISCUSSÃO O diagnóstico histológico de esofagite foi encontrado nesta série em 92% dos casos. Como citado na maioria das séries(4, 41, 52), a maior parte dos casos é de esofagite grau III (57%).

A esofagite inespecífica foi o diagnóstico histológico mais freqüente entre as 227 biopsias estudadas (39,8%). A maioria destes pacientes apresentava alguma forma de lesão endoscópica, com predominância de úlceras e associação significativa (P = 0,013). A esofagite inespecífica ulcerada também é a forma mais comum nas grandes séries e, apesar do emprego de técnicas mais específicas e sensíveis, como a hibridização in situ, a "polimerase chain reaction" (PCR) e a cultura, estas lesões permaneceram sem a identificação de um agente etiológico(20, 27, 28, 29, 36, 49).

Entre os 209 casos de esofagite, a caracterização de um ou mais agentes etiológicos foi feita em 119 casos (52,3%). Na maior série estudada, BONACINI et al.(4), relatam a identificação de agente etiológico em 65% dos casos.

Entretanto, esses autores utilizaram, além dos exames histológico e imunoistoquímico, a citologia e cultura o que confere maior sensibilidade aos seus resultados.

A esofagite por Candida sp considerada isoladamente ou em associação (70/209 ' 33,5%) foi o agente etiológico mais freqüentemente encontrado. Na literatura, esta forma de esofagite representa cerca de 40% a 80% dos casos contudo, os autores utilizam também a citologia e a cultura, como métodos de diagnóstico(5, 30). Segundo YOUNG and ELIAS(52), o exame citológico tem maior sensibilidade para o diagnóstico de candidíase que o exame histológico (95% e 70%, respectivamente), sobretudo nas formas leves de infecção. Quanto ao aspecto endoscópico, nas esofagites por Candida sp, houve correlação significativa com a presença de placa (P = 0,0001) e de enantema (P = 0,05). BONACINI et al.(4), também encontraram placas associadas ao diagnóstico de candidíase em 88% dos casos. Encontrou-se, ainda, concordância entre o diagnóstico endoscópico e histológico de Candida sp (P = 0,0001). O diagnóstico endoscópico de candidíase e de placa sugere fortemente o diagnóstico histológico de Candida sp.

Em duas grandes séries(4, 14), cerca de 25% dos casos apresentavam a associação de agentes infecciosos, sendo que ocorreram principalmente às custas de Candida sp e de vírus. Na presente série, encontrou-se associação em 6,4% dos casos (15/227), o que talvez se deva ao fato de não se ter realizado escovado e citologia.

Nas esofagites virais, o agente mais comum foi o CMV, considerado isoladamente em 13,2% (30/227) e em associação em 4,3% (10/227), com total de 17,5% (40/ 227). Na literatura o CMV também é o agente viral mais freqüente(4, 14, 51).

THEISE et al.(41), encontraram percentuais de 16% para a H-E e 29% para imunoistoquímica. Esses autores referem ainda que cerca de 20% dos casos negativos para CMV, na coloração de rotina, são positivos na imunoistoquímica.

Nesta série, também foram identificados casos positivos para o CMV à imunoistoquímica que foram normais à histologia e à endoscopia. Observou-se, portanto, que o exame normal não afasta a possibilidade de diagnóstico de CMV pois, mesmo células morfologicamente inalteradas, podem apresentar infecção ativa pelo vírus. Entretanto, a importância clínica desse achado permanece controversa, pois a presença do agente não significa que ele esteja envolvido na patogênese da doença(32). A apresentação endoscópica mais observada foi úlcera, com significância estatística (P = 0,01). Outros dados observados foram a relevância da associação entre diagnóstico endoscópico e histopatológico de CMV (P = 0,045) e a associação significativa entre o diagnóstico endoscópico de CMV e o diagnóstico histopatológico de sugestivo de vírus (P = 0,001). Apesar de a esofagite por CMV ter como forma mais comum de apresentação a lesão ulcerada, também tem sido relacionada à hiperemia ou até mesmo ao aspecto endoscópico normal do esôfago, como observado também nesta amostra(38, 46, 47).

A esofagite por HSV foi encontrada isoladamente em 3,5% e em associação em 2,1% dos casos, com total de 5,6% consistindo na segunda infecção viral mais freqüente. Na literatura a freqüência pode chegar a até 7%(26, 35, 50).

Observou-se predomínio do HSV II em relação ao HSV I e a concomitância das duas infecções em seis casos. Não se identificou infecção por HSV I isoladamente.

Outros trabalhos não fazem distinção entre HSV I e HSV II nas esofagites(20, 42, 43). Entretanto, sabe-se que a infecção por HSV II é encontrada em pacientes com AIDS(17, 22, 34). A associação deste agente viral com erosões únicas ou múltiplas (85,7%) predominou sobre as lesões ulceradas (42,9%), consideradas isoladamente ou em associação. Entretanto não houve significância estatística para esses dados.

Os casos de esofagite associada ao HPV não foram confirmados ao exame imunoistoquímico e passaram a ser considerados como inespecíficos. A literatura se refere a esse tipo de infecção, associada à lesão esofagiana, com relatos de poucos casos(27, 37, 39, 45). Os diagnósticos nessas séries foram confirmados por imunoistoquímica ou PCR.

O diagnóstico de esofagite sugestiva de lesão viral (5,2%) foi separado com o objetivo de identificar um grupo de casos que, dentre os inespecíficos, apresentassem características peculiares ao exame histopatológico de rotina que pudessem defini-lo como de etiologia viral. De fato, ao se empregar método mais sensível como a imunoistoquímica, detectou-se positividade para o CMV em um terço (4/12) desses casos. Embora não tenha sido identificada positividade para agentes virais à imunoistoquímica nos outros casos (8/12), estes permaneceram classificados como esofagite sugestiva de infecção viral por apresentarem os critérios descritos por SCHWARTZ et al.(38).

Não se evidenciou no material da presente casuística imunorreatividade para o EBV nem para o HIV. Existem relatos ocasionais destes agentes na literatura, em pequeno número de casos, que são descritos em lesões esofagianas ulceradas e identificados por métodos como cultura, PCR e microscopia eletrônica(2, 6, 11, 24, 40), que não foram realizados neste estudo.

Outra forma encontrada esporadicamente é a esofagite por micobactérias(17, 21, 23). Os dois (0,8%) casos em que foi diagnosticado este tipo de esofagite estavam associados a úlceras e à avançada imunodepressão, assim como os descritos na literatura(18).

Quanto ao número de fragmentos, este não influenciou na detecção do agente etiológico nos dois grupos: <3 e >3 nos quais foi, respectivamente, de 50% e 48%. Entretanto, em todos os 15 casos com diagnóstico de associação entre agentes infecciosos, o número de amostras foi >3.

CONCLUSÃO A esofagite inespecífica foi a forma mais freqüente de apresentação em pacientes com AIDS, sendo a Candida sp o agente etiológico mais comum das lesões esofagianas e se associa à presença de placas. A esofagite por CMV se associa a úlceras e à endoscopia. O fato do exame endoscópico normal não excluir a possibilidade de esofagite, torna recomendável a realização de biopsias nestes pacientes, além do emprego de técnicas imunoistoquímicas, mesmo diante do exame histológico normal, pois este procedimento auxilia na caracterização de agentes virais como o CMV. O número de fragmentos em uma amostra não contribui para o diagnóstico etiológico das esofagites.