QUANTIFICAÇÃO DOS CLOROANISÓIS POR MICRO
EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) E
CROMATOGRAFIA GASOSA (GC) COM DETECÇÃO
POR ESPECTROMETRIA DE MASSA (MS) EM
MACERADOS DE LOTES DE ROLHAS DE CORTIÇA
OU EM VINHO
INTRODUÇÃO
A rolha de cortiça acompanha o vinho durante a sua evolução na garrafa e está
ligada à conservação e protecção da sua qualidade. Somente a rolha de cortiça
permite a conservação e o desenvolvimento das qualidades aromáticas e
organolépticas dos vinhos (Riboulet e Alegoet, 1986).
No entanto, os "gostos a rolha" ou "a mofo" num vinho estão a converter-se
num dos principais "defeitos" encontrados nos vinhos. O consumidor mostrase cada vez mais sensível e atento a esta questão.
Na maioria dos casos, os compostos responsáveis por estas alterações são
moléculas da família dos cloroanisóis.
Os cloroanisóis são conhecidos desde à algum tempo por serem os responsáveis
de intensos odores "a mofo" em vinhos, cortiça e em muitos outros produtos
(água, café, chocolate, arroz,...). Existe uma grande variedade de derivados
em função do lugar de inserção do cloro no anel benzénico. Entre os compostos
identificáveis nos vinhos encontram-se o 2,4,6-TCA (2,4,6-tricloroanisol) e o
2,3,4,6-TeCA (2,3,4,6-tetracloroanisol), os quais estão associados na maioria
dos casos à presença de odores e gostos a mofo. São estes dois compostos os
que possuem o odor mais intenso e o nível de percepção mais baixo. O PCA
(pentacloroanisol) tem um odor muito menos intenso que os restantes
cloroanisóis (Comunicação pessoal, Riboulet, 1999; Comunicação Pessoal,
Riboulet e Urreizti, 2000).
Os cloroanisóis provêm da metilação dos clorofenóis correspondentes. Estes
foram muito utilizados durante anos como fungicidas no tratamento de madeira
e como desfolhantes. O PCF (pentaclorofenol), fornecido sob a forma de sal,
é um adjuvante na fabricação de papel e no tratamento de couros e telas. A
reacção de metilação é levada a cabo bioquimicamente por um grande número
de microorganismos e em particular por fungos.
Os cloroanisóis podem ter diversas origens, tais como a degradação de certas
moléculas cloradas empregues como insecticidas ou podem ser directamente
sintetizados a partir dos fenóis livres da água os quais reagem com o cloro
utilizado nos tratamentos e/ou desinfecções das adegas.
Todas estas moléculas podem ser analisadas em vinhos, mas também em
diferentes tipos de materiais susceptíveis de contaminar directa ou
indirectamente o vinho (madeira, rolhas de cortiça, atmosfera, água, cartão,
produtos enológicos,...). Estas análises são uma ajuda muito preciosa para
colocar em evidência a existência de problemas e para determinar as suas
causas.
Dependendo do tipo de policloroanisol detectado analiticamente, pode
determinar-se a origem da contaminação. A presença de TCA tende a implicar
a rolha de cortiça, enquanto que os TeCA e os PCA são indicadores de
contaminações ambientais (Comunicação pessoal, Riboulet, 2000).
A análise dos cloroanisóis que a rolha de cortiça pode transmitir para o vinho
constitui para os corticeiros uma ferramenta de controlo rápido e fiável das
rolhas de cortiça compradas ou de lotes de rolhas antes da sua expedição. De
igual modo, e com o objectivo de prevenir o risco do "gosto a rolha", para
os produtores de vinho é também muito importante a análise das rolhas de
cortiça antes do engarrafamento.
Este trabalho apresenta um método de quantificação dos cloroanisóis (TCA,
TeCA e PCA) das rolhas de cortiça extraíveis pelo vinho e é baseado na
maceração de uma amostra do lote de rolhas a avaliar num vinho e a sua
análise por SPME - GC/MS (micro extracção em fase sólida com separação
por cromatografia gasosa e detecção por espectrometria de massa).
A SPME foi introduzida como uma técnica moderna e alternativa para a
preparação de amostras. Esta técnica elimina a utilização de solventes orgânicos,
reduz o tempo de análise e permite a automatização da preparação das amostras.
Além disso, pode acoplar-se com os diferentes tipos de equipamentos analíticos
e aplica-se à extracção de uma vasta gama de moléculas, tais como pesticidas,
aromas e produtos farmacêuticos, assim como à análise de alimentos, águas,
atmosfera e matrizes sólidas (Pawliszyn, 1999; Doneche, 1993).
A detecção por espectrometria de massa é efectuada em modo MS/MS
(espectrometria de massas em sequência) e consiste no armazenamento de um
determinado ião produzido por impacto de electrões (EI) ou ionização química
(CI), com liberação de todos os demais iões. O ião principal assim seleccionado
colide com o gás hélio liberando os iões secundários, que por sua vez atingem
o detector, gerando espectros. A espectrometria de massas em sequência
apresenta diversas vantagens, nomeadamente uma maior selectividade, obtenção
de limites de detecção mais baixos e espectros de melhor qualidade (Silverstein
e Webster, 2000).
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Materiais
1) Vinho de maceração - o vinho de maceração é um vinho branco comum,
acondicionado em embalagem de tipo "Bag in Box". Para controlar a ausência
de cloroanisóis no vinho de maceração antes da sua utilização, analisa-se o
vinho de todas as embalagens.
2) Etanol absoluto e cloreto de sódio, para análise - ACS - ISO.
3) Padrões de referência:
3.1.) 2,4,6-tricloroanisol - d5, fornecido por Cambridge Isotope Laboratories.
3.2.) 2,4,6-tricloroanisol, fornecido por Riedel-de Haën.
3.3.) 2,3,4,6-tetracloroanisol, fornecido por ULTRA Scientific.
-3.4.) pentacloroanisol, fornecido por SUPELCO.
4) Frascos de maceração - para realizar a maceração das rolhas de cortiça
utilizam-se frascos de vidro com tampa em polipropileno. Estes materiais não
fixam os cloroanisóis. Realizou-se um estudo sobre a eficácia da lavagem
destes frascos, e verificou-se que estes estavam isentos de cloroanisóis após
a lavagem.
5) Frascos de armazenamento de amostras - frascos de vidro descartáveis para
evitar contaminações entre as diferentes amostras.
6) Vials - vials de 20 mL apropriados para o combiPAL munidos de cápsulas
magnéticas de abertura larga. Com a finalidade de eliminar possíveis
contaminações entre as amostras, estes frascos são também descartáveis.
Equipamentos
1) CombiPAL - o amostrador automático combiPAL está equipado com um
módulo SPME que permite que a extracção e a introdução das amostras seja
efectuada de maneira automática, contínua e reprodutível.
2) GC/MS - cromatógrafo em fase gasosa VARIAN modelo 3900 GC sobre
o qual está montada uma coluna capilar de baixa polaridade equipado com
detector de espectrometria de massa VARIAN, modelo Saturn 2100 T.
MODO OPERATÓRIO
Maceração das rolhas de cortiça
Hoje em dia, e no que respeita à maceração das rolhas de cortiça, não existe
um método normalizado. O nosso método analisa os macerados obtidos a
partir de rolhas de cortiça inteiras. Este princípio assemelha-se mais ao que
pode ocorrer numa situação real, com uma rolha de cortiça numa garrafa de
vinho. De um ponto de vista enológico, o que interessa é conhecer os
componentes que migram da cortiça para o vinho, ou seja, os compostos
extraíveis (Riboulet, 2001).
Recomenda-se que o número de rolhas postas a macerar seja de 10 ou 20 para
um volume de 500 mL e 1000 mL respectivamente.
Deve levar-se em conta a representatividade das amostras das rolhas de cortiça
que se analisam. O número de amostras e o tamanho de cada uma dependerá
do número de rolhas que compõem o lote em questão e do risco que se está
disposto a assumir na aceitação do lote, ou seja é função do plano de
amostragem escolhido.
Para realizar a maceração, introduzem-se as rolhas de cortiça nos frascos de
maceração previamente passados com o vinho de maceração, e seguidamente
enche-se com o mesmo vinho (figura 1). O tempo de maceração foi optimizado
sendo de 24 horas à temperatura ambiente.
Após as 24 horas, homogeneíza-se o macerado e introduz-se nos frascos de
armazenamento descartáveis.
Preparação da amostra a analisar
Após a maceração, introduz-se uma toma de ensaio de 15 mL para os vials de
20 mL apropriados para o combiPAL, nos quais se havia introduzido NaCl até
saturação, com o objectivo de favorecer a extracção. Seguidamente junta-se a
solução padrão de TCA-d5 e fecham-se os frascos com a cápsula magnética.
Uma vez preparada a amostra, esta é colocada no suporte de amostras do
amostrador combiPAL, para seguidamente ser analisada (figura 2).
Extracção e injecção da amostra
A técnica de extracção e injecção utilizada é a SPME. Esta técnica analítica
é baseada na adsorção e na dessorção de moléculas sobre uma fibra específica
(figura 3).
Com a SPME os cloroanisóis presentes no vinho de maceração fixam-se sobre
um adsorvente específico - fibra de polidimetilsiloxano (PDMS). A adsorção
é realizada a quente e sob agitação (figura 4). Estes compostos são
termodessorbidos no injector do cromatógrafo em fase gasosa (GC) para
seguidamente serem identificados com exactidão e quantificados por
espectrometria de massa (MS). O amostrador automático combiPAL está
equipado com um módulo SPME que permite a extracção e a introdução das
amostras no GC.
-Separação e análise dos compostos injectados
A separação cromatográfica dos compostos é efectuada pela coluna capilar
montada no GC. Na figura 5 mostra-se o cromatograma típico obtido para
uma mistura de cloroanisóis.
Os compostos eluidos são detectados pelo detector de espectrometria de massa
VARIAN, funcionando em modo MS/MS e a quantificação é baseada na
comparação com o padrão interno TCA-d5 e em relação a uma curva de
calibração para cada composto.
Calibração
As soluções padrão para as curvas de calibração dos diferentes cloroanisóis
são previamente preparadas na matriz desejada (vinho, ...). Para esta preparação
utilizam-se soluções padrão de cloroanisóis de 1 µg.L-1 e 10 µg.L-1 preparadas
em etanol absoluto. A calibração engloba uma gama de concentrações entre
0,5 ng.L-1 e 50 ng.L-1.
As curvas de calibração obtidas para os cloroanisóis são caracterizadas pelos
seguintes parâmetros:
2,4,6-TCA:
y = 1,0251x (r2 = 0,99935).
2,3,4,6-TeCA:
y = 1,4001x (r2 = 0,99987).
PCA:
y = 1,3011x (r2 = 0,99981).
-Controlo de qualidade
Sempre que se efectuarem análises sobre séries de amostras (independentemente
do número de amostras), esta deve ser acompanhada de um controle de
qualidade (ensaios em branco e padrões de controlo).
Iniciar a sessão de trabalho com um padrão de controlo e acabar a mesma
também com um padrão de controlo.
Durante a série de amostras deve ser introduzido um ensaio em branco para
detectar possíveis contaminações.
As amostras para as quais um valor anormal é obtido farão objecto de uma
nova análise para confirmação.
Condições operatórias
As condições operatórias deste método estão descritas no quadro I.
Detector de espectrometria de massa
Com o objectivo de obtermos uma melhor sensibilidade, o espectrómetro de
massa funciona em modo MS/MS. A quantificação por MS/MS é baseada na
intensidade do pico do ião secundário após fragmentação do ião principal.
-RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise completa e rápida
Obtemos de modo rápido, sem perda de sensibilidade e sem risco de
contaminação, uma análise completa dos cloroanisóis. Optimizou-se o tempo
global da quantificação dos cloroanisóis, em função dos parâmetros que podem
ter uma influência sobre a qualidade das análises.
Controlaram-se de um modo particular parâmetros como a selecção da fibra,
a qual se escolhe segundo a natureza dos compostos que se querem dosear e
os tempos de extracção e de injecção, para que o ciclo de adsorção-dessorção
se complete e não se contamine a análise seguinte.
Após a análise cromatográfica dos cloroanisóis, o programa de temperatura do
GC elimina aqueles compostos susceptíveis de causar efeitos de memória
(interferência dos compostos da análise precedente sobre a análise em curso).
O tempo de análise foi optimizado sem comprometer a qualidade dos resultados.
Normalmente o material utilizado é de uso único. Nos casos em que não é
possível o uso de material descartável, comprovou-se anteriormente que a
limpeza descontaminou o material completamente.
Limites de detecção
Os limites de detecção foram calculados e têm o valor de 0,2 ng.L-1,
correspondentes a três vezes a concentração do ruído de fundo (Krull e Swartz,
1998).
Repetibilidade
Estudou-se a repetibilidade do método para uma concentração entre 5 e 6
ng.L-1 para cada um dos três compostos.
Os valores obtidos para o coeficiente de variação (CV) para cada um dos
compostos vêm detalhados no quadro II.
Estudos em perspectiva
Embora este método esteja optimizado para as condições descritas acima, é
aconselhável levar a cabo um estudo no sentido deste método poder ser
empregue com maior abrangência.
Líquido de maceração
No que respeita à maceração das rolhas de cortiça, um estudo está a ser
efectuado no sentido de verificar a eficácia da extracção quando esta é realizada
com diferentes tipos de vinhos, nomeadamente o teor em álcool, bem como
quando se utiliza como líquido de maceração uma solução alcoólica com
diferentes teores em álcool.
Condições de maceração
As condições de maceração estão também a ser alvo de um estudo,
nomeadamente a temperatura de maceração e efeito da agitação (ou mesmo
ultra sons) sobre a eficácia da extracção.
Tempo antes de análise
Após preparação das amostras nos frascos de headspace, é também importante
estudar a sua estabilidade em função do tempo decorrido antes de análise.
CONCLUSÕES
O método SPME - GC/MS é uma importante ferramenta analítica para a quantificação
dos cloroanisóis eventualmente presentes nas rolhas de cortiça e susceptíveis de
contaminar o vinho. Permite avaliar de maneira rápida e fiável se uma percentagem
elevada de indivíduos de um lote de rolhas de cortiça podem apresentar um risco de
produção de "gosto a mofo".
O seu elevado grau de automatização reduz os custos das análises de tal modo que
permite o controlo sistemático dos lotes de rolhas de cortiça.
Por outro lado, esta técnica pode ser complementado com testes sensoriais sobre
macerados em água.
A única limitação do método é a representatividade das amostras quando se efectua
a amostragem.
