Crescimento de mudas de tomateiro (Solanum lycopersicum) estimulado pela
bactéria Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 em cultura orgânica
Introdução
O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é cultivado no mundo inteiro e possui
grande relevância econômica e social (FAOSTAT, 2010). É altamente
industrializado, nas formas de suco, molho, pasta, e desidratada (FAOSTAT,
2011). Além de ser um alimento funcional devido aos altos teores de vitaminas
A, C e licopeno (Carvalho e Pagliuca, 2007).
A qualidade dos alimentos (frescos ou processados) vem sendo considerada fator
de segurança alimentar e nutricional, relacionada não só a produção em
quantidades suficientes e acesso garantido, mas também à promoção do estado de
saúde daqueles que os consomem (Souza e Resende, 2006), impulsionando o mercado
de produtos orgânicos, com destaque para o tomate (Toledo et al., 2011).
Na cultura do tomateiro, a produção de mudas é uma das etapas mais importantes
(Silveira et al., 2002). De acordo com Minami (1995), 60% do sucesso de um
cultivo depende do plantio de mudas de boa qualidade. Assim, ganham importância
as técnicas que promovam o crescimento adequado das mudas, especialmente no
sistema orgânico, dependente de insumos alternativos, como o uso de
microrganismos benéficos.
Na literatura, são descritas algumas bactérias que vivem associadas às plantas
e têm a habilidade de promover o crescimento vegetal (Compant et al., 2010).
Espécies do gênero Bacillus vêm sendo utilizados para este fim: Mena-Violante e
Olalde-Portugal (2007) verificaram efeitos positivos em frutos de tomate, como
o aumento do tamanho e melhoria da textura mediante o uso de B. subtilis; Silva
et al. (2008) aplicando B. pumilus observaram incrementos na altura das plantas
de tomateiro nos estágios iniciais do desenvolvimento. Estudos com Bacillus
megaterium (Harthmann et al., 2010) e com Bacillus cereus (Harthmann et al.,
2009) inoculados em sementes mostraram a possibilidade, inclusive, de
incrementos de produtividade, pois comprovaram a campo o aumento do rendimento
de bulbos de cebola.
A estirpe FZB42 de Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum vem sendo
intensamente estudada, teve seu genoma sequenciado e por sua constituição,
revelou um potencial para produzir metabolitos secundários, sendo mais de 8,5%
do genoma dedicado a síntese de antibióticos e sideróforos (Chen et al., 2007).
Seu filtrado promoveu o crescimento de coleóptilos de milho, devido à produção
de bioativos como o ácido-indol-acético (Idris et al., 2004), e a aplicação de
solução de esporos desta estirpe em sementes de tomate proporcionou acréscimos
no rendimento de frutos em torno de 8 a 9% (Gül et al., 2008).
No presente trabalho, inoculou-se a bactéria B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum FZB42 em sementes de duas cultivares de tomateiro (Santa Clara' e
Cereja'), com o objetivo de verificar seu efeito na germinação e na produção
de mudas em sistema orgânico, além de investigar características bacterianas
relacionadas à promoção do crescimento vegetal.
Material e Métodos
Utilizou-se a bactéria B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (Omex®
Agrifluids do Brasil Ltda), isolado de solo (Krebs et al., 1998) e depositado
como estirpe 10A6 na coleção de culturas Bacillus Genetic Stock Center (BGSC,
Ohio, E.U.A.).
As cultivares de tomateiro de crescimento indeterminado empregadas foram:
Cereja 261' (Isla®), ciclo de 90 dias; e Santa Clara I-5300' (Isla®) com
ciclo de 110 dias. A empresa fornecedora de sementes (sem tratamento químico)
garantiu 84% de germinação e 100% de pureza para ambas as cultivares.
Testes bioquímicos na bactéria
A quantificação de compostos indólicos foi determinada em meio líquido
enriquecido com triptofano e utilizando o reagente de Salkowski segundo
Szilagyi-Zecchin et al. (2014). A concentração dos compostos foi estimada por
curva-padrão com quantidades conhecidas de acido indol acético (Sigma-Aldrich®)
que variou entre 0 e 30 µg/mL de acordo com a equação y = 0,0057 x (R2 = 1). E
como controle positivo utilizou-se Azospirillum brasilense Ab-V5.
Para produção de sideróforos, usou-se o método colorimétrico universal de
Schwyn e Neilands (1987) de acordo com as adaptações de Szilagyi-Zecchin et al.
(2014).
Teste de germinação
As sementes foram inoculadas com a solução de FZB42 na concentração de 1x1011
UFC/mL, sem prévia assepsia. Em seguida deixadas para secar à sombra sobre
folhas de papel toalha.
Logo após, as sementes foram acomodadas em caixas plásticas transparentes (tipo
Gerbox) sobre duas folhas de papel (mata-borrão) umedecidos com quantidade de
água equivalente a 2,5 vezes o peso do papel seco (Brasil, 2009). E mantidas em
estufa incubadora com fotoperíodo e termoperíodo (B.O.D.) a 25 °C, sem
aplicação de fotoperíodo. A avaliação contabilizando o número de plântulas
normais e de plantas germinadas ocorreu aos 10 dias após semeadura.
O delineamento foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 2 (dose de
bactérias x cultivares de tomate). Possuindo 4 repetições de 100 sementes para
cada cultivar, onde cada caixa era uma sub-repetição com 50 sementes.
Os tratamentos foram compostos das porcentagens da solução de FZB42, em volume
de soluções aplicadas às sementes, sendo: (Testemunha) 100% de água destilada;
(T1) 20% de FZB42 e 80% de água destilada; (T2) 80% de FZB42 e 20% de água
destilada. As soluções corresponderam ao volume de 320 uL/g de sementes. A
estimativa teórica de bactérias por semente para T1 e T2 foi de 1,6x105 e
6,4x106 respectivamente.
Após 10 dias avaliou-se o número de sementes germinadas e de plântulas normais.
Nas plântulas consideradas normais a parte aera foi separada da raiz e foi
mensurado: o comprimento (cm) e volume (cm3) de raiz e parte aérea, por meio do
software Win-rhizo®v. 4.0, acoplado a um Scanner LA1600 (Regent Systems,
Quebec, Canadá) na resolução 150 dpi (Dots Per Inch ou Pontos Por Polegada).
Produção de mudas
A semeadura foi realizada em bandejas de poliestireno expandido, com 200
células, com volume unitário da célula correspondente a 18 mL. Estas foram
preenchidas com, substrato comercial recomendado para a cultura, preparado com
composto de cama de aviário (Provaso®) e casca de pinus compostada (Vida
Verde®) na proporção de 0,5:3,5 p/p.
As sementes foram inoculadas como descrito acima no teste de germinação e
imediatamente semeadas. Distribuiu-se duas sementes por célula na profundidade
de 1 cm. Após a germinação procedeu-se o desbaste. As mudas foram mantidas em
casa vegetação com irrigação temporizada, na Área experimental de Olericultura
Orgânica da Universidade Federal do Paraná (UFPR), no município de Pinhais-PR,
durante o mês abril de 2013.
Em delineamento inteiramente casualizado, cada tratamento foi composto de 7
repetições com 40 células cada, e uma planta por célula.
Foram coletadas aos 33 dias após a semeadura, oito plantas centrais por
repetição para a avaliação das seguintes variáveis biométricas: volume
radicular (VR) expresso em cm3; comprimento total de raízes (CTR) em cm,
resultante da somatória dos comprimentos individuais das raízes; massa seca de
raiz (MSR) expressa em g; área da parte aérea (APA) em cm2 e massa seca da
parte aérea (MSPA) em g. Para a obtenção do VR, CTR e APA as amostras foram
analisadas por meio do programa computacional WinRhizo®. As folhas foram lidas
na resolução de 50 dpi e as raízes a 150 dpi. Para massa seca (raiz e parte
aérea) estes foram levados à estufa com circulação de ar forçada, à temperatura
de 65 0oC por 72 horas e em seguida pesados em balança de precisão analítica.
Determinação de clorofilas nas mudas
A determinação dos teores de clorofila foi realizada segundo Lichtenthaler
(1987), utilizando todas as folhas das mudas (exceto as cotiledonares), de seis
plantas por repetição. A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 663 e 647
nm. Posteriormente, os valores foram transformados e expressos em mg de
clorofila por g de material vegetal.
Os dados foram testados quanto à sua normalidade pelo teste de Kolmogorov-
Smirnov e quanto à homogeneidade de variâncias, por Bartlett. Em seguida
submetidos à análise de variância, e as médias foram comparadas pelo teste de
Tukey, a 5% de significância no programa Assistat®7.6 Beta (Silva e Azevedo,
2002).
Resultados e Discussão
A estirpe de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 produziu nas condições
testadas 7,79 µg/mL de compostos indólicos enquanto que o controle A.
brasilense produziu 31,42 µg/mL. FZB42 já foi descrita como produtora de
compostos indólicos tais como, ácido indol acético e indol-3-acetonitrila, em
outras condições de cultivo e por meio de diferentes métodos (Idris et al.,
2004).
No presente trabalho, FZB42 secretou sideróforos, in vitro, em meio sólido. Já
era conhecido que B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 possuia potencial
para produzir metabolitos secundários, pois mais de 8,5% do genoma é dedicado a
síntese de antibióticos e sideróforos (Chen et al., 2007). Os sideróforos tem
importância para as bactérias por suprirem a necessidade de ferro do próprio
microrganismo, e para a sobrevivência no ambiente competitivo do solo (Khan et
al., 2006).
Os tratamentos não alteraram significativamente o percentual de germinação
informado no rótulo, pelo fornecedor das sementes das duas cultivares. A
quantidade de plântulas anormais, não diferiu entre os tratamentos, nem entre
cultivares (dados não mostrados). A inoculação com FZB42 a 20% promoveu o
aumento do volume da parte aérea das plântulas, exclusivamente da cv Cereja',
enquanto a dose de 80% reduziu o volume e comprimento da radícula e da parte
aérea das duas cultivares (Figura_1).
Schlindwein et al. (2008), trabalhando com diferentes espécies de rizóbios em
alface, verificaram que o percentual de germinação e a quantidade de plântulas
normais também não foram influenciadas, exceto por Rhizobium
leguminosarumbiovar trifolii, que levou ao desenvolvimento de plântulas
anormais com taxa de crescimento reduzido. No entanto, pode-se verificar
influencias negativas sobre a germinação, como detectado por Miché et al.
(2000) estudando duas estirpes de A. brasilense, estas impediram a germinação
de sementes de striga (Striga hermonthica), uma planta daninha, parasita
obrigatório de cereais tropicais. Em contrapartida, existem trabalhos que
relatam na germinação, estímulos positivos proporcionados por bactérias ao
serem inoculadas nas sementes: Cassán et al. (2009) detectaram aumentos no
percentual de germinação e no crescimento das plântulas de soja e milho quando
inoculadas com A. brasilense e Brayrhizobium japonicum sozinhos ou combinados;
e Szilagyi-Zecchin et al. (2014) trabalhando com Bacillus sp. e Enterobactersp.
em milho verificaram aumento na germinação e no volume radicular das plântulas.
Na produção de mudas houve incrementos na área da parte aérea das duas
cultivares com uso de FZB42 a 20%. Na cultivar Cereja' FZB42 a 80%, houve
redução da área em relação à testemunha (Quadro_1). A massa seca da parte aérea
foi significativamente incrementada no tomate Santa Clara' com FZB42 a 20%, já
FZB42 a 80% influenciou diminuindo a massa seca das duas cultivares.
Uma parte aérea maior permite uma melhor taxa fotossintética, que implica em
mais fotoassimilados translocados para os órgãos em crescimento ou de reserva
nos estádios seguintes (Taiz e Zeiger, 2004). Este aumento da parte aérea pode
estar relacionado com a habilidade da bactéria estudada em produzir compostos
indólicos. Alguns estudos demonstraram que Bacillus produtores de auxina trazem
benefícios para a parte aérea do tomateiro, aumentando a altura, calibre e peso
fresco de parte aérea de mudas (Domenech et al., 2006). Até mesmo quando a
auxina bacteriana foi isolada, purificada e aplicada em mudas de tomate
incrementaram em mais de 20% a parte aérea (Lim e Kim, 2009).
A inoculação de FZB42 testada contemplou duas quantidades de bactérias (T1 =
1,6x105 e T2 = 6,4x106 UFC/semente), o aumento da parte aérea ocorreu em T1, já
em T2 um efeito oposto ocorreu nas mesmas variáveis, reafirmando um possível
excesso de dose, com base no teste de germinação descrito acima.
Nas raízes das mudas, o volume e a massa seca foram inferiores a testemunha,
quando inoculado com FZB42 a 80%. Enquanto FZB42 a 20% não diferiu da
testemunha, para as três variáveis radiculares avaliadas (Quadro_2).
Essas diferenças podem estar relacionadas a uma entrada adicional de compostos
indólicos produzidos pela bactéria, que modifica as quantidades endógenas na
planta, para um nível ótimo ou acima do ótimo, resultando na indução ou
inibição do crescimento vegetal (Patten e Glick, 1996). As raízes necessitam de
uma concentração menor de compostos indólicos para crescer, e seu crescimento,
pode ser inibido por concentrações que promovam o alongamento de caules e
coleóptilos (Taiz e Zeiger, 2004).
Os teores de Cl a, b e totais foram superiores estatisticamente nas duas doses
de bactéria em Santa Clara', enquanto para Cereja', somente FZB42 a 80%
aumentou os níveis de clorofilas significativamente (Figura_2). Em média, nas
duas cultivares há uma relação crescente entre os teores de clorofila e a
quantidade de bactéria aplicada. As clorofilas estavam presentes em maiores
teores nos tratamentos inoculados, mas com aumentos mais expressivos para a
aplicação de FZB42 a 80%. Indicando que houve mais estimulo para produção de
clorofila conforme o aumento da dose da bactéria, dentro dos limites testados.
Este padrão de resposta pode estar relacionado à produção de sideróforos pela
bactéria. Pois, a planta aproveita estes compostos como quelantes orgânicos,
que acabam a beneficiando, por disponibilizar o ferro para ser prontamente
absorvido (Powell et al., 1980). Alguns exemplos deste mesmo mecanismo já foram
observados em outras culturas. Uma delas, feijão mungo (Vigna radiata L.)
inoculado com Pseudomonas sp., produtora de sideróforos, e submetido a
diferentes doses de ferro. Como resultado, teve suas quantidades de clorofilas
a, b e totais aumentadas em 34, 48 e 39%, pois a bactéria melhorou a
disponibilidade de ferro para a planta (Sharma et al., 2003). Similarmente,
Pseudomonas putida reduziu a clorose induzida por deficiência de ferro em
amendoim (Arachis hypogaea L.) (Jurkevitch et al., 1988).
Em todas as variáveis biométricas da produção de mudas, as respostas foram
numericamente superiores no T1 (FZB42 20%) se comparadas ao T2 (FZB42 80%), e
na maior parte delas (massa seca de raiz, área e massa seca da parte aérea),
foram diferentes estatisticamente. Indicando que entre as doses, a menor,
proporcionou resultados mais vantajosos para a produção de mudas orgânicas de
tomateiro.
A variável mais responsiva à inoculação, dentre as testadas, foi a área da
parte aérea. Nesta variável, a cultivar Santa Clara' respondeu positivamente
com mais intensidade na menor dose de FZB42, mostrando aumento de 47,74%,
enquanto a Cereja', apresentou aumento de 15,54 %, ambos comparados à
testemunha. Esta diferença indica resposta variável em função do genótipo, uma
vez que as cultivares pertencem a grupos distintos. Interações entre bactérias
e genótipos foram relatados por outros autores. Lemos et al. (2013),
verificaram entre cinco cultivares de trigo com inoculação de A. brasilense,
apenas uma se destacou, enquanto Ferreira et al. (2014), verificaram que entre
seis cultivares de arroz, apenas uma apresentou interação com diversas estirpes
bacterianas, com diferença significativa em relação ao crescimento da parte
aérea.
Conclusões
A bactéria Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, produtora de
compostos indólicos e sideróforos, aumentou os teores clorofila a, be totais e
promoveu o crescimento da parte aérea de mudas de tomateiro das cultivares
Santa Clara' e Cereja', na dose de 20% da solução inoculante, correspondendo
a 1,6x105 bactérias/semente.
