Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens
dos métodos existentes
INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de metodologias e estudos comparativos de metodologias
espectrofotométricas para a determinação de proteínas totais sempre foram de
grande interesse para profissionais, tanto ligados à indústria de alimentos,
laboratórios de análises clínicas, como para pesquisadores de diversas áreas.
Apesar de os profissionais serem de diferentes áreas e, portanto, com objetivos
diferentes, observamos que os questionamentos são sempre os mesmos: Quais são
os principais interferentes no método que estou usando? Qual é o método mais
adequado para meu caso? Qual é o princípio envolvido no método que estou
usando?
Esta revisão, portanto, tem por objetivo abordar diversos aspectos dos métodos
espectrofotométricos utilizados para a determinação de proteínas totais em
diferentes meios.
As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos
processos biológicos, atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores,
transportadores através das membranas celulares e outros1,2.
O desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas tem, cada vez mais,
se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento, como por
exemplo, em análises clínicas1, favorecendo o diagnóstico de certas doenças
correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos
biológicos; em nutrição animal3, ressaltando o aproveitamento racional de
nutrientes; em problemas relacionados à nutrição humana1,4,5, como obesidade,
anorexia nervosa, desnutrição, devendo as dietas apresentar teor balanceado de
proteínas; em tecnologia e ciências de alimentos6, objetivando o aproveitamento
racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes;
em ecologia7, relacionando o comportamento alimentar com a quantidade de
proteína ingerida dos alimentos, favorecendo o entendimento dos vários aspectos
da vida dos animais silvestres; e na área de química de proteínas objetivando
purificar novas proteínas e enzimas8.
Estas são apenas algumas das mais importantes aplicações analíticas para
metodologias de determinação de proteínas totais; obviamente, existem muitas
outras de grande relevância.
Os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais são muito
variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas são as
espectrofotométricas no ultra-violeta e no visível (UV-Vis).
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS MAIS UTILIZADOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
TOTAIS
Muitos métodos espectrofotométricos, ao longo dos anos, têm sido propostos para
a determinação de proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada
de uso universal para todos os meios. Os métodos geralmente mais utilizados são
o do biureto9, de Lowry10, do "Coomassie brilliant blue" BG-250 ou
reagente de Bradford11, do BCA ou reagente de Smith12, e de absorção de
proteínas no ultravioleta13. A seguir serão discutidas as vantagens e
desvantagens destas cinco metodologias.
O MÉTODO DE BIURETO
Princípio
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de
Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificações do
mesmo, sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols9. a mais
utilizada.
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma
mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre
em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols.9. O
cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado
planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de
absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm
aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda na
região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas
substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na
região de 270 nm causando muita interferência no método.
Aplicações
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de
proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma
sangüíneo15,16,18,19, líquido cérebro espinhal (líqüor)20,21, urina22-24,
alimentos25-29, saliva30, fibrinogênio31 e tecido animal32. O método de biureto
tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo19, assim como em
alguns métodos cinéticos21,33. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de
baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para
diferentes proteínas9,20,21,30, este método não é muito sensível, como foi
destacado por diversos autores20,24,30, colocando-o em grande desvantagem, em
relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos,
substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto
continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas
totais em plasma sangüíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por
diversos autores15,16,34, bem como para a determinação de proteínas totais em
saliva30 e leite29, quando comparado com outros métodos.
Interferentes
Verifica-se que o método de biureto está sujeito à interferência de substâncias
que possam reagir com os íons cobre (II). Na tabela_1 estão listados alguns
interferentes; os métodos para sua eliminação variam conforme o caso, como
discutido nas referências citadas nessa tabela, no entanto, recomendamos a
precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e posterior solubilização
para determinação das mesmas.
O MÉTODO DE LOWRY
Princípio
O método que atualmente conhecemos como de Lowry e cols.10, para a determinação
de proteínas totais, foi originalmente proposto por Wu35, em 1922, sendo esta a
metodologia mais utilizada para a determinação de proteínas. O princípio do
método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico,
(reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas,
na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima
em 750 nm.
Chou e Goldstein36 e Legler e cols.37 estudaram extensivamente o mecanismo de
redução do reagente de Folin-Ciocalteau por proteínas, peptídeos ou
aminoácidos. Estes autores36,37 sugerem que esta redução ocorra diretamente
através das cadeias laterais de alguns aminoácidos (tirosina, triptofano,
cisteína, asparagina e histidina), que contribuem com quatro elétrons, ou
através da retirada de dois elétrons de cada unidade tetrapeptídica dos
peptídeos e proteínas, que é facilitada pela formação do quelato entre o cobre
(II) e peptídeos/proteínas.
Aplicações
A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por isto,
tem sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas totais em
diversos meios, sendo eles: líqüor20,38, plasma sangüíneo34,39,40, saliva
humana30, tecido animal32,41-43, plantas44-46, suco biliar47, membranas48-50,
leite humano28,51 e produtos alimentícios52. Sargent53 propôs uma modificação
no método de Lowry que possibilitou o aumento da sensibilidade em cinqüenta
vezes. Tal modificação está baseada no fato de que o verde de malaquita reage
com o azul de molibdato produzido no método de Lowry e o produto desta reação
absorve fortemente em 690 nm aumentando a sensibilidade do método de Lowry.
Devido ao seu extenso uso, o método de Lowry e cols.10 tem sido utilizado em
diversos tipos de equipamentos automatizados43,54-57.
Em estudos comparativos de métodos, alguns autores recomendam a utilização da
metodologia proposta por Lowry e cols.10 para determinar proteínas totais em
líqüor38, tecido animal41 e tecido vegetal45. Os autores38,41,45, de maneira
geral, recomendam o método de Lowry, pois no estudo comparativo de metodologias
o mesmo mostrou-se mais sensível, com melhor exatidão, menor consumo de amostra
e, dependendo do caso, menos suscetível a alguns tipos de interferentes.
Interferentes
Apesar do método de Lowry e cols.10 apresentar uma grande sensibilidade para
proteínas, o mesmo possui algumas desvantagens, tais como: estar sujeito a
muitos interferentes, apresentar longo tempo de análise, possuir absortividade
específica altamente variável para diferentes proteínas, e seguir a Lei de
Beer-Lambert apenas numa pequena faixa de concentração de proteínas.
Várias modificações no método de Lowry têm sido propostas para resolver os
problemas acima citados. Para aumentar a velocidade da reação, Shakir e cols.58
recomendam aquecer a amostra, por 3 minutos, a 37°C, após a adição de sulfato
de cobre alcalino, e por mais três minutos, após a adição do reagente de Folin-
Ciocalteau. Larson e cols.59 recomendam a adição de tri-1,4-
dimercaptobutanodiol, 3 minutos após a adição do reagente Folin-Ciocalteau, com
o objetivo de aumentar a velocidade de reação e eliminar a etapa de 30 minutos
de espera. Alam60 propõe um rígido controle do pH para diminuir o tempo de
análise, estabilizar o produto formado e uniformizar as absortividades
específicas das diferentes proteínas.
Hartree61 fez várias modificações no método de Lowry melhorando a faixa de
linearidade e uniformizando as absortividades específicas para algumas
proteínas; estas modificações61 são as mais utilizadas, apesar de tornar o
método de Lowry mais trabalhoso no preparo dos reagentes.
Stauffer62 recomenda a construção do gráfico de log Abs versus log microgramas
de proteína e Hess e cols.63 recomendam o uso de alta concentração do reagente
Folin-Ciocalteau. Tais procedimentos, segundo estes autores, diminuem o tempo
de análise, uniformizam as absortividades específicas para algumas proteínas e/
ou aumentam a faixa de linearidade do método de Lowry e cols.10.
Diversas substâncias interferentes no método de Lowry são citadas na
literatura; estas normalmente causam aumento na absorbância do branco,
diminuição da absortividade específica ou formação de algum tipo de
precipitado. Os interferentes mais comuns estão listados na tabela_2, tendo-se
ainda, como fonte de consulta, uma lista preparada por Bensadoun e Weinstein64.
Para a eliminação da maioria dos interferentes citados na tabela_2, sugere-se a
precipitação das proteínas utilizando-se: ácido tricloroacético e co-
precipitantes42,64,65, misturas de metanol-clorofórmio-água48 ou hexano-
isopropanol49. Se o interferente for composto de enxofre, como mercaptanas, por
exemplo, aconselha-se o uso de iodo acetato66 ou a secagem a vácuo da
amostra67, se for lipídeo ou melanina sugere-se a adição de
detergentes41,68,69. Verifica-se que a reação de Lowry é fotossensível70
recomendando-se exposição uniforme de luz aos tubos.
Apesar de todos os esforços para melhorar o método de Lowry, isto é, diminuir o
tempo requerido para a análise, aumentar a faixa de linearidade para a lei de
Beer e tornar mais homogênea as absortividades específicas para diferentes
proteínas, o mesmo continua moroso e sujeito a inúmeros interferentes e, nos
últimos anos, está sendo substituído por outros métodos, tais como, o método de
Bradford e o método de Smith ou do BCA.
O MÉTODO DE BRADFORD
Princípio
O método de Bradford11 é uma técnica para a determinação de proteínas totais
que utiliza o corante de "Coomassie brilliant blue" BG-250.
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de
proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No
pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante
BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica,
que absorve fortemente em 595 nm76.
Aplicações
O método de Bradford11, é mais rápido e sensível que o de Lowry e cols.10 e tem
sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios:
plasma ou soro sangüíneo34,39, líqüor20,77-81, saliva humana30, produtos
alimentícios82, leite humano28,29,83, tecidos de plantas44,45, suspensões de
células84-86, avidina e estreptavidina87, urina22,24,79,88-90 e detergentes91.
Alguns autores recomendam o método de Bradford para a determinação de proteínas
totais em leite humano83, líqüor80 e urina24. No entanto, com relação à urina,
diversos autores destacam dois fatores contra a utilização desta metodologia,
sendo um deles a dependência entre o número de diluições da amostra e o
resultado da concentração de proteína obtido e, o outro, a presença de
proteínas de baixo peso molecular, subestimando a concentração de proteínas
totais na urina, principalmente, de pacientes com proteinúria22,88-90,92-96.
Algumas metodologias utilizando equipamentos automatizados80,97-101 estão
tornando este método mais rápido.
Interferentes
Apesar do método de Bradford11 ser mais rápido, sensível e estar sujeito a um
número bem menor de interferentes que o método de Lowry e cols.10, o mesmo
apresenta algumas desvantagens, tais como a variação da absortividade
específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade75,102 ou
baixo peso molecular das mesmas22,88-90, e fornecimento de resultados nem
sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia
conforme a procedência, sendo recomendável a padronização das condições de
reação para cada lote de corante adquirido.
Para tentar tornar mais uniforme a absortividade específica de diferentes
proteínas, algumas alternativas foram sugeridas: aumentar a concentração do
corante103; aumentar a solubilização das proteínas que vão reagir com o
corante, usando detergentes24,79,84,86,104-106, hidróxido de sódio84,107 ou
fenol108; ou aquecer com uréia e 2-mercaptoetanol109. Entretanto, no caso de
amostras com proteínas de baixo peso molecular, não recomendamos a utilização
deste método.
A falta de linearidade na lei de Beer-Lambert11,107,110 tem sido, também,
observada devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente
BG-250.
Existem poucas substâncias, citadas na literatura, que são interferentes no
método de Bradford. Estes interferentes normalmente reagem com as proteínas
impedindo a reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando
aumento na absorbância. A tabela_3 mostra os interferentes mais comuns ao
método de Bradford11. Os métodos de eliminação destes interferentes variam
conforme o caso, como discutido nas referências citadas nessa tabela, no
entanto, recomendamos a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético.
O MÉTODO DE SMITH OU BCA
Princípio
O método proposto por Smith e cols.12, também conhecido por método do ácido
bicinchoninico (BCA 4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina), se baseia na reação de
cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um
complexo com o BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm.
No entanto, Legler e cols.37, estudando o papel catalisador do cobre, em meio
alcalino, na reação entre proteínas e o reativo de Folin-Ciocauteau, detectaram
formação de um intermediário de cobre (III) com peptídeos, porém não detectaram
cobre (I), como estabelecido por Smith e cols.12, devendo, portanto, ser este
mecanismo melhor estudado para se estabelecer qual ou quais intermediários de
cobre são formados.
Aplicações
Este método tem a vantagem de ser mais simples no preparo dos reagentes, tão
sensível quanto o método de Lowry e cols.10 e relativamente rápido, sendo
aplicado na determinação da concentração de proteínas totais em saliva30,
proteínas celulares41,113, interferons75, leite humano28 e determinação de
grupos funcionais114.
O método de Smith e cols.12 tem sido recomendado em estudos de comparação de
metodologias para a determinação de proteínas totais em leite humano28 e
células113. Esta metodologia também tem sido adaptada para a determinação de
proteínas totais utilizando-se equipamentos automatizados115,116.
Interferentes
O método de Smith e cols.12 possui algumas desvantagens, como a dependência da
temperatura de incubação das amostras12,115, a variação da absortividade
específica para diferentes proteínas30,75,115 e a variação da absorbância com o
tempo. Recomendamos, portanto, um rígido controle no tempo de leitura das
amostras, após a incubação das mesmas.
Os interferentes, em potencial, do método de Smith e cols.12 são aquelas
substâncias que reagem com os íons cobre (reações de óxido-redução, formação de
complexos, precipitação) ou com o reativo de BCA. A tabela_4 mostra os
interferentes mais comuns no método de Smith e cols.12. Os métodos de
eliminação destes interferentes variam conforme o caso, como discutido nas
referências citadas nessa tabela; em muitas situações recomendamos a
precipitação das proteínas com ácido tricloroacético.
MÉTODO DE ABSORÇÃO NO ULTRA-VIOLETA
Princípio
Este método é baseado no fato de que as proteínas mostram absorção na região de
280 nm e na região abaixo de 220 nm, sendo a primeira devido a diversos
aminoácidos (fenilalanina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, histidina
e tirosina), e a segunda devido à ligação peptídica13. No entanto, em 280 nm,
em pH neutro, somente os aminoácidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma
absortividade molar significativamente grande119,120.
Aplicações
O método tem sido muito utilizado durante os procedimentos de purificação e
separação de proteínas13 para a quantificação das mesmas. Suas principais
vantagens são as de não destruir a amostra e de ser rápido; na literatura
raramente são descritas outras aplicações além desta. O principal motivo desta
limitação é que, em amostras complexas, diversas substâncias absorvem no ultra-
violeta tornando os resultados pouco confiáveis.
Interferentes
Este método está sujeito a muitos interferentes, sendo que qualquer substância
que apresente uma banda de absorção na região de leitura é um interferente em
potencial. Este fato fez com que esta metodologia fosse utilizada somente em
processos de purificação de proteínas, onde uma avaliação semi-quantitativa é
suficiente, na maioria dos casos.
Os métodos discutidos acima são os mais utilizados, porém, como estão sujeitos
a limitações, a todo o momento continuam aparecendo, na literatura,
modificações das metodologias já existentes, além de propostas de novas
metodologias, que serão discutidas a seguir.
NOVOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
Zaia e cols.121-124 propuseram uma metodologia básica utilizando p-benzoquinona
(PBQ), para a determinação de proteínas em diversos meios. O método se baseia
no fato de que o produto de reação entre PBQ e proteínas absorve em 350 nm.
Esta metodologia mostrou-se 10 vezes mais sensível que o método de biureto124,
de menor custo que o de Lowry e cols.123, e mais rápida que os métodos de Lowry
e Kjedahl122,123. Zaia e cols.121 propuseram, ainda, uma metodologia inédita
que possibilita, em uma única análise, determinar simultaneamente proteínas e
aminoácidos, pois o produto de reação PBQ/proteína absorve em 350 nm e o
produto de reação PBQ/aminoácidos absorve em 480 nm. Uma outra quinona, o
cloranil, foi utilizada por Rahim e Al-Ghabsha125, para a determinação de
proteínas totais.
Krystal e cols.126,127 propuseram uma metodologia que é 100 vezes mais sensível
que o método de Bradford11. Este método está baseado no fato de que prata
amoniacal liga-se a proteínas e o produto de reação absorve fortemente em 420
nm.
Stoscheck128 propôs uma metodologia que é 25 vezes mais sensível que o método
de Bradford11 e 50 vezes mais sensível que o de Lowry10. Neste método, o ouro
coloidal, na presença de proteínas, desloca o seu máximo de absorção de 535
para 595 nm. Segundo a autora o método está sujeito a poucos interferentes.
Estas metodologias que utilizam ouro coloidal ou prata amoniacal, possuem um
inconveniente óbvio que é a utilização de reagentes caros; no entanto, Krystal
e cols.126 afirmam que o custo de 10 análises em triplicata é menor que dois
centavos de dolar.
Soedjak129 propôs uma metodologia em que o eritrosin B reage com proteína
formado um cromóforo que absorve fortemente em 545 nm. A sensibilidade desta
metodologia está entre 2 e 14 µg/mL de proteína, que é a mesma sensibilidade do
método proposto por Zaia e cols.121.
O método da ninhidrina130 tem sido utilizado para a determinação de proteínas
totais30,44,75. Nesta metodologia, as proteínas são submetidas à hidrólise
ácida, sendo os aminoácidos liberados determinados com ninhidrina. A
desvantagem desta metodologia é o tempo gasto na hidrólise ácida, nos métodos
comumente utilizados.
CONCLUSÃO
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para
a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o
conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da amostra
e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação dos
possíveis interferentes e conseqüentemente ajudará na escolha do método mais
apropriado para cada situação.
Outros fatores, também importantes, são a sensibilidade necessária, que é
dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra
disponível; a rapidez e o custo da metodologia; e, não menos importante, o grau
de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método
escolhido.
Temos observado que muitas vezes a escolha de uma metodologia para a
determinação de proteínas totais é feita com base na popularidade de um
determinado método e isto acontece em parte devido à falta de trabalhos de
comparação de metodologias. Portanto, acreditamos que muitos trabalhos deste
tipo devam ainda ser desenvolvidos principalmente nas áreas de análises
clínicas, ciências e tecnologia de alimentos.
