CRESCIMENTO E OXIDAÇÃO DE EXPLANTES DE BANANEIRA PRATA (Musa AAB) IN VITRO: IV.
CONCENTRAÇÕES DE SAIS, ÁCIDOS ASCÓRBICOS E FREQÜÊNCIA DE SUBCULTIVOS
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
A utilização da técnica de cultivo in vitro de bananeiras tem propiciado uma
maneira de obtenção rápida de mudas de clones selecionados, livres de vírus ou
outro patógeno transmissível através de material propagativo. Um dos maiores
problemas a serem superados em cultivo in vitro, é o escurecimento dos
explantes (Cronauer & Krikorian, 1986). Este escurecimento é causado pela
oxidação de compostos fenólicos que são liberados quando os tecidos são
lesados, tornando-se um sério problema, particularmente para determinadas
cultivares de banana (Angarita & Perea, 1991). A oxidação fenólica foi
prejudicial para o desenvolvimento inicial de brotação de bananeira-'Prata'
(Lameira et al., 1990), sendo também um fator de redução da taxa de
multiplicação em bananeira-'Maçã' (Carneiro, 1997). Muitos explantes podem
chegar à morte (Gupta, 1986).
Para reduzir esse escurecimento, diversas técnicas são utilizadas durante o
preparo do explante e do meio de cultura bem como na fase de incubação. Segundo
Pasqual et al.(1997), a oxidação é menos severa em meio diluído do que em um
outro com alta concentração de sais, como o meio MS (Murashige & Skoog,
1962). Substâncias antioxidantes, como o ácido cítrico e o ácido ascórbico, são
também utilizadas para reduzir a oxidação em cultura in vitro. Estas agem pela
remoção do oxigênio de outras moléculas e também atuam por mecanismos
alternativos. Provavelmente, o ácido cítrico atua como um agente quelante,
retendo íons de metal, que são necessários para ativar enzimas oxidativas
(Pasqual et al., 1997).
Em cultura de tecidos de bananeira, para prevenir a oxidação polifenólica,
adicionam-se ácido cítrico, ácido ascórbico e carvão ativado, separadamente, ao
meio. Dentre estes, o ácido ascórbico tem sido o mais utilizado (Vuylsteke
& De Langhe, 1985; Gupta, 1986; Lameira, 1987; Souza & Gonçalves,
1996). Gupta (1986) verificou que o ácido ascórbico foi mais efetivo do que o
ácido cítrico e o carvão ativado, na concentração de 25 mg L-1. O escurecimento
de explantes é mais visível em meio sólido, pois os compostos fenólicos
exsudados para o meio acumulam-se em volta do explante. Assim, um método
eficiente para evitar o escurecimento dos tecidos é transferir os explantes,
freqüentemente, para um meio novo. O intervalo entre transferências deve ser
ajustado de acordo com o grau de oxidação, pois o escurecimento é
particularmente mais intenso na fase inicial do estabelecimento e decresce com
o tempo (Pasqual et al., 1997; Vuylsteke, 1989).
Este trabalho teve como objetivo o estudo da influência da concentração de sais
do meio MS, do ácido ascórbico e da freqüência de subcultivos, na fase de
estabelecimento, sobre a oxidação de explantes de bananeira-'Prata'.
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da
Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás-UFG, em Goiânia-GO. O
material utilizado para o cultivo in vitro foi constituído por gemas apicais
provenientes de mudas do tipo "Chifrinho" de bananeira-'Prata',
obtidas em um bananal em Goiânia.
Após a coleta no campo, as mudas foram lavadas em água corrente e receberam
cortes sucessivos no pseudocaule e rizomas até que se reduzissem para dimensões
aproximadas de 30 mm x 15 mm x 15 mm, mantendo intacto em seu interior o
meristema apical. Em seguida, fez-se o tratamento com hipoclorito de sódio (35
ml L-1) mais 30 gotas de Tween-20 L-1, durante 20 minutos, em câmara de fluxo
laminar (Carneiro, 1997). Posteriormente, foram feitas três lavagens sucessivas
com água destilada, deionizada e autoclavada. Após a redução final do explante
para dimensões de 10mm x 5mm x 5mm, inoculou-se um explante por tubo de ensaio
(250 mm x 25 mm) contendo 10 ml do meio de cultura. O delineamento experimental
foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x2x3, sendo 3 concentrações
de sais inorgânicos do meio MS (100%, 50% e 33,33%), 2 níveis de ácido
ascórbico em mg L-1 (0 e 25) e 3 freqüências de subcultivo (a cada 7 dias, a
cada 14 dias e aos 28 dias). Foram utilizadas 15 repetições, sendo cada
repetição constituída por um tubo de ensaio contendo um explante.
O meio básico utilizado foi o MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30
gL-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 1,5 mg L-1 de BAP e solidificado
com 2,0 g L-1 de PhytagelTM. Precedendo a autoclavagem, o pH do meio de cultura
foi corrigido para 5,8. Após a inoculação dos explantes no meio de cultivo, os
tubos de ensaio foram levados ao escuro por 7 dias. Decorrido este prazo, foram
conduzidos à sala de crescimento, a uma temperatura de 28ºC±2ºC, intensidade
luminosa de 35 mEinstein m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de
escuro por dia.
O ensaio foi avaliado ao final de 28 dias após a inoculação quanto às seguintes
variáveis: grau de oxidação, massa da matéria fresca (g) e altura (cm). Para a
avaliação da oxidação de forma subjetiva, utilizou-se de uma escala de
classificação em que: 0 = sem oxidação, 1 = muito baixa oxidação, 2 = baixa
oxidação, 3 = oxidação intermediária e 4 = oxidação intensa.
Para efeito da análise estatística, os dados da oxidação foram transformados
para (x + 0,5)1/2 e procedendo-se para todos os dados coletados, a análise de
variância e os desdobramentos dos efeitos de tratamentos. Para os fatores
concentração de sais do meio MS e freqüência de subcultivos, quando
apresentaram diferença significativa, fez-se à análise de regressão. Através da
análise de variância (Tabela_1), verificou-se que a massa da matéria fresca foi
significativamente influenciada pela interação entre a concentração de sais do
meio (MS) e a freqüência de subcultivos (SUB). Houve diferença significativa,
ao nível de 1% de probabilidade, nas três freqüências de subcultivos
utilizadas, quando a concentração de sais do meio de cultura utilizado, foi
reduzida à metade ou à terça parte. Quando o subcultivo foi realizado a cada 28
dias, as diferentes concentrações de sais utilizadas também apresentaram
diferença altamente significativa para o crescimento em massa. Nas outras
freqüências de subcultivos, o meio era renovado a cada 7 ou 14 dias e, ainda, o
explante recebia cortes, retirando-se as porções afetadas pela oxidação. Isto
pode ter levado o explante a absorver mais facilmente a água e os nutrientes
presentes no meio e, assim, propiciado aos mesmos um melhor crescimento.
Houve uma tendência de crescimento linear dos explantes à medida que se
aumentou o fornecimento de nutrientes, mostrando que, quando a freqüência de
subcultivos é de 28 dias, a concentração de sais do meio MS afeta
significativamente a massa da matéria fresca dos explantes (Figura_1.) Observa-
se que a maior freqüência de subcultivo não influenciou negativamente o
crescimento em massa dos explantes, apesar de que, sempre que se fazia o
subcultivo, os explantes recebiam cortes para a limpeza das porções oxidadas, e
estes eram transferidos para o meio fresco. Provavelmente, o retorno da
capacidade de absorção de nutrientes e a presença de nutrientes prontamente
disponíveis levaram ao crescimento normal dos explantes. Houve um efeito linear
decrescente quanto à massa da matéria fresca dos explantes, à medida que se
elevou o tempo de incubação em meio contendo a metade dos sais de MS (Figura
2.). Os dados observados nos tratamentos em que houve redução dos sais para
33,33%, apresentaram-se inferiores àqueles em que se utilizou o MS reduzido à
metade. A regressão linear das médias da massa da matéria fresca para a
concentração de 33,33% dos sais do meio MS, foi significativa juntamente com o
desvio da regressão, indicando que não existe somente efeito linear, mas não
foi possível testar estes efeitos pela insuficiência de pontos.
Os desdobramentos da interação, SUB x AA (Tabela_2) mostram que, na ausência de
ácido ascórbico, a freqüência de subcultivos tem efeito diferenciado e, para a
transferência dos explantes feita aos 28 dias, o ácido ascórbico tem efeito
significativo. Isto indica que, para a permanência do explante por mais tempo
em um mesmo meio, faz-se necessária à adição de ácido ascórbico, visando à
redução da oxidação. E quando este ácido não é utilizado, deve-se aumentar a
freqüência de subcultivos para cada 7 ou 14 dias. Pasqual et al.(1997) e
Vuylsteke (1989) já recomendavam esta técnica para evitar o escurecimento de
explantes iniciais de banana, enquanto alguns autores chegam a recomendar
subcultivos a cada 3 dias, o que elevaria, acentuadamente, o custo de produção
da muda em condições in vitro.
Nas médias do grau de oxidação, na ausência do ácido ascórbico, a regressão
linear e o desvio foram significativos, indicando que não existe somente efeito
linear, mas provavelmente de grau superior; entretanto, pela insuficiência de
dados, estes efeitos não puderam ser testados. Mas se observou que a oxidação
foi mais intensa no subcultivo aos 28 dias do que em relação a intervalos
menores de subcultivos. Os subcultivos freqüentes mostraram-se efetivos na
redução da oxidação, estando de acordo com Hamil et al. (1993), ao passo que
Banerjee & De Langhe (1985) observaram redução no grau de escurecimento do
meio de cultura, quando houve a combinação do ácido ascórbico com o subcultivo
a cada duas semanas.
O uso de ácido ascórbico adicionado ao meio, como é o caso do presente
experimento, pode prorrogar o período de subcultivo, não afetando
significativamente os níveis de oxidação. A maior freqüência de subcultivos tem
como conseqüência à elevação no custo da muda produzida in vitro, visto que
serão necessários maior quantidade de meio de cultura, mão-de-obra e tempo para
a realização das diversas transferências para o meio fresco.
Verifica-se, pela análise de variância (Tabela_1), diferença altamente
significativa para freqüência de subcultivos x concentração de ácido ascórbico.
Na presença do ácido ascórbico, a oxidação foi semelhante para os subcultivos a
cada 7 e a cada 14 dias, porém, quando não se adicionou este antioxidante ao
meio de cultura, a oxidação foi significativamente maior para subcultivo a cada
28 dias (Tabela_3). Trabalho de Gupta (1986) indica o ácido ascórbico como o
mais efetivo na prevenção da oxidação polifenólica dentre os diversos
antioxidantes testados.
De acordo com os resultados, verifica-se que:
1. quando o período de subcultivos foi maior (28 dias), o crescimento em massa
da matéria fresca foi reduzido em função da redução da concentração dos sais do
meio MS;
2. para meios de cultura menos concentrados (1/2 MS) e maior freqüência de
cultivo (a cada 14 dias), não houve necessidade da adição do ácido ascórbico
para promover redução do escurecimento dos explantes;
3. houve uma tendência de maior crescimento em massa dos explantes com o
aumento da freqüência de subcultivos, em meios de cultura menos concentrados;
4. a utilização do ácido ascórbico acrescido ao meio de cultura, o aumento da
freqüência de subcultivos e a redução da concentração dos sais do meio MS não
foram suficientes ou adequados para eliminar a oxidação de explantes de
bananeira-'Prata';
5. apesar de se apresentar escurecido, em todos os tratamentos utilizados, o
crescimento em massa foi significativo, valendo ressaltar que sempre que se
fazia o subcultivo, o explante recebia cortes para limpeza das porções oxidadas
e estes eram transferido para o meio fresco.
