Regeneração de brotações de macieira (Malus domestica, Borkh.) cv. Gala
REGENERAÇÃO DE BROTAÇÕES DE MACIEIRA (Malus domestica, Borkh.) cv. GALA1
INTRODUÇÃO
No melhoramento genético de fruteiras de clima temperado, geralmente são
utilizados os métodos tradicionais, onde os programas podem durar anos até que
se produza uma cultivar geneticamente estável. A transformação genética
proporciona a introdução de gene correspondente a alguma característica
benéfica dentro do genoma de uma cultivar comercial estabelecida,
proporcionando, desta forma, a aceleração do processo de melhoramento . Espécie
de clima temperado que ocupa lugar de destaque, como a macieira cultivar Gala,
pode ser melhorada através de engenharia genética.
Para a aplicação das técnicas de transformação de plantas, é necessário que as
células ou tecidos transformados sejam regenerados em plantas que expressem o
gene introduzido. Desta forma, a eficiência do sistema de cultura de tecidos in
vitro é indispensável quando se quer fazer melhoramento de plantas pela
transformação genética. A eficiência na cultura dos tecidos depende do controle
da morfogênese, a qual é influenciada por vários fatores como espécie,
cultivar, tipo de explante, componentes nutricionais do meio, reguladores de
crescimento e ambiente de cultura (Rao et al., 1996).
Em macieira, a utilização da transformação genética é limitada pela dificuldade
de regeneração de seus explantes e pela baixa eficiência na transformação. A
organogênese direta é o sistema mais adequado, porém é mais difícil de se obter
in vitro, para a regeneração de células transformadas, pois, segundo Tzifira et
al. (1997), evita a formação de escapes e diminui a possibilidade de ocorrer
variação somaclonal. Em vista disso, o presente trabalho teve como objetivo
estabelecer um protocolo de regeneração para macieira, cultivar Gala.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos do
Departamento de Botânica, na Universidade Federal de Pelotas-RS. As plantas
utilizadas como fonte de explantes foram provenientes do cultivo in vitro, em
fase de multiplicação, em meio contendo sais minerais de Murashige & Skoog
(MS) (1962), com nitrogênio reduzido a ¾, 100 mg.L-1 de mioinositol, 40 g.L-
1 de sacarose, 6 g.L-1 de ágar, 1,0mg.L-1 de Benzilaminopurina (BAP), com pH
ajustado para 5,9 antes da colocação do ágar. Foram utilizados, como explantes,
folhas inteiras escarificadas na nervura central, pedaços retangulares de
folhas de aproximadamente 5 mm de largura e entrenós medindo entre 5 e 7 mm de
comprimento, retirados de brotações em multiplicação após quatro semanas de
repicagem. Para a regeneração das brotações, foram avaliados meios de cultura
com diferentes composições, sendo que se utilizaram sais minerais e
constituintes orgânicos de Murashige & Skoog (MS) (1962) e ANA (Ácido
naftalenoacético) a 0,2 mg.L-1 e a estes foram acrescentados os reguladores de
crescimento BAP (Benzilaminopurina), TDZ (Thidiazuron), em diferentes
concentrações (0; 3,0; 4,0 e 5,0mg.L-1). Os meios tiveram o pH ajustado para
5,8 e, após, adicionou-se 2,5 g.L-1 de Gelrite.
Frascos contendo brotações com três semanas de cultivo in vitro foram colocados
durante uma semana no escuro, em condições normais de temperatura de sala de
crescimento. Outras brotações, também utilizadas como fonte de explantes,
permaneceram quatro semanas em meio de multiplicação, em condições normais de
sala de crescimento. Foram retirados folhas, segmentos foliares e entrenós e
colocados nos diferentes meios de regeneração. Os explantes permaneceram três
semanas em sala de crescimento, com temperatura de 23 ± 1ºC e ausência completa
de luz. Posteriormente, foram transferidos para fotoperíodo de 16 horas e
intensidade luminosa de 40 mmol m-2 s-1, onde permaneceram durante dois meses.
As variáveis analisadas, após este período, foram percentagem de explantes
regenerados, número de brotações por explante e aparência dos mesmos, através
de presença ou não de vitrificação. Todos os dados foram analisados através do
pacote estatístico SANEST- Sistema de Análise Estatística- elaborado no
Departamento de Matemática e Estatística da Universidade Federal de Pelotas
(Zonta & Machado, 1984).
O delineamento experimental adotado no experimento foi inteiramente
casualizado, com fatorial A'B'C. O número de repetições foi três, sendo cada
repetição um frasco com seis explantes. Os dados expressos em percentagem foram
transformados segundo arco-seno raiz quadrada de (X/100), onde X significa o
valor percentual obtido para cada variável. Para número médio de brotações, os
dados foram transformados segundo raiz de (X+0), onde X significa o valor médio
de brotações por explante regenerante.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação à percentagem de explantes regenerados, foram significativos os
fatores iluminação e a interação entre explante e meio de cultura, nas
diferentes concentrações de BAP. Observou-se que aqueles explantes que foram
retirados de brotações previamente submetidas ao escuro durante uma semana,
tiveram uma maior percentagem de regeneração do que aqueles cujas brotações de
origem permaneceram em condições normais de iluminação (Tabela_1). Estes
resultados estão de acordo com Pawlicki & Welander (1994) e Famiani et al.
(1994), que conseguiram aumentar a taxa de regeneração de explantes de
macieira, submetendo as brotações-mãe a um período de ausência de luz.
Provavelmente, este estiolamento das brotações tenha provocado um maior teor de
auxina endógena, já que as auxinas são sensíveis à luz, modificando, desta
forma, o balanço auxina/citocinina e favorecendo a morfogênese.
A análise de regressão entre explante e meio mostrou um comportamento linear
crescente, tanto para o explante folha como para o segmento foliar, conforme o
aumento das concentrações de BAP (Figura_1-A). Entre os explantes testados, os
que tiveram uma maior capacidade regenerativa foram folha inteira escarificada
e segmento foliar. Estes resultados estão de acordo com Fortes & Teixeira
(1992), que obtiveram melhores resultados na organogênese de explantes
foliares. Faria (1996), trabalhando com o porta-enxerto Marubakaido, obteve uma
maior regeneração com a utilização de entrenós, enquanto folhas inteiras não
regeneraram, porém foram os entrenós o tipo de explante que apresentou uma
maior formação de calo (99,5%). Quando se busca organogênese direta, este
resultado não é interessante, pois existe possibilidade de ocorrer variação
somaclonal se a regeneração for através de células não diferenciadas. No
presente trabalho, não aconteceu regeneração com a utilização de entrenós,
formando, na maioria deles, uma grande quantidade de calo na extremidade.
Em relação à melhor concentração de BAP (Fig.1-A), os resultados obtidos
concordam com Yao et al. (1995), que obtiveram uma maior regeneração em
macieira cultivar Royal Gala com a utilização de 5,0mg.L-1 de BAP no meio de
cultura. Também Yepes & Aldwinckle (1994) afirmam que a concentração de
citocinina é um dos principais fatores que afetam a morfogênese, e obtiveram
alta regeneração de cultivares de macieira, com variação entre genótipos,
utilizando entre 5,0 e 7,0 mg.L-1 de BAP no meio de cultura.
Quanto ao número de brotações, houve interação entre explante, meio e
iluminação. Conforme pode ser observado na Figura_1-B, o explante folha, quando
as brotações foram mantidas na luz, teve um comportamento quadrático, onde
foram formadas mais brotações (2,13), em maiores concentrações de BAP (5,0mg.L-
1). Já o comportamento do explante folha, quando as brotações permaneceram uma
semana no escuro, foi linear, atingindo seu máximo também a 5,0mg.L-1 de BAP.
Em relação ao segmento foliar, o melhor resultado obtido foi no escuro com
3,0mg.L-1 de BAP, diminuindo em concentrações maiores de BAP. Já o segmento na
luz formou um maior número de brotações em maior concentração de BAP (5,0mg.L-
1). Esses resultados mostram que, quando as brotações são submetidas a um
período de uma semana de escuro, antes da retirada dos explantes, a necessidade
de um fornecimento externo de BAP não é tão grande como quando são mantidas
diretamente na luz, para formar o mesmo número de brotações. Também Famiani et
al. (1994) obtiveram um maior número de brotações por explante em macieira,
porta-enxerto M-26, quando submeteram estas a um período de escuro, dentro da
mesma concentração de BAP no meio de cultura.
Com a utilização de TDZ no meio de cultura, a folha alcançou uma maior
percentagem de regeneração (85,57%) na concentração de 4,0mg.L-1. Também o
segmento foliar teve a maior regeneração (77,11%) nesta concentração (Figura_2-
A), e os entrenós não regeneraram. Segundo Chevreau et al. (1989), o TDZ é
utilizado com sucesso na regeneração de várias espécies lenhosas. Autores como
De Bondt et al. (1996) obtiveram um melhor resultado com 5,0mg.L-1 de TDZ no
meio de cultura, para a regeneração de explantes foliares de macieira, cultivar
Jonagold.
Este regulador tem sido utilizado para a formação de brotações em várias
plantas, especialmente as lenhosas, mostrando-se mais efetivo que outros tipos
de citocinina, como BAP e Cinetina e em concentrações extremamente baixas
(Nayak et al., 1997). Shibli & Smith (1996) conseguiram 75% de regeneração
em explantes foliares de mirtilo com a utilização de 0,6 mg.L-1 de TDZ no meio
de cultura. Também Sarwar & Skirvin (1997), utilizando TDZ em concentrações
de 0,44 e 0,66 mg.L-1, regeneraram explantes foliares de macieira, cultivares
McIntosh, Macspur e Wijcik.
Neste experimento, o que se pode observar em relação ao efeito do TDZ é que,
embora a percentagem de regeneração tenha sido alta nas maiores concentrações
(4,0 e 5,0mg.L-1), os explantes apresentavam vitrificação praticamente total.
Estes resultados concordam com Nieuwkerk &Zimmerman(1986), que afirmam que
alta concentração de TDZ causa necrose dos tecidos, vitrificação e crescimento
anormal da folha.
Conforme Figura_2-B, pode-se observar que, quando as brotações foram mantidas
na luz, o comportamento da percentagem de regeneração de explantes foi de
acordo com um modelo de regressão quadrática, atingindo uma maior percentagem
em concentrações intermediárias de TDZ, vindo a diminuir em concentrações
maiores. Já quando as brotações foram submetidas a uma semana de escuro, o
comportamento foi de acordo com um modelo de regressão linear, regenerando mais
(54,29%) em maior concentração de TDZ. Na luz, a necessidade de TDZ, até um
certo ponto, foi menor para regenerar brotações, do que no escuro. Este
resultado discorda dos de Shibli & Smith (1996), que obtiveram um
significativo aumento na percentagem de regeneração e no número de brotações,
formadas com tratamento no escuro, de explantes foliares de mirtilo. Com a
utilização de concentrações entre 0,2 e 0,4 mg.L-1 de TDZ, a pré-incubação no
escuro mais que dobrou a percentagem de regeneração, comparando com os
tratamentos mantidos sob iluminação normal.
Em relação ao número de brotações, observa-se (Figura_2-C) que, nos explantes
folha retirados de brotações mantidas na luz, formou-se um maior número de
brotos do que naqueles submetidos a uma semana de escuro, alcançando seu máximo
a 4,0mg.L-1 de TDZ, ou seja, 2,59 brotos por explante, contra 1,83 brotos no
explante submetido ao escuro. O explante segmento foliar formou o máximo de
brotações em meio de cultura contendo 3,0mg.L-1 de TDZ, tanto na luz (1,71)
quanto no escuro (1,70). Nestes resultados, observa-se que a ausência de luz
também não favoreceu o número de brotações por explante.
A maioria das brotações formadas com a utilização de TDZ eram muito pequenas,
agrupadas e vitrificadas. Segundo Kim et al. (1997), com a utilização de TDZ, o
número de brotações formadas é bastante grande em maiores concentrações, como
5,0 e 10,0mg.L-1, mas com um alongamento bastante pequeno. Estes autores
conseguiram alta freqüência na indução de brotações em plantas lenhosas com a
utilização de 1,0mg.L-1de TDZ.
CONCLUSÕES
1- A colocação das brotações no escuro aumenta a taxa de regeneração.
2- Os explantes folha e segmento foliar apresentam maior potencial regenerativo
que entrenós.
3- BAP nas concentrações de 4,0 a 5,0 mg.L-1 induz a uma maior regeneração de
brotações.
4- Explantes retirados de brotações submetidas ao escuro necessitam de uma
menor concentração de BAP, para formar o mesmo número de brotações, do que
aqueles mantidos na luz.
5- TDZ em altas concentrações (4,0 e 5,0 mg.L-1) induz a vitrificação.
