Explantes de cupuaçuzeiro submetidos a diferentes condições de cultura in vitro
Explantes de cupuaçuzeiro submetidos a diferentes condições de cultura in
vitro1O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum.) é encontrado, espontaneamente,
nas matas de terra firme e várzea alta, na parte sul e leste do Pará,
abrangendo as áreas do médio Tapajós, rios Xingu e Guamá, alcançando a pré-
Amazônia maranhense (Cavalcante, 1991). Atualmente, está disseminado por toda a
bacia Amazônica e Norte do Maranhão, sendo cultivado na Bahia, Espírito Santo,
São Paulo e em outras regiões do País. O maior potencial de exploração da
cultura é a produção de polpa para a fabricação de sorvetes, doces, geléias,
néctar, licores, compotas, bolos, biscoitos, iogurtes e sucos. Das sementes,
pode-se obter o chocolate e também extrair uma gordura semelhante à manteiga de
cacau, de alta digestibilidade (Venturieri, 1993).
Plantios desuniformes associados à falta de material genético melhorado têm
sido apontados como os principais fatores que limitam a expansão da cultura do
cupuaçuzeiro na Amazônia. Instituições de pesquisas na região, nos últimos
anos, têm implementado programas de melhoramento com ênfase na seleção de
materiais com características de alta produção de frutos, rendimento de polpa e
resistência à vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa), principal enfermidade
da cultura. Neste contexto, a cultura de tecidos, em especial a
micropropagação, torna-se uma técnica auxiliar muito valiosa, para clonagem, a
curto prazo, de genótipos superiores e para acelerar diversas etapas de
programas de melhoramento.
Informações sobre a micropropagação do cupuaçuzeiro são escassas. Os estudos de
no gênero Theobroma têm sido direcionados para a espécie Thebroma cacao L.,
considerada, até há pouco tempo, como a única espécie do gênero cultivada
comercialmente.
Alguns trabalhos têm mostrado a capacidade de diferentes explantes de
cupuaçuzeiro em formar calos, bem como a diferenciação de estruturas
embriogênicas. Em trabalhos conduzidos por Janick & Whipkey (1988), a
embriogênese somática indireta foi induzida em embriões imaturos de Theobroma
grandiflorum em meio MS semi-sólido com 1 mg.L-1 de 2,4-D e 10 % de água de
coco, entretanto não foi observada a regeneração de plântulas. Avaliando o
efeito de auxinas, Ferreira et al. (2001) observaram que a combinação de ANA e
2,4-D induziu a rizogênese e a formação de calos em segmentos de hipocótilo e a
água de coco, em meio sem reguladores de crescimento, favoreceu a rizogênese e
a calogênese.
O objetivo do presente trabalho foi o de estudar as respostas morfogenéticas de
diferentes explantes de cupuaçuzeiro submetidos a várias condições de cultura
in vitro.
Foram utilizados explantes obtidos a partir de plântulas assépticas, com 50
dias de idade, obtidas in vitro (segmento caulinar e de folhas jovens
clorofiladas) e de embriões zigóticos maduros (eixo embrionário e cotilédones)
oriundos de plantas adultas, com 8 anos de idade, da coleção de cupuaçuzeiro da
Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA.
Na primeira etapa, os explantes foram inoculados em meio MS (Murashige &
Skoog, 1962) com 0,6 % de ágar, 3 % de sacarose e suplementado com diferentes
reguladores de crescimento. Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,8
e, em seguida, submetidos à esterilização em autoclave a 120ºC durante 15
minutos.
Para os eixos embrionários, testaram-se os seguintes reguladores de crescimento
adicionados isoladamente ao meio de cultura: ácido naftalenoacético-ANA (10,74;
21,48; 32,22 e 42,96 mM), ácido 2,4-diclorofenoxiacético-2,4-D (2,26; 4,52;
6,78 e 9,05 mM) e tidiazuron-TDZ (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 mM). O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e
quatro repetições. Para os segmentos de folhas jovens: TDZ (0; 1,0; 2,0 e 3,0
mM) combinado com 2,4-D (0; 9,05; 18,10 e 27,15 mM), sendo o delineamento
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 4 (quatro concentrações de
2,4-D combinadas com quatro de TDZ) e três repetições. Para segmentos
cotiledonares: 6-furfurilaminopurina- KIN (11,61; 13,94; 16,26 e 18,59 mM)
combinado com ANA (5,37 mM) ou 2,4-D (2,26 mM); e ANA (10,74; 21,48; 32,22 e
42,96 mM) combinado com TDZ (3,0 e 4,0 mM), no delineamento inteiramente
casualizado, com 16 tratamentos e três repetições. Para segmentos caulinares:
KIN (11,61; 13,94; 16,26 e 18,59 mM) combinado com ANA (5,37 mM) ou 2,4-D (2,26
mM), no delineamento inteiramente casualizado, com oito tratamentos e três
repetições.
Na segunda etapa, foi avaliado o efeito da água de coco em culturas de calos
friáveis, iniciadas a partir de eixos embrionários, segmentos foliares e
caulinares. As culturas de calos friáveis foram repicadas para meio MS com 0,7
% de ágar , 2 % de glicose e pH ajustado em 5,8. Foram testados os seguintes
tratamentos: meio MS; meio MS + água de coco (AC); meio MS + AC + 2,69 mM de
ANA + 12,30 mM de isopenteniladenina-2iP; meio MS + AC + 5,37 mM de ANA + 12,30
mM de 2iP; meio MS + AC + 8,06 mM de ANA + 12,30 mM de 2iP e meio MS + AC +
10,74mM de ANA + 12,30 mM de 2iP. A água de coco foi adicionada aos meios na
concentração de 100 ml.L-1. O experimento foi conduzido utilizando o
delineamento inteiramente casualizado, com seis tratamentos e quatro
repetições.
Em todos os experimentos a unidade experimental foi constituída de dez frascos,
contendo um explante cada e avaliaram-se a o número de explantes com respostas
morfogenéticas e as percentagens de explantes com calo friável, não friável e
embriogênico.
Nos primeiros 15 dias as culturas foram mantidas em sala de crescimento, com
temperatura variando de 26º ± 2ºC, umidade relativa do ar média em torno de
70%, sob fotoperíodo de 16 horas de luz branca fria indireta (6 µmol.m-2.s-1 de
irradiância)/oito horas de escuro. Em seguida, o fotoperíodo foi ajustado para
16 horas de luz branca fria direta (52 µmol.m-2.s-1 de irradiância)/oito horas
no escuro.
As variáveis foram submetidas à análise de variância pelo teste F e as médias
foram comparadas pelo teste de Scott & Knott (Scott & Knott, 1974) em
nível de 1 % de probabilidade.
Em meio MS suplementado com ANA, foi verificada, aos 20 dias de cultura, a
formação de calo branco-translúcido de aspecto esponjoso e não friável sobre a
superfície dos segmentos (Figura_1A). Explantes cultivados em meio com TDZ
apresentaram o mesmo padrão de resposta morfogenética. Entretanto, na presença
de 2,4-D, após a formação de calo não friável, foi observada a iniciação e o
crescimento de calo friável em toda a superfície dos explantes aos 25 dias de
cultura.
As maiores frequências de calos friáveis foram verificadas aos 30 dias, em meio
suplementado com 4,52; 6,78 e 9,05 µM de 2,4-D (Figura_2). Entretanto,
observou-se o rápido escurecimento das culturas (Figura_1B). A iniciação e o
crescimento de calos em meio com menor concentração de 2,4-D (2,26 µM) foram
mais lentos. Ferreira et al. (2001) também observaram maior indução de calos em
segmentos de eixos embrionários cultivados em meio MS líquido com maiores
concentrações de 2,4-D (4 e 8 mg.L-1).
O escurecimento de explantes tem sido relatado como uma dificuldade no
estabelecimento de culturas in vitro em algumas espécies lenhosas, como
consequência de oxidações, provavelmente em decorrência da liberação de
compostos fenólicos pelos tecidos em resposta aos ferimentos, altas
concentrações de reguladores de crescimento no meio de cultura e pela oxidação
de polifenóis e quininas (Pious & Ravindra, 1997). Blake (1983) relata que
o meio líquido pode diluir substâncias responsáveis pela oxidação dos
explantes. Entretanto, Ferreira et al. (2001) observaram o escurecimento de
culturas de calos de T. grandiflorum em meio líquido na ausência de reguladores
de crescimento.
Pré-tratamentos dos explantes com ácido cítrico e ácido ascórbico e a adição de
substâncias adsorventes ao meio de cultura, como carvão ativado e
polivinilpirrolidona, deverão ser considerados em futuros ensaios.
Foram observadas a formação de calo branco-translúcido de aspecto esponjoso e
não friável, aos 15 dias de cultura, com crescimento muito lento, na borda e
nas nervuras centrais e secundárias dos segmentos de folhas e ausência de calos
friáveis na maioria dos tratamentos testados (Figura_1C). Na presença isolada
de 1,0; 2,0 e 3,0 mM de TDZ, após a formação de calo não friável, foram
verificados a iniciação e o rápido crescimento de calo friável de coloração
clara em toda a superfície abaxial e adaxial dos explantes (Figura_1D). As
concentrações de 2 e 3 mM de TDZ induziram as maiores frequências de explantes
com calos friáveis (Figura_3).
Provavelmente, a formação de calos friáveis em explantes foliares de cupuaçu
possa ser dependente da presença de citocininas. Segundo Lu (1993), o TDZ
estimula a divisão celular e, consequentemente, o crescimento de calos
dependentes de citocininas em algumas espécies. Algumas evidências indicam que
o TDZ possa ter atividade auxínica ou estar envolvido no metabolismo de
auxinas, conforme relatado por Lu (1993).
Quando o TDZ foi combinado com o 2,4-D não foi observada a iniciação e
progressão de calos friáveis, provavelmente devida a rápida oxidação das
culturas. Esta hipótese é reforçada pelo fato de que nos explantes inoculados
em meio com 1,0; 2,0 e 3,0 mM de TDZ, a percentagem de oxidação foi de 6,7;
3,33 e 3,33 %, respectivamente (dados não mostrados). Em contrapartida, quando
o TDZ foi combinado com o 2,4-D a percentagem de oxidação variou de 14,81 a
90,0 % (dados não mostrados). Altos índices de oxidação e baixa eficiência na
formação de calos foram observados em discos foliares de T. grandiflorum em
meio suplementado com 4,52 mM (Rodrigues, 2000).
Conforme relatado por Mok et al. (1987), o TDZ é resistente às oxidases,
estável e biologicamente ativo em concentrações menores que as citocininas tipo
adenina. Resultados semelhantes foram obtidos por Flores (1999), que observou
menor oxidação de calos em explantes foliares de Fragaria x ananassa Duch. em
meio suplementado com TDZ.
A combinação de ANA e KIN, nas concentrações testadas, foi bastante favorável a
indução da rizogênese em segmentos cotiledonares. Pence et al. (1979)
observaram o crescimento organizado de raízes em cotilédones de T. cacao, em
meio MS suplementado com 20 mg.L-1 de ANA.
Nos tratamentos constituídos da combinação de ANA com TDZ, as respostas
limitaram-se à formação de calo de aspecto esponjoso e não friável (Figura_1E).
Entretanto, quando o 2,4-D foi combinado com KIN, após a iniciação de calo não
friável, houve a formação e o rápido crescimento de calo friável em toda a
superfície dos segmentos cotiledonares e, em menor frequência, a iniciação de
raízes. Ndoumou et al. (1997), trabalhando com cotilédones de T. cacao,
observaram o rápido crescimento de calos em meio ½ MS suplementado com 2,4-D e
KIN.
Os calos friáveis apresentaram um rápido escurecimento, apesar de manterem uma
alta taxa de crescimento até o 150° dia de cultura. A oxidação e o crescimento
excessivo de calos oriundos de cotilédones de T. cacao, têm sido reportados
como os principais problemas no estabelecimento da embriogênese somática
(Berthouly & Eskes, 1995).
Não foram detectadas diferenças significativas entre as concentrações de KIN
combinadas com 2,26 mM de 2,4-D quanto à percentagem de explantes com calos
friáveis (P > 0,05).
A combinação de ANA ou 2,4-D com KIN, nas concentrações testadas, promoveu a
indução de calos com coloração branco-translúcida de aspecto esponjoso e não
friável (Figura_1F). O tratamento constituído de 2,26 mM de 2,4-D e 13,94 mM de
KIN foi o único a induzir a formação de calos friáveis entretanto, com
crescimento muito lento e rápido escurecimento.
Resultados semelhantes foram obtidos por Hall & Collin (1974), que
observaram apenas a formação de calos sem regeneração de plântulas em segmentos
de ramos ortotrópicos de T. cacao. Rodrigues (2000) não verificou a formação de
calos em segmentos nodais de T. grandiflorum em meio suplementado com
diferentes concentrações de 2,4-D. Segundo Dufour et al. (1985), o
desenvolvimento desorganizado de calos em segmentos caulinares de T. cacao,
cultivados em meios para a proliferação de brotos, pode ser devido a fatores
endógenos ou ao equilíbrio gasoso inadequado.
Aos 10 dias de cultura, verificou-se o rápido crescimento dos calos com aspecto
friável e de coloração verde-clara. Não foi observado o crescimento dos calos
friáveis em meio MS na ausência de água de coco e de reguladores de
crescimento, ocorrendo um rápido escurecimento das culturas. Nos eixos
embrionários, na presença de água de coco, houve a progressão dos calos, sendo
potencializada em meio suplementado com ANA e 2iP, não sendo detectadas
diferenças significativas entre as concentrações de ANA (Tabela_1). Resultados
semelhantes foram obtidos por Pence et al. (1979), que observaram o aumento do
crescimento de calos de T. cacao L. em meio MS suplementado com 10 % de água de
coco. Entretanto, Ferreira et al. (2001) observaram o escurecimento de calos em
resposta à combinação de água de coco e 2,4-D.
O efeito estimulatório da água de coco pode ser explicado pelo fato de este
aditivo ser rico em glicose e frutose, sais minerais, mioinositol, citocininas,
bem como nucleotídeos e outros compostos orgânicos (Ferreira et al., 1998).
Alguns trabalhos têm demonstrado a capacidade de indução de embriogênese
somática a partir de diversos explantes de T. grandiflorum e T. cacao em meio
de cultura suplementado com água de coco (Janick & Whipkey,1988; Li et al.,
1998 e Marbach & Teixeira, 1999). A ausência de indução de calos
embriogênicos observada nas culturas pode estar relacionada com diversos
fatores, como tipo e o estádio de desenvolvimento dos explantes, meio de
cultura e tipo e concentração de reguladores de crescimento.
CONCLUSÕES
O 2,4-D promove a formação de calos friáveis em eixos embrionários e o TDZ
induz alta frequência de calos friáveis e menor oxidação em segmentos de folhas
jovens.
A combinação de 2,4-D e KIN no meio de cultura promove a formação de calos
friáveis e de ANA, e KIN induz a rizogênese em segmentos cotiledonares.
A combinação de 2,4-D e KIN promove a formação de calos friáveis em segmentos
caulinares.
A adição de água de coco, 2iP e ANA no meio secundário estimula o rápido
crescimento de calos friáveis em culturas de eixo embrionário de segmento
caulinar e de segmentos de folhas jovens.
