Multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus sob baixas
concentrações e diferentes tipos de auxinas
Multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus sob baixas
concentrações e diferentes tipos de auxinas1INTRODUÇÃO
Na multiplicação in vitro, além de determinar qual o melhor meio, tipo e
concentração de citocinina, é necessário também estudar a interação desses
últimos com as auxinas, a fim de melhorar os protocolos e otimizar os
resultados. Quoirin & Lepoivre (1977) constataram que, embora nem sempre as
auxinas sejam necessárias no meio de multiplicação, estes reguladores de
crescimento são usados com o intuito de estimular o crescimento das partes
aéreas. De acordo com Lundergan & Janick (1979), a presença de uma auxina
no meio de multiplicação anula o efeito inibitório das citocininas sobre o
alongamento dos explantes. Dentre as auxinas mais usadas nos meios de
multiplicação, destacam-se ANA, AIB e AIA (Hu & Wang, 1983). Nos últimos
anos, vários trabalhos vêm sendo feitos com diversas espécies do gênero Prunus,
principalmente porta-enxertos, na tentativa de otimização dos protocolos de
propagação in vitro. Dentre estes trabalhos destacam-se aqueles realizados por
Dimassi-Theriou (1998), com o porta-enxerto Mr.S 2/5, e aqueles realizados por
Rodrigues et al. (1999), com diversas espécies de Prunus, principalmente
híbridos interespecíficos.
Este trabalho teve como objetivo determinar qual o tipo e concentração de
auxina que, combinada com a citocinina BAP, proporciona melhores resultados na
multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa
Clima Temperado, Pelotas-RS. Quatro porta-enxertos foram utilizados: G x N22,
Mr.S 2/5, Mirabolano e Marianna. Os explantes usados foram segmentos nodais,
originados de subcultivos anteriores do mesmo laboratório. O tamanho do
explante variou de acordo com o porta-enxerto, ficando em torno de 5,0 mm e/ou
5 gemas. Para cada um dos porta-enxertos, foi usado um meio específico. Assim,
para os porta-enxertos G x N22 e Mr.S 2/5, foi usado o meio MS (Murashige &
Skoog, 1962) com sais reduzidos a ¾ da concentração normal e adicionado 0,7
mg.L-1 de BAP. Para o "Marianna", usou-se o meio MS completo com 0,7 mg.L-1 de
BAP, e para "Mirabolano", o meio usado foi o MS ¾ da concentração normal com
0,5 mg.L-1 de BAP. Em todos os meios, foram acrescidos 30 g.L-1 de sacarose,
6,5 g.L-1 de ágar e 100 mg.L-1 de mioinositol. O pH foi ajustado para 5,8 antes
da colocação do ágar. Os meios foram distribuídos em frascos de 250 ml com 8 cm
de diâmetro, nos quais colocou-se 30 ml de meio/frasco. Após, os mesmos foram
autoclavados à temperatura de 121 oC durante 15 minutos. Posteriormente, foram
colocados 5 (cinco) explantes em cada frasco. Após a colocação destes, os
frascos foram levados para sala de crescimento sob condições de luz
fluorescente com intensidade de 20 mE.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e
temperatura de 25±2ºC, permanecendo nestas condições por período de 35 dias.
Cada um dos porta-enxertos constituiu-se em um experimento, onde foram testados
os tipos de auxinas e as concentrações. O delineamento experimental, em blocos
casualizados com 4 (quatro) repetições, foi o mesmo para todos os experimentos,
sendo cada unidade experimental constituída de um frasco contendo 5 (cinco)
segmentos nodais. O delineamento de tratamento foi um fatorial 3x4, sendo os
fatores Tipo de auxina (AIB, AIA e ANA) e Concentração de auxina (0,0; 0,01;
0,1 e 1,0 mM). A análise estatística dos dados foi feita através da análise da
variação e discriminação da variação de tratamento pela comparação de médias
através do teste de Duncan (a = 0,05), para os fatores tipo de auxina e
Concentração. Optou-se por realizar o teste de médias para o fator
concentração, mesmo este sendo um fator quantitativo, e que normalmente é
analisado pela regressão polinomial, visto que o objetivo do experimento não
foi descobrir qual a concentração ótima de auxina, mas, sim, dentre aquelas
concentrações testadas, qual a que possibilitaria os melhores resultados. O
nível mínimo de significância adotado em todos os testes foi de 5%.
As variáveis analisadas foram: número de gemas e de brotações, transformadas
segundo e 
respectivamente, e tamanho das brotações (em mm). As análises
estatísticas foram executadas pelo programa SANEST - Sistema de Análise
Estatísticas para Microcomputadores (Zonta & Machado, 1984).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento 1 - Porta-enxerto G x N22
Na Tabela_1, encontram-se os resultados da comparação de médias da variável
número de gemas do porta-enxerto G x N22. De modo geral, a concentração de
0,01mM foi a melhor para as auxinas AIB e AIA, sendo aquela que possibilitou o
maior número de gemas. Tais resultados estão de acordo com aqueles obtidos por
Ruzic et al. (1984). A auxina AIA apresenta instabilidade no meio de cultura,
aliada à sua inativação ou destruição nas células, tornando-a uma auxina
relativamente fraca, o que explica os melhores resultados serem obtidos em
doses maiores do que aquelas das auxinas AIB e ANA, as quais, geralmente, são
adicionadas nos meios de cultura em concentrações abaixo de 0,5 mg.L-1
(Grattapaglia & Machado, 1998). Tais hipóteses possibilitam compreender por
que o AIA foi melhor que as outras auxinas também na maior concentração testada
(1,0 mM) (Tabela_1).
Na Tabela_2, pode-se observar que o tipo de auxina teve comportamento diferente
nas diversas concentrações usadas, para o tamanho das brotações. Para o ANA, a
maior concentração mostrou-se inferior às demais; estas, no entanto, não
diferiram entre si. A partir destes resultados, pode-se notar que, para o AIB e
o ANA, concentrações maiores que 0,01 mM interferiram negativamente nas
variáveis número de gemas e tamanho das brotações, uma vez que apenas esta
concentração (0,01 mM) otimizou os resultados. Segundo Ruzic et al. (1984),
concentrações de auxinas maiores que 0,01 mM influenciam negativamente na taxa
de multiplicação de híbridos de Prunus. Segundo Quoirin & Lepoivre (1977),
as auxinas podem ser necessárias para a obtenção de melhores resultados na fase
de multiplicação. Sendo elas necessárias nessa fase, suas concentrações devem
ser muito baixas. Os resultados obtidos nesse experimento permitem afirmar que,
dentre as concentrações testadas, independentemente do tipo de auxina, a
concentração de 0,01 mM foi superior às demais. No entanto, em alguns casos, a
concentração de 0,01mM não diferiu da testemunha, o que permite supor que o
porta-enxerto G x N22 possui uma concentração endógena de auxina capaz de
suprir suas necessidades durante a fase de multiplicação, necessitando de
concentrações extremamente baixas para otimizar os resultados. Lundergan &
Janick (1979) afirmam que as auxinas ajudam a aumentar o tamanho das brotações,
diminuindo os efeitos de 'rosetamento' ou 'entufamento' causados pelas
citocininas. No presente experimento, os dados de tamanho das brotações (Tabela
2) indicam que a menor concentração possibilitou melhores respostas para essa
variável. No entanto, de modo geral, não foram observadas diferenças
significativas em relação à testemunha, reforçando a hipótese de que o 'G x
N22' apresenta um conteúdo endógeno de auxina satisfatório para a fase de
multiplicação.
Experimento 2 - Porta-enxerto Mr.S 2/5
Para este porta-enxerto, as auxinas AIB e AIA não diferiram entre si, sendo
ambas superiores ao ANA (Tabela_3). Rodrigues et al. (1999), trabalhando com o
'Mr.S 2/5', conseguiram em torno de 30 gemas/explante. No presente experimento,
o número médio de gemas obtidas foi muito baixo no melhor tratamento (10,35
gemas/explante). Tal comportamento parece estar relacionado com a fase
anterior, de onde foram retirados os explantes. Estes explantes foram obtidos a
partir de material que vinha sendo intensivamente subcultivado na presença de
concentrações moderadas (0,7 mg.L-1) e sucessivas de BAP. Essa condição pode
ter provocado um efeito tóxico sobre os explantes, impedindo, dessa forma, o
seu desenvolvimento em cultivos subseqüentes. Segundo Grattapaglia &
Machado (1998), o efeito das citocininas não se restringe a um único
subcultivo, já que por vezes, se observa um efeito residual de um subcultivo
para outro. Não foi encontrada nenhuma referência sobre o número máximo de
subcultivos para o Mr.S 2/5. Entretanto, para outras espécies essa informação
existe; é o caso do morangueiro, o qual, segundo Boxus (1986) não deve ser
multiplicado por mais de cinco subcultivos consecutivos na presença de
citocininas, sob o risco de as plantas apresentarem distúrbios fisiológicos. É
possível que os resultados obtidos possam estar relacionados com o elevado
número de subcultivos (mais de 10) a que vinha sendo submetido o porta-enxerto
Mr.S 2/5, já que, segundo Dimassi-Theriou (1998), este porta-enxerto é bastante
usado na Europa, apresentando bons resultados no processo de multiplicação in
vitro.
Experimento 3 - Porta-enxerto Marianna
Nas Tabelas_4 e 5, encontram-se os dados do número de gemas e de brotações,
respectivamente, para o porta-enxerto Marianna. Analisando a Tabela_4,
constata-se que as auxinas AIB e AIA não diferiram entre si, sendo ambas
superiores ao ANA, o mesmo ocorrendo para a variável número de brotações
(Tabela_5). Apenas a testemunha foi significativamente inferior às demais
concentrações. No atual experimento, os explantes foram retirados de material
propagativo que fora subcultivado por mais de 10 vezes. Rodrigues et al.
(1999), trabalhando com este porta-enxerto, obtiveram melhores resultados; no
entanto, o número de subcultivos não passou de 5 (cinco). Boxus (1986) observou
que, além da redução na concentração de BAP no meio de multiplicação, é
interessante limitar o número de subcultivos entre o isolamento do meristema e
a produção da muda.
Experimento 4 - Porta-enxerto Mirabolano
Em observações preliminares, testando tipos de meios e concentrações de BAP,
observou-se que 'Mirabolano' não demonstrou diferenças nas diversas combinações
desses dois fatores. No entanto, esperava-se que, no caso do atual experimento,
isto não ocorresse, já que as doses de auxina usadas foram desde zero (ausência
de auxina) até concentrações altas (1,0 mM) para a fase de multiplicação. Com
isso, pretendia-se encontrar o melhor balanço auxina/citocinina. Quoirin &
Lepoivre (1977) afirmam que, embora nem sempre as auxinas sejam necessárias no
meio de multiplicação, elas são usadas para estimular o crescimento das partes
aéreas. Os resultados obtidos com esse porta-enxerto indicam que mais estudos
na fase de multiplicação devem ser feitos, baseados principalmente no balanço
auxina/citocinina, visto que, para os tipos e concentrações usados, não houve
resposta no desenvolvimento dos explantes. Ao que parece, as concentrações de
auxina a serem testadas, mesmo na fase de multiplicação, deverão ser maiores do
que as usadas neste experimento para o sucesso na multiplicação do
'Mirabolano'.
CONCLUSÕES
a) As auxinas AIB e AIA são superiores à ANA nas variáveis analisadas (número
de gemas e de brotações, tamanho das brotações).
b) Na fase de multiplicação, 'Mirabolano' não responde às concentrações de
auxinas de até 1,0 mM.
c) O 'G x N22' apresenta melhores respostas na concentração de 0,01 mM de AIB
ou AIA.
d) O 'Marianna' responde positivamente à concentração de auxina entre 0,01 e
1,0 mM.
e) A auxina ANA não proporciona bons resultados na multiplicação de porta-
enxertos de Prunus.
f) Número de subcultivos elevados (mais de 10) afetam negativamente a
multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus.
