Efeito de auxinas e condições de cultivo no enraizamento in vitro de porta-
enxertos de macieira 'M-9'
Efeito de auxinas e condições de cultivo no enraizamentoin vitro de porta-
enxertos de macieira 'M-9'1INTRODUÇÃO
A cultura da macieira possui papel de destaque no cenário frutícola brasileiro.
Atualmente, a área cultivada no Brasil está estimada em 30 mil hectares, com
uma produção aproximada de 967 mil toneladas. Na região Sul do Brasil,
concentra-se a maior produção de maçã, onde o Estado de Santa Catarina lidera a
produção com 500 mil ton na safra 99/00, e em segundo lugar, com 427 mil ton, o
Estado do Rio Grande do Sul (ABPM, 2002).
Para atender às demandas de mudas da pomicultura nacional por material
vegetativo, é requerida grande quantidade de material propagativo. Já que as
técnicas convencionais de propagação não possibilitam alcançar tal objetivo a
curto prazo, a micropropagação permite acelerar os métodos convencionais de
propagação vegetativa (Grattapaglia & Machado, 1998).
A formação de raízes adventícias nas partes aéreas obtidas, no estádio de
multiplicação, permite a constituição de plantas completas, para posterior
transferência a condições ex vitro. Muitas vezes, as raízes formadas não
apresentam características adequadas às funções de absorção, determinando,
dentre outros fatores, a morte das mudas, quando transferidas para o solo. O
processo de enraizamento é muito complexo, incluindo fatores fisiológicos,
bioquímicos e biológicos (fatores internos) que interagem com os fatores
externos. Além disso, a complexidade é aumentada pela variabilidade genética
devido à multiplicidade das espécies e cultivares (Assis & Teixeira, 1998).
O controle do desenvolvimento de raízes adventícias é influenciado por
substâncias reguladoras de crescimento. As auxinas são os únicos reguladores de
crescimento que aumentam a formação de primórdios radiculares (Taiz &
Zeiger, 1991).
Embora existam espécies que formam raízes adventícias apenas com os níveis
endógenos de auxina, geralmente é necessário adicionar auxina exógena para
estimular a rizogênese (Grattapaglia & Caldas, 1990). Tipos e concentrações
de auxinas são as variáveis que mais influenciam no enraizamento, e a adição de
outros biorreguladores é desnecessária ou até prejudicial (Grattapaglia &
Machado, 1998). Lee & Ko (1984) observaram efeito inibitório com a
utilização de ácido giberélico na indução das raízes em macieira.
O ácido 3-indolacético (AIA) é a principal auxina das plantas, sendo ativa em
concentrações extremamente baixas. O AIA não é apenas sintetizado nas plantas,
mas também inativado durante os processos de crescimento e diferenciação. A
oxidação do AIA pode ocorrer por um processo de foto-oxidação e através de
reações de oxidação catalisadas por enzimas (AIA-oxidase). Além dos processos
de oxidação, o AIA pode ligar-se a outras moléculas na planta, produzindo
conjugados que podem reter ou perder a atividade auxínica (Salisbury, 1991).
Nos meios de cultura para o enraizamento, tipos e concentrações de auxinas são
as variáveis que, em geral, mais influenciam.
Quando a concentração de auxina no meio é excessiva, ocorre formação de calo na
base do explante, comprometendo a rizogênese e o crescimento da parte aérea.
Uma toxidez de auxina durante o enraizamento pode manifestar-se apenas na fase
de alongamento das raízes. Por esta razão é, às vezes, recomendada a utilização
de dois meios de cultura para a rizogênese. Primeiramente, as partes aéreas
permanecem em meio com auxina, favorecendo a indução e posteriormente passaria
para meio sem auxina, estimulando assim a rizogênese e o crescimento das
raízes. Este processo tem sido adotado com freqüência em espécies lenhosas,
coníferas e frutíferas (Fett Neto et al., 1992).
As auxinas podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação, no meio de
enraizamento, sendo que o AIA, ácido indolilbutírico (AIB) e ácido a-
naftalenoacético (ANA) são as auxinas mais empregadas, em concentrações que
variam conforme a espécie e/ou cultivar. As concentrações mais freqüentes estão
na faixa de 0,5 a 5,0mM (Gattapaglia & Machado, 1998).
Vesco & Guerra (1999), trabalhando com goiabeira serrana, testaram
brotações em meio de enraizamento contendo 1/4 e 1/2 de MS, com adição de AIB
(0,5; 1,2; 5,0 e 15,0 mM) e ANA (2,7 mM) e carvão ativado. Os melhores
resultados foram obtidos em meio basal com 1/4 de MS adicionado de 1,2 mM de
AIB e carvão ativado. Ferri & Fortes (1993) submeteram brotações de kiwi
cv. Matua a tratamentos com reguladores AIB, ANA e AIA nas concentrações de
0,0; 0,5; 1,5 e 4,5 mM adicionados ao meio básico MS. Os autores verificaram
que o AIB foi mais eficaz nas concentrações de 2,8 a 3,8 mM para porcentagem de
enraizamento, número e comprimento de raízes primárias e secundárias. Já o ANA
apresentou concentrações ideais entre 2,5 e 3,5 mM para porcentagem de
enraizamento e número de raízes secundárias, enquanto o AIA, nas concentrações
de 2,4 a 3,0 mM, aumentou o número de raízes e o comprimento destas. Borges et
al. (1997), utilizando 5 mg/l de AIB, obtiveram de 60 a 70% de sobrevivência de
plantas de banana quando transferidas para o solo. De acordo com Pasqual et al.
(1991), mudas de amora-preta desenvolveram bem e apresentaram bom enraizamento
oriundas de meio MS acrescido de AIB ou ANA, na concentração de 0,1 mg/l.
Nunes et al. (1999), trabalhando com o porta-enxerto de macieira Marubakaido,
verificaram que 0,49 mM de AIB resultaram nos melhores índices de enraizamento,
proporcionando 100% dos explantes enraizados no vigésimo quinto dia de cultivo.
Já com relação à cultivar Fred Hough, o AIB e o ANA mostraram respostas
similares na percentagem de enraizamento, sendo 3,0 mM a melhor concentração,
com 90% de explantes enraizados. Explantes tratados com AIA apresentaram
resposta crescente de acordo com a concentração, mas só atingiram 66% de
enraizamento com 5,0 mM (Centellas et al., 1999). O porta-enxerto Marubakaido
apresentou melhor porcentagem de enraizamento quando foi utilizado 3,0 mM de
AIB (Zanol, 1996).
Outro fator que pode influenciar na indução das raízes é a luminosidade, pois a
presença da luz pode ocasionar a redução dos teores endógenos de AIA, assim
como o acúmulo de fenóis e seus subprodutos que inibem o enraizamento (Assis
& Teixeira, 1998).
O porta-enxerto M-9 é o mais utilizado no Brasil e no mundo, tendo como
característica principal controlar o vigor da planta, ou seja, tem efeito
ananizante sobre a copa. Além de reduzir o porte da planta, o M-9 induz mais
rapidamente a frutificação e é um dos únicos porta-enxertos que apresenta boa
resistência à podridão do colo (Phytophthora cactorum) (Barrit, 1999).
Em vista disso, objetivou-se, com o presente trabalho, verificar o efeito de
diferentes tipos e concentrações de auxinas, e avaliar o efeito do escuro no
enraizamento in vitro do porta-enxerto M-9.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas do
Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Rio Grande do Sul.
Em condições assépticas, foram repicados segmentos de brotações terminais com
1cm de comprimento do porta-enxerto M-9, que foram cultivadas em meio MS
(Murashige & Skoog, 1962) (Tabela_1) com os sais reduzidos à metade,
acrescidos de mio-inositol (100mg.L-1) e sacarose (30g.L-1), e pH ajustado para
5,8. Para sua solidificação, foi usado gelrite (2g.L-1). Foram utilizados três
tipos de auxina: AIA, AIB e ANA, em sete concentrações e tratamento-controle
(0,5; 1,0; 5,0; 10; 20; 50 e 100 mM). Os meios contendo os explantes foram
testados sob duas condições de incubação: na primeira, os frascos foram
mantidos na luz (30 dias) e, na segunda, os frascos foram mantidos por cinco
dias no escuro com posterior transferência para luz (25 dias). Em ambas as
condições, os explantes foram expostos aos reguladores vegetais, durante todo o
tempo (luz+auxina e escuro+auxina) ou apenas por dez dias, com posterior
transferência para meio sem auxina (luz-auxina e escuro-auxina). Após os trinta
dias no meio de enraizamento, as plantas foram transplantadas e aclimatizadas
em bandejas de isopor com substrato Plantmax.
As variáveis mensuradas compreenderam: porcentagem de explantes enraizados,
número de raiz por explante, comprimento e tipo de raiz, e porcentagem de
sobrevivência de plantas na fase de aclimatização.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, em esquema
fatorial com quatro repetições, sendo que cada repetição continha 5 explantes,
totalizando 20 explantes por tratamento. As variáveis porcentagem de
enraizamento e de sobrevivência foram transformadas segundo arco-seno raiz
quadrada de x/100 e o número de raízes por explante segundo raiz quadrada de
(x+0,5). Os resultados foram submetidos à análise de variância, sendo utilizado
regressão polinomial para o fator concentração, e comparação de médias pelo
Teste de Duncan, ao nível de significância de 5% para os fatores auxina e
cultivo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A não-utilização da análise de regressão para o fator concentração, deve-se ao
fato de nenhum dos modelos de equações lineares adequarem-se aos dados,
demonstrados pelos baixos coeficientes de determinação (R2). Sendo assim,
optou-se pela comparação múltipla de médias.
Os resultados obtidos durante a fase de enraizamento in vitro evidenciam a
importância das auxinas para o enraizamento de explantes de macieira, cultivar
M-9 (Tabela_2). Pois, nos tratamentos- controle, embora tenha ocorrido a
formação de raízes, a porcentagem foi baixa. Estes resultados estão de acordo
com trabalhos encontrados na literatura, que apontam a necessidade da inclusão
de uma auxina nos meios de enraizamento de espécies frutíferas, como ameixeira
cv. Santa Rosa (Magalhães & Peters, 1991), pereira cv. Carrick (Leite et
al., 1994) e macieira cv. Fred Hough (Centellas et al., 1999).
O AIA induziu maior porcentagem de enraizamento nas concentrações mais altas
(20, 50 e 100mM) no cultivo escuro+auxina (Tabela_2). Isto demonstra que esta
auxina apresenta efeito menos acentuado que as outras auxinas testadas, pois
induziu o enraizamento numa ampla faixa de concentração (0,5 a 100mM). Estes
efeitos também foram verificados por Centellas et al. (1999), quando
trabalharam com macieira cv. Fred Hough, ou seja, obtiveram respostas
crescentes de acordo com a concentração de AIA no meio de cultura. Em
contrapartida, com relação ao AIB e ANA, as maiores respostas ocorreram nas
concentrações mais baixas, ocorrendo uma redução na porcentagem de enraizamento
com aumento da concentração (Tabela_2). Estes efeitos diferenciais podem ser
explicados em função das próprias características de cada auxina. O AIA é
fotooxidado muito rapidamente no meio de cultura (50% em 24 horas), o AIB
levemente (10%), sendo o ANA muito mais estável que o AIA e o AIB (Nissen &
Sutter, 1990). O AIA ainda é, também, fortemente oxidado, principalmente
através da AIA-oxidase (Van Der Krieken et al., 1993). Assim, o melhor efeito
com AIA nas concentrações mais altas pode estar relacionado à eliminação desta
auxina, quando as culturas são transferidas do escuro para a luz. De Klerk et
al. (1997), trabalhando com macieira cv. Jork 9, salientam que cada tipo de
auxina tem velocidade diferente de absorção, o que determina, muitas vezes,
concentrações variáveis destas substâncias no interior das células, para uma
mesma concentração no meio de cultura. Por outro lado, no cultivo luz+auxina,
não houve diferença significativa entre as concentrações utilizadas, mas o AIA
e o ANA foram superiores ao AIB nas concentrações mais altas (50 e 100 mM)
(Tabela_2).
O efeito tóxico do ANA e AIB observado na indução do enraizamento, nas altas
concentrações utilizadas, determinou a formação de calo na base dos explantes e
diminuição do desenvolvimento da parte aérea, principalmente nas concentrações
de 50 e 100mM e no sistema em que os explantes foram submetidos a um período de
escuro. Estes resultados podem ser explicados com base na ação da luz na
degradação destas auxinas (Nissen & Sutter, 1990), bem como do efeito mais
localizado destas substâncias em relação ao AIA (Taiz & Zeiger, 1991).
Outra possível explicação seria o metabolismo diferencial destas auxinas nas
células vegetais. Assim, o ANA seria apenas conjugado, o AIA conjugado e
oxidado, e o AIB conjugado e metabolizado (Smulders et al., 1990).
Quando comparamos os tipos de cultivos, podemos observar que a maioria das
respostas obtidas nos tratamentos luz-auxina e escuro-auxina, aumentaram ou não
diferiram significativamente daquelas obtidas em meios com a presença constante
das auxinas (Tabela_2). Segundo De Klerk et al. (1997), a indução das raízes
adventícias ocorre nos primeiros cinco dias após a transferência para o meio de
enraizamento, ou seja, inferior ao utilizado neste trabalho (dez dias). Assim,
após este período, a presença de auxinas, no meio, afetaria somente o
crescimento das raízes já formadas, para o qual é necessário concentrações mais
baixas (Salisbury & Roos, 1991).
Em relação ao número de raízes por explante, verificaram-se respostas
diferentes em relação à concentração empregada. O AIA induziu maior número de
raízes em altas concentrações, enquanto AIB e ANA em baixas, nos cultivos com
auxina constante no meio (Tabela_3). Pois o AIA, por ser considerada uma auxina
instável, degradando-se facilmente pela ação da luz e/ou pela AIA-oxidase, é
considerada fraca comparada ao ANA e AIB (Caldas et al., 1990). Isso explica,
em parte, as melhores respostas nas concentrações mais altas. Em contrapartida,
quando as brotações foram mantidas por dez dias em meio com auxina, o AIB
apresentou respostas semelhantes entre as concentrações no cultivo escuro-
auxina, e induziu maior número de raízes na concentração mais alta utilizada,
no cultivo luz-auxina (Tabela_3). Estes efeitos diferenciais podem ser devidos,
à presença não constante da auxina no meio de cultura, como também pela
presença da luz, principalmente no cultivo luz-auxina. Pode-se observar que o
número de raízes por explante, obtido nos cultivos em que estes foram mantidos
em meio com auxina por dez dias, aumentou ou não diferiu significativamente
daqueles obtidos em meios com a presença constante das auxinas, na maioria das
concentrações utilizadas (Tabela_3). O que pode explicar este fato, é a toxidez
causada pelas auxinas ao tecido. Estes resultados estão de acordo com Zanol et
al. (1998), que constataram que a transferência de brotações de Marubakaido
para meio sem auxina resultou em menor formação de calo, melhorou a qualidade
das raízes, levando a um melhor desenvolvimento das plantas. Desta forma,
revertem-se os problemas causados pelas altas concentrações de auxinas por
período prolongado. No entanto, aumenta o trabalho no laboratório, aumentando
também os custos (Maene & Debergh, 1987).
Quanto ao comprimento das raízes obtido nas brotações, as respostas foram
similares às observadas para o número das mesmas, sendo o AIA mais efetivo em
altas concentrações e o AIB e o ANA em baixas, em todos os sistemas de cultivo
testados (Tabela_4). Este resultado está condizente com o efeito das auxinas na
indução e crescimento de raízes adventícias. A presença de auxina é necessária
na fase de indução do sistema radicular, conforme se aumenta a concentração da
auxina, diminui o comprimento das raízes nos meios com AIB e ANA, podendo
ocasionar a inibição completa do crescimento da raiz (Salisbury & Roos,
1991). Quanto ao sistema de cultivo, brotações cultivadas no escuro-auxina e
luz-auxina apresentaram maior comprimento radicular ou não diferiram
significativamente dos cultivos com auxina constante no meio, para todas as
auxinas, na maioria das concentrações testadas (Tabela_4). Estes resultados
concordam com Grattapaglia & Machado (1990), que citam que altas
concentrações de auxina, durante o enraizamento, podem manifestar-se na fase de
alongamento das raízes, impedindo o crescimento das mesmas. Assim, a remoção da
auxina do meio reverteu estes efeitos prejudiciais. Estes resultados estão de
acordo com De Klerk et al. (1997), que, trabalhando com cvs. de macieira,
obtiveram alongamento das raízes, pelo uso da técnica da dupla fase.
Brotações tratadas com AIA apresentaram bom sistema radicular, ou seja, não
houve formação de raízes grossas, ocorreu maior presença de raízes secundárias,
menor formação de calo e um bom desenvolvimento da parte aérea, sendo que a
formação de calo ocorreu apenas nas concentrações mais altas (Figura_1). Em
contrapartida, brotações enraizadas com AIB e ANA apresentaram raízes menos
espessas e sem formação de calo apenas nas concentrações mais baixas, ou seja,
0,5 e 1,0 mM, ocorrendo formação de raízes mais grossas e de calo com o aumento
da concentração (Figura_2). Esta diferença entre as auxinas pode ser devida à
maior degradação e menor taxa de absorção de AIA em relação às outras auxinas,
que determinaria acúmulo de ANA e AIB nas células dos explantes (Nissen &
Sutter, 1990).
Na fase de aclimatização, plantas tratadas com AIB e ANA obtiveram alta
porcentagem de aclimatização apenas nas concentrações de 0,5 e 1,0 mM, enquanto
nos tratamentos com AIA, esta porcentagem manteve até 20 mM (Tabela_5). A baixa
porcentagem de sobrevivência das plantas tratadas com AIB e ANA na concentração
de 5,0 mM e a não-sobrevivência destas, nos tratamentos com as concentrações
superiores, ocorreram em função do tipo de raiz e da parte aérea formada, ou
seja, ocorreu a formação de raízes mais espessas e formação de calo na base do
explante original, como também baixo desenvolvimento da parte aérea. Estas
respostas estão de acordo com Mohammed & Vidaver (1990), que relatam que
não é somente o tipo de sistema radicular que determina a sobrevivência após a
transferência do in vitro para as condições ex vitro, ou seja, o bom
desenvolvimento da parte aérea também é fundamental. Altas concentrações de
auxinas, além de induzirem maior formação de calo, que pode ser uma barreira
para a passagem de nutrientes e água para a parte superior da planta, também
ocasiona baixo desenvolvimento da parte aérea em função do excesso de auxina, o
qual causa toxidez à planta, levando a uma senescência foliar, comprometendo
sua sobrevivência (Grattapaglia & Machado, 1998). O contrário ocorreu com
as plantas tratadas nas concentrações de 0,5 e 1,0 mM, as quais apresentaram um
bom sistema radicular, bom desenvolvimento da parte aérea e pouco ou sem
formação de calo, obtendo, assim, alta porcentagem de sobrevivência. Estas
características também foram verificadas nos tratamentos com AIA, porém em uma
faixa mais ampla de concentrações, ou seja, de 0,5 a 20 mM, como também das
plantas obtidas do tratamento- controle. Isto significa que raízes mais finas,
ramificadas e sem a presença de calo determinam melhores condições para uma boa
aclimatização.
CONCLUSÕES
1. As auxinas aumentam o enraizamento in vitro do porta-enxerto de macieira M-
9.
2. O AIA induz melhor enraizamento em concentrações mais altas, e o AIB e o ANA
em concentrações intermediárias.
3. Os sistemas de cultivo escuro-auxina e luz-auxina proporcionam melhor
enraizamento.
4. O AIA proporciona maior porcentagem de sobrevivência numa ampla escala de
concentrações, e o ANA e o AIB nas concentrações mais baixas.
