RAPDs na caracterização genético-molecular e no estudo da variabilidade
genética de cultivares de ameixeira
RAPDs na caracterização genético-molecular e no estudo da variabilidade
genética de cultivares de ameixeira1
RAPDs on genetic-molecular characterization and genetic variabiliti study of
plums
Valmor João BianchiI, *; José Carlos FachinelloII; Márcia Wulff SchuchIII
IEngº. Agrº. M. Sc., Bolsista do CNPq, Doutorando do CPGA-FAEM-UFPel, Campus
Universitário, Fone: (53) 2757124, CP. 354, CEP 96010-900, Pelotas-RS-Brasil.
E-mail: valmorjb@yahoo.com_
IIEngº. Agrº., Dr., Prof. Titular Depart. Fitotecnia, FAEM-UFPel, (53)
2757124, C.P. 354, 96010-900, Pelotas-RS-Brasil
IIIEngº. Agrº., Dra., Prof. Adjunto Depart. Fitotecnia, FAEM-UFPel, (53)
2757124, C.P. 354, 96010-900, Pelotas-RS-Brasil
INTRODUÇÃO
O sucesso no cultivo de plantas frutíferas depende muito da qualidade do
material viveirístico, por isso, garantias de correspondência genético-
sanitárias são fundamentais devido ao alto investimento de tempo e dinheiro
requeridos para implantar um pomar. Segundo Ortiz et al. (1997), a propagação
de plantas frutíferas realizada de forma não controlada tem conduzido a perda
da identidade de inúmeros genótipos. A correta identificação varietal e o
conhecimento da variabilidade genética em espécies frutíferas são importantes
para programas de melhoramento genético e para comercialização.
De acordo com Goulão et al. (2001), existe pouco conhecimento sobre a
variabilidade genética das cultivares de Prunus salicina (Lindl.), incluindo
seleções recentes e seus híbridos envolvendo várias outras espécies (P.
armeniaca, P. munsoniana e outros) e também sobre o número de genitores
utilizados em programas de melhoramento. Devido ao fato de muitas cultivares de
ameixeiras serem auto-incompatíveis e híbridos naturais, Shimada et al. (1999)
citam que estas características dificultam a verificação da pureza da espécie
bem como a classificação de algumas cultivares.
Até pouco tempo, a identificação varietal era baseada na avaliação das
características morfo-fenológicas e pomológicas (Sansavini, 1998), porém, este
tipo de análise apresenta várias limitações como: requer muito tempo para ser
completada, não permite acessar todo o genoma da planta, deixa várias dúvidas
quando se trata de genótipos com características muito similares, como
verificado em pessegueiro e não pode ser realizada em qualquer período do ano
ou ciclo da planta.
Em alternativa, novas metodologias foram introduzidas para a análise genética
de plantas. Inicialmente tem sido feito o uso de isoenzimas (Byrne &
Littleton, 1988) e, posteriormente, RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) têm
sido utilizados na elaboração de "fingerprintings" em espécies que
apresentam grande variabilidade genética, como ameixeira, pereira e macieira
(Mulcahy et al., 1993; Cassas et al., 1999; Monte-Corvo et al., 2000).
Entre as várias espécies do gênero Prunus, a ameixeira é aquela que apresenta a
maior variabilidade. Em trabalhos realizados por Gregor et al. (1994), Grando
& Vindimian (1996), Ortiz et al. (1997), Bellini et al. (1998) e Shimada et
al. (1999), RAPDs produziram suficiente polimorfismo para estudos de filogenia
e na análise "fingerprinting" de cultivares de ameixeira. Na análise
de 17 cultivares de ameixeira dos gêneros P. domestica e P. salicina, com 67
"primers" RAPD, Pancaldi et al. (2000) verificaram que a técnica foi
capaz de diferenciar 15 cultivares, porém não diferenciou as cultivares de P.
domestica, Empress e Grossa di Felisio.
Para contribuir na caracterização de cultivares de ameixeira de maior difusão
na Região Sul do Brasil, no presente trabalho buscou-se testar os limites e
potencialidades da técnica RAPD na análise "fingerprinting" e na
estimativa da variabilidade genética de 17 cultivares de ameixeira.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos do
Departamento de Botânica, Instituto de Biologia da Universidade Federal de
Pelotas - UFPel, Pelotas - RS, no período de outubro de 2001 a abril de 2002.
O material vegetal utilizado para as análises foram cultivares de ameixeira
japonesa (Prunus salicinaLindl.), cultivares de ameixeira européia (Prunus
domestica L.) e a cultivar Mirabolano 29C (Prunus cerasiferaEhrh.), conforme
consta na Tabela_1. Obteve-se o DNA de 70 mg de folhas liofilizadas e a
extração realizada conforme metodologia descrita por Mulcahy et al. (1993), com
modificações descritas por Bianchi et al. (2002). Após tratamento com RNAse, o
DNA foi quantificado e diluído em água estéril para concentração final de 15
ng.mL-1, para utilização na reação de polimerização em cadeia (PCR).
Para as amplificações utilizou-se um total de 17 "primers" decâmeros
dos kits da Operon ' OP (OP A01, OP A07, OP A15, OP A17, OP A18, OP A20, OP
AC19, OP AC20, OP AD16, OP AF15, OP AN19, OP AN20, OP B01, OP B19 e OP B20) e
da British Columbia University - UBC (UBC 407 e UBC 412). As reações de
amplificação foram realizadas em um aparelho termociclador MJ PTC-100,
utilizando o perfil térmico conforme Koller et al. (1993). O volume total da
mistura de reação foi de 25 mL, contendo: 2,5 mL Tampão 10X (10 mM Tris-HCl pH
9,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2), 3,75 mM de cada dNTP, 10 mM de cada primer, 1
Unidade de Taq polimerase (Invitrogen) e 30 ng de DNA genômico, conforme
descrito por Pancaldi et al. (2000).
Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
1,2%; a coloração feita com brometo de etídeo e as bandas visualizadas em luz
ultravioleta. As reações de amplificação foram repetidas três vezes para cada
"primer" e indivíduo, e para a análise somente foram considerados os
dados dos "primers" que produziram bandas que se repetiram em todas
as amplificações.
Os perfis eletroforéticos obtidos sobre o gel foram utilizados para a direta
diferenciação entre genótipos e para a construção de uma matriz de similaridade
genética, que foi elaborada com os dados produzidos por cada
"primer", registrando-se a presença (1) e ausência (0) de bandas no
perfil eletroforético para cada um dos genótipos. A similaridade genética foi
calculada usando o coeficiente DICE GS (i j) = 2 a / 2 a + b + c, onde a =
número de bandas polimórficas condivididas; b = número de bandas em i e c =
número de bandas em j) com "software" NTSYS.pc versão 1.8 (Rohlf,
1993). Realizou-se análise de agrupamento para construir um dendrograma de
similaridade, empregando o método UPGMA (Unweighted pair group mean average),
de acordo com os dados obtidos com os marcadores RAPD.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 17 "primers" RAPD testados foram utilizados somente os produtos
amplificados de 12 "primers" (OP A01, OP A07, OP A15, OP A17, OP A18,
OP A20, OP AC19, OP AD16, OP AN19, OP B01, UBC 407 e UBC 412), os quais
produziram um total de 199 perfis. Destes, apenas 12 foram monomórficos e os
demais, 187 (93,97%), foram polimórficos. Alguns produtos polimórficos são
apresentados na Figura_1. O número médio de polimorfismos obtido por marcador
foi de 15,58. Entre os 12 "primers" utilizados registrou-se a
presença de 45 perfis únicos, sendo que Mirabolano 29C apresentou o maior
número de bandas exclusivas (17 no total). Todos os marcadores geraram bandas
únicas para alguns dos genótipos, variando de 2 a 7 bandas para os marcadores
OP B01 e OP AD16 e para os marcadores OP A18 e OP AC19, respectivamente. A
única exceção foi o marcador OP A07 que não produziu nenhuma banda
característica.
Os marcadores utilizados permitiram diferenciar de maneira bastante segura cada
genótipo de ameixeira analisado. Porém, Byrne & Littleton (1988)
verificaram que o uso de isoenzimas para o "fingerprinting" de 29
cultivares de ameixeira não permitiu identificar todos os genótipos, mas apenas
38% do total analisado.
Os resultados obtidos neste trabalho, com os marcadores RAPD, confirmam o alto
grau de polimorfismo entre as diferentes espécies e cultivares de ameixeira,
conforme verificado por Gregor et al. (1994), Ortiz et al. (1997) e Bianchi et
al. (2002). Isso pode também ser atribuído à presença de cultivares de três
espécies diferentes (Tabela_1), P. salicina, P. domestica e P. cerasifera
(Mirabolano 29C), esta última incluída no conjunto de genótipos para verificar
o potencial de uso da técnica RAPD em separar cultivares de diferentes espécies
do mesmo gênero.
Considerando somente os perfis eletroforéticos das ameixeiras japonesas também
se obteve alto polimorfismo, com um total de 150 bandas, destas, 134 (89,33%)
foram polimórficas e 16 (10,67%) monomórficas. Em trabalho conduzido por
Bianchi et al. (2002), as cultivares Santa Rosa, Letícia, Santa Rita, Pluma 7,
América e Reubennel foram analisadas com marcadores moleculares SSR e AFLP e
com uma única combinação de "primers" AFLP foi suficiente identificar
as seis cultivares como P. salicina, o mesmo aconteceu quando utilizado o
marcador SSR UDP96-019. Os resultados obtidos por estes autores estão em
concordância com aqueles obtidos neste trabalho, verificando-se que o
agrupamento destas seis cultivares ocorreu de maneira similar ao obtido com os
marcadores AFLP e SSR.
O uso de marcadores RAPD permitiu uma clara separação das 3 espécies de
ameixeira analisadas (Figura_2). Com o uso de 12 marcadores RAPD, a maior
similaridade genética foi observada entre as cultivares de Prunus salicina,
Irati e Amarelinha (83.06%), seguido das cultivares de P. doméstica, Stanley e
D'Agen (81,89%).
No grupo da espécie P.salicina (Figura_2), verifica-se que as cultivares The
First e Ozark Premier apresentam-se com maior distância genética em relação às
outras cultivares desta espécie, a qual pode ser atribuída a possível
contribuição de outras espécies, como P.domestica e P.cerasifera, na
constituição genética destas cultivares. O caráter híbrido da ameixeira é
confirmado com base na constituição genética da cultivar Ozark Premier (Burbank
x Methley) ¾ de P. salicina + ¼ de P. cerasifera (Byrne & Littleton, 1988).
Ortiz et al. (1997) também atribuem esta alta variabilidade genética observada
entre cultivares de ameixeira a parcial auto-incompatibilidade que existe entre
os diferentes genótipos.
As demais cultivares de P. salicina, pela distribuição no dendrograma,
possivelmente possuem na constituição genética contribuição, principalmente, de
P. salicina, P. americana e P. simonii, conforme relatado por Byrne &
Littleton (1988), para as cultivares Santa Rosa, Frontier e Wade.
As cultivares de P. domestica ficaram em um grupo intermediário no dendrograma,
tendo Mirabolano 29C separado de todos os demais genótipos (Figura_2). Esse
dado leva a interpretar que P. cerasifera é mais próxima geneticamente de P.
domestica que de P. salicina. De acordo com Watkins, 1976 apud Bellini et al.
(1998), isso ocorre devido a P. cerasifera ter o centro de origem geográfica
próximo do centro de origem de P. domestica (Leste Europeu). Por outro lado,
Reynders & Salesses (1991) sugerem que as ameixeiras hexaplóides (P.
domestica) tenham sido originadas de formas poliplóides de P. cerasifera. De
qualquer forma, ambas teorias confirmam a existência de parentesco entre estas
duas espécies.
CONCLUSÕES
A caracterização molecular de genótipos de ameixeira, analisados neste
trabalho, pode ser realizada de forma eficiente através dos marcadores RAPD.
Resultados significativos foram obtidos com estes marcadores, permitindo
estimar a variabilidade genética entre genótipos de ameixeira e diferenciação
das espécies.
