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BrBRCVAg0100-29452004000200024

BrBRCVAg0100-29452004000200024

variedadeBr
Country of publicationBR
colégioLife Sciences
Great areaAgricultural Sciences
ISSN0100-2945
ano2004
Issue0002
Article number00024

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Embriogênese somática do caquizeiro PROPAGAÇÃO

Embriogênese somática do caquizeiro1

Somatic embryogenesis of japanese persimmon

Dayse Cristina de CarvalhoI; Luiz Antonio BiasiII; Luciana Lopes Forets RibasIII; Charles Allan TellesIV; Flávio ZanetteV IEngª Agrª, MSc. Aluna do Programa de Pós-Graduação em Agronomia. ESALQ/USP. E- mail: dayse@esalq.usp.br IIProfessor Adjunto do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de Ciências Agrárias. UFPR. Caixa Postal 19.061. CEP 81.531-990. Curitiba-PR.

Fone/Fax (41) 350-5601. E-mail: biasi@ufpr.br. Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq IIIProfessora Adjunta do Departamento de Botânica. Setor de Ciências Biológicas. UFPR IVAluno do Curso de Agronomia. UFPR. Bolsista de Iniciação Científica do CNPq VProfessor Titular do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de Ciências Agrárias. UFPR

INTRODUÇÃO A propagação convencional de caquizeiros pela via sexuada é difícil, devido ao seu longo período juvenil, elevado porte das plantas e heterozigoze. Além disso, o cruzamento é prejudicado pelo limitado número de cultivares, que carregam flores masculinas e/ou hermafroditas (Choi et al., 2001). A propagação vegetativa via enxertia é também dificultada pelo fato de os porta-enxertos serem provenientes de sementes, o que causa grande desuniformidade quanto ao porte e vigor das plantas, além de ser um processo demorado, oneroso e com baixas taxas de pegamento (Biasi et al., 2002).

A solução para este problema passa pelo desenvolvimento de uma tecnologia de propagação vegetativa para a formação direta das mudas ou de porta-enxertos, o que representará um significativo avanço na cultura do caquizeiro (Martins & Pereira, 1989).

Barros (1999) ressalta que dentre os processos de micropropagação, a embriogênese somática é, teoricamente, a melhor opção para a propagação in vitro de fruteiras por apresentar algumas vantagens, tais como: a alta taxa de multiplicação comparada a qualquer outro processo de propagação; o escalonamento da produção pela manutenção da cultura em meio líquido; o plantio direto da muda obtida via embriogênese somática sem necessidade de enxertia, com menor custo de produção, além de a planta ser geneticamente igual à planta- mãe, sem as influências do porta-enxerto, como acontece com as plantas obtidas por métodos de propagação vegetativa convencionais.

O trabalho pioneiro com a indução da embriogênese somática a partir de tecidos de caquizeiro foi realizado por Hirokazu et al. (1998), no Japão, trabalhando com segmentos foliares provenientes de plantas obtidas de ápices meristemáticos cultivados in vitro, em meio MS½NO3 suplementado com BAP e ANA, em diferentes concentrações. Posteriormente, não se encontraram trabalhos semelhantes publicados, ainda que se saiba que a técnica de indução da embriogênese somática seja uma ferramenta com grande potencial para a propagação massal do caquizeiro. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um protocolo para a embriogênese somática do caquizeiro a partir de embriões zigóticos. Esse protocolo poderá servir de embasamento para futuros estudos com tecidos somáticos, que os tecidos de origem zigótica apresentam variabilidade natural decorrente do cruzamento.

MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Micropropagação de Plantas do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo do Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná. Como explantes, foram utilizados embriões zigóticos em diversos estádios de desenvolvimento, retirados de frutos coletados de plantas adultas de caquizeiro do tipo 'Café', a partir de quatro semanas após o pleno florescimento até 22 semanas. A assepsia foi realizada nos frutos inteiros quando possuíam até 3,5 cm de diâmetro e posteriormente nas sementes, com etanol 70% por um minuto, imersão em solução de hipoclorito de sódio 2,5% por trinta minutos e quatro lavagens em água esterilizada.

Efeito do estádio de desenvolvimento do embrião zigótico na indução de culturas embriogênicas.

Foi avaliado o melhor estádio de desenvolvimento do embrião zigótico para induzir a formação de massas embriogênicas, sendo testados seis estádios, a partir de quatro semanas após o florescimento, até a maturação com 22 semanas.

Em cada coleta, foram isolados 40 embriões em dois meios de cultura, um livre de reguladores e outro contendo 20 µM de 2,4-D e 2 µM de cinetina. O meio de cultura utilizado foi o MS½NO3 solidificado com 5,5 g.L-1 de ágar. Os frascos foram mantidos no escuro e avaliados após 90 dias pela porcentagem de explantes com calo. Os 40 calos obtidos no primeiro isolamento foram repicados para dois meios de cultura, um com 10 µM e outro com 20 µM de 2,4-D, ambos acrescidos com 2 µM de cinetina. Os explantes foram mantidos no escuro e avaliados após 60 dias do isolamento, pela porcentagem de calos com massas pró-embriogênicas.

Efeito de reguladores de crescimento na manutenção e multiplicação das culturas embriogênicas As culturas pró-embriogênicas obtidas no experimento anterior foram identificadas e utilizadas neste experimento. O meio de cultura utilizado foi o MS½NO3 com 2 µM de cinetina e as concentrações de 2,5; 5 e 10 µM de 2,4-D. O delineamento foi em blocos ao acaso, com cinco repetições e dez calos por parcela. Os explantes permaneceram no escuro e foram avaliados após 90 dias pela porcentagem de calos com culturas embriogênicas e número de embriões globulares por calo.

Efeito de reguladores de crescimento na maturação dos embriões somáticos As culturas embriogênicas desenvolvidas no experimento anterior foram identificadas e utilizadas neste experimento. O meio de cultura utilizado foi o MS½NO3 com 0,5 µM de AIB e as concentrações de 5; 10 e 20 µM de 2-iP. O delineamento foi em blocos ao acaso, com cinco repetições e dez calos por parcela. Os explantes foram mantidos no escuro e avaliados após 60 dias pela porcentagem de calos com massas embriogênicas, número de embriões globulares, cordiformes, torpedos e cotiledonares por calo.

Efeito de reguladores de crescimento na conversão de embriões somáticos em plantas Os primeiros cinqüenta embriões formados foram individualizados e cultivados em meio de cultura MS½NO3 com 5 µM de 2-iP, 5 µM de AG3 e 0,5 µM de AIB para a sua conversão em plantas. As culturas foram mantidas na luz, e a avaliação foi realizada após 30 dias pela porcentagem de embriões convertidos em plantas, comprimento médio da raiz e da parte aérea e número de folhas por planta.

Depois foi instalado um experimento de conversão, testando diferentes concentrações de BAP. O meio de cultura foi o MS½NO3 suplementado com 0,5 µM de AG3 e 0; 0,25; 0,5 e 1,0µM de BAP. O delineamento foi em blocos ao acaso, com 3 repetições e 10 embriões por parcela. Os embriões foram mantidos na luz, e a avaliação foi realizada após 30 dias pela porcentagem de embriões convertidos em plantas, porcentagem de embriões oxidados, comprimento da parte aérea e da raiz, e número de folhas por planta.

A sala de crescimento possuía iluminação com lâmpadas fluorescentes do tipo branca fria, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 40 µmol.m-2.s-1.

A análise estatística foi realizada com o programa computacional MSTAT, sendo que, inicialmente, os dados foram analisados pelo teste de Bartllet para testar a homogeneidade das variâncias dos tratamentos e aqueles não-homogêneos foram transformados para a análise. Depois foi realizada a análise de variância e o teste de Tukey, a 5% de probabilidade de erro, quando o efeito dos tratamentos foi significativo pelo teste F.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Efeito do estádio de desenvolvimento do embrião zigótico na indução de culturas embriogênicas Quanto às fontes de explantes testadas no presente trabalho, apenas os embriões zigóticos maduros (frutos com 22 semanas de formação) permitiram a indução e o desenvolvimento dos embriões somáticos no meio suplementado com reguladores de crescimento. Os explantes isolados em meio de cultura sem reguladores de crescimento não formaram calos. A formação de calos escuros ocorreu em 86,7% dos quarenta explantes isolados de frutos a partir de 18 semanas de desenvolvimento, em meio suplementado com 20 µM de 2,4-D mais 2 µM de cinetina, indicando que embriões com idade inferior apresentam fatores intrínsecos à sua maturidade fisiológica que bloquearam uma resposta aos reguladores de crescimento nas concentrações testadas e ao desencadeamento do processo de embriogênese somática.

Aos 150 dias de cultivo dos explantes, foi possível verificar a formação de complexos ou massas celulares pró-embriogênicas em 52% dos calos cultivados em meio suplementado com 10 µM de 2,4-D mais 2 µM de cinetina (TABELA_1). Estes complexos caracterizam-se por serem regiões friáveis, normalmente branco- translúcidas e mucilaginosas quando comparados com calos não-embriogênicos que foram esverdeados e duros. Os embriões maduros apresentaram o padrão indireto de embriogênese, induzindo inicialmente uma massa celular embriogênica, com embriões somáticos desenvolvendo-se em sua superfície (FIGURA_1).

Efeito de reguladores de crescimento na manutenção e multiplicação das culturas embriogênicas Houve uma evolução dos pró-embriões para o estádio globular, mais pronunciadamente no tratamento com 5 µM de 2,4-D, apesar de não diferir significativamente das demais concentrações (TABELA_2). A transferência das culturas embriogênicas para um meio sem reguladores de crescimento ou com a concentração de 2,4-D reduzida é normalmente necessária para a produção de embriões somáticos (Sharp et al., 1980). Nesta etapa, a estratégia consiste em determinar as condições adequadas para o estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão celular e o controle restrito dos processos de diferenciação, de tal maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou embriões somáticos em estádios iniciais de desenvolvimento (Guerra et al., 1999). Observou-se, na superfície das massas celulares de caquizeiro, a formação de embriões somáticos globulares (FIGURA_2), e a manutenção destas culturas em meio basal, acrescido de 2,4-D, nas três concentrações testadas, induziu a formação de pró-embriões e embriões somáticos globulares num processo contínuo.

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Efeito de reguladores de crescimento na maturação dos embriões somáticos As culturas constituídas de embriões somáticos globulares, que foram transferidas para meios de cultura suplementados com citocininas, apresentaram avanço para outros estádios ontogenéticos, como cordiforme, torpedo e cotiledonar, desenvolvendo-se de forma assincrônica, não havendo diferença estatística entre as concentrações de 2-iP (TABELA_3). Nesta fase da embriogênese somática, compreende a progressão das fases iniciais para as fases tardias. A estratégia a ser empregada consiste em interromper os ciclos repetitivos de divisão celular e fornecer estímulos fisiológicos, bioquímicos e ambientais para a diferenciação celular, para que os ciclos de desenvolvimento e de maturação originem um grande número de embriões somáticos maduros, de alta qualidade e aptos a se converterem em plantas (Guerra et al., 1999). Segundo Gray (1992), os embriões somáticos que se formam a partir de complexos pró- embrionários tendem a se desenvolver de forma assincrônica, sendo que, em determinado tempo, vários estádios ontogenéticos são observados nas culturas (FIGURA_3). Da mesma forma, Guerra & Handro (1998), trabalhando com culturas embriogênicas de Euterpe edulis repicados para meio de cultura contendo 2-iP e ANA, obtiveram a progressão dos embriões somáticos ao mesmo tempo que a cultura-matriz mantinha a sua competência embriogênica.

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Efeito de reguladores de crescimento na conversão de embriões somáticos em plantas No teste preliminar de conversão, obteve-se, a partir de cinqüenta embriões no estádio torpedo, a conversão em plantas de 75,5% destes, com uma média de 0,85 cm de comprimento de raiz, 1,25 cm de parte aérea e 1,31 folha por plântula quando cultivados em meio suplementado com 5 µM de 2-iP, 5 µM de AG3 e 0,5 µM de AIB.

Num segundo experimento, investigou-se a conversão dos embriões em plantas pela utilização da citocinina BAP em diferentes concentrações e os melhores resultados quanto ao comprimento das raízes e número de folhas por planta foram obtidos no tratamento de 1 µM, como pode ser observado na TABELA_4. O fenótipo das plantas em meio suplementado com BAP deu-se de forma normal, sem alterações morfológicas visualmente perceptíveis. Contudo, a conformação morfológica das plântulas mostrou-se alterada, sendo o fato representado por folhas encarquilhadas, fusionadas e coriáceas (FIGURA_4). Segundo Redenbaugh et al.

(1988), para que ocorra conversão, os embriões somáticos têm de realizar uma série de eventos: germinação (emissão da radícula), crescimento e desenvolvimento do sistema radicular, produção de, no mínimo, duas folhas verdadeiras, conexão direta da raiz com a parte aérea e produção de uma planta verde com fenótipo normal. Guerra et al. (1999) citam que o efeito das auxinas como indutoras da embriogênese somática pode também acarretar a formação de embriões anômalos quando estes passam por prolongados períodos em meios suplementados com estas substâncias. Para Raemakers et al. (1995), o desenvolvimento de embriões somáticos malformados e/ou a formação de folhas carnosas com caules fasciados é conseqüência de maturação insuficiente. Esse fenômeno tem sido observado para muitas espécies e é denominado de germinação precoce, que se refere ao embrião em desenvolvimento que tende a desviar-se dos estádios normais de embriogênese somática e adquirem características de uma plântula malformada.

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CONCLUSÕES Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram o estabelecimento do seguinte protocolo para a embriogênese somática do caquizeiro a partir de embriões zigóticos: utilizar como explantes embriões zigóticos maduros, retirados de frutos com 22 semanas de formação; cultivá-los em meio de cultura MS½NO3 suplementado com 10µM de 2,4-D e 2 µM de cinetina para o desenvolvimento de pró-embriões; transferir as culturas embriogênicas para meio basal com 5 µM de 2,4-D e 2 µM de cinetina para a evolução do estádio globular; transferir as culturas embriogênicas para meio basal com 0,5 µM de AIB e 2i-P em concentrações de 5 a 20 µM para a promoção dos embriões globulares a estádios mais avançados da ontogenia, como cordiforme, torpedo e cotiledonar; e transferir os embriões para meio basal com 1 µM de BAP e 0,5 µM de AG3 para a conversão em plantas.


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