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BrBRCVHe0004-28032005000100012

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variedadeBr
ano2005
fonteScielo

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Pancreatite aguda experimental induzida pela L-arginina: avaliação histológica e bioquímica GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTALINTRODUÇÃO A pancreatite aguda pode apresentar-se como um distúrbio suave e autolimitado, ou sob a forma de doença grave de evolução muitas vezes fatal(21, 25). Apesar das modernas tecnologias disponíveis(4, 8, 17), ainda persistem dúvidas acerca de inúmeros aspectos da patogenia e fisiopatologia da doença e, portanto, da melhor terapêutica a ser adotada(3, 21). Baseados nestes fatos, pesquisadores têm buscado métodos de indução de pancreatite através de meios experimentais em diferentes espécies animais(2, 3, 13, 22). O modelo adequado deve ser tecnicamente simples e possuir características evolutivas que provoquem no animal alterações pancreáticas semelhantes àquelas observadas em seres humanos.

Com esse propósito, executou-se um modelo de pancreatite aguda experimental que utiliza a L-arginina, aminoácido essencial, barato e disponível no comércio, que administrado por via intra-peritonial, desencadeia pancreatite aguda em ratos(6, 12, 16, 19, 23, 24)e permite estudar as alterações histológicas e bioquímicas durante a instalação, desenvolvimento e reparação do processo inflamatório pancreático.

MATERIAL E MÉTODOS Animais de experimentação Caracterização da amostra ' Utilizaram-se no experimento 105 ratos Wistar (Rattus norvegicus ' Rodentia ' Mammalia) machos, albinos não-isogênicos, com peso compreendido entre 182,4 g ± 12,6 g, fornecidos pelo Biotério do Instituto de Tecnologia do Paraná, Curitiba, PR, e manipulados conforme normas para trabalhos experimentais publicadas no livro de GOLDIM e RAYMUNDO(10).

Ambiente de experimentação O experimento deste estudo foi executado no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná, Curitiba, PR.

Delineamento experimental Dividiu-se a amostra em 2 grupos, conforme demonstrativo abaixo:

Injeção da L-arginina Preparo da solução 'Foram pesados 20 g de L-arginina (Merck® artigo 1.01542), diluindo-se em volume final de 100 mL de solução fisiológica, ajustando-se o pH entre 6,8'7,4 com solução tampão de fosfatos. Esterilização em membranas de 0,22 µ (Millipore®). Preparo imediato antes do uso.

Injeção por via intraperitonial 'Ratos machos Wistar nutridos com alimentação específica para a espécie ad libitum, eram distribuídos aleatoriamente em caixas de polipropileno identificadas, com cinco animais cada e que foram deixados em jejum durante a noite prévia ao experimento. Após pesagem, os animais receberam injeção intraperitonial de 500 mg/100 g de peso corporal de L-arginina. O volume total calculado foi dividido em doses iguais e injetado em duas etapas com intervalos de 15 minutos, em um dos quadrantes inferiores abdominais. Os ratos controle receberam o mesmo volume de solução fisiológica 0.15 M. Todos os animais receberam alimentação à vontade após a injeção.

Coleta de amostras e sacrifício de animais Análise laboratorial ' Para a coleta de sangue, os animais foram anestesiados por inalação com éter sulfúrico e cuba plástica apropriada. A seguir, foram colocados em decúbito dorsal e com seringa de 10 mL e agulha de 25 x 8 mm procedia-se à punção cardíaca transtorácica. O sangue coletado foi centrifugado a 700 rpm durante 10 minutos, separando-se a seguir o soro para as determinações de amilase através do método enzimático cinético a 405 nm, efetuadas em equipamento automatizado ' Sistema COBAS ' MIRA "S".

Análise Histológica 'Após a coleta de sangue, os animais foram recolocados em cuba sob inalação letal de éter sulfúrico. Posteriormente ao sacrifício, os animais foram submetidos a abertura ampla da cavidade abdominal, sendo retirado o pâncreas para avaliação histológica.

O pâncreas retirado era colocado em formaldeído a 10% pelo período mínimo de 48 horas para adequada fixação. Secções foram feitas através do longo eixo da glândula, coradas com hematoxilina-eosina e examinados por microscopia óptica (2). Todos os cortes histológicos foram examinados sem o conhecimento do grupo a que pertenciam e ao período em análise. Foram considerados os seguintes padrões histológicos: edema, infiltração inflamatória, hemorragia e necrose parenquimatosa(20, 24). O padrão histológico foi definido de acordo com a presença e predominância das alterações microscópicas descritas no Quadro_1.

Estudo estatístico Nas comparações entre dois grupos independentes, o teste aplicado foi o de Mann-Whitney e quando da comparação de mais de dois grupos independentes, o teste aplicado foi o de Kruskal-Wallis. Em todos os testes foi adotado o nível de significância de P <5%(7, 9).

RESULTADOS Níveis de Amilase Na Tabela_1 são apresentados, para cada grupo e em cada momento analisado, as médias, os desvios-padrão e os valores de P obtidos através da aplicação do teste de Mann-Whitney.

Observou-se que na avaliação realizada nos períodos de 6, 12, 24, 72 horas e 7 dias, as médias dos valores de amilase nos grupos controle e experimento são significativamente diferentes ao nível de 5%.

O Gráfico_1 apresenta a evolução dos valores médios de amilase ao longo dos períodos analisados nos dois grupos.

Exame histológico Para a análise dos exames histológicos no grupo experimento, os resultados foram ordenados de acordo com as diversas combinações dos níveis de gravidade de edema e necrose, da situação menos grave para a mais grave (de 1 a 13), determinando-se estas ordenações por graus. Os números de casos observados, segundo esta ordenação, e os graus médios em cada período do estudo são apresentados na Tabela_2.

O Gráfico_2 apresenta os graus médios (gravidade) relativos ao exame histológico para cada um dos momentos do estudo.

Analisando os resultados dos testes e os graus médios, observou-se que a situação histológica agravou-se significativamente a partir de 6 horas até 24 horas. De 24 horas a 48 horas, não se observou diferença significativa nos aspectos histológicos. A histologia demonstrou aspecto de agravamento no período compreendido entre 48 e 72 horas e melhora progressiva do dia para 7 dias e 14 dias.

No grupo controle, a análise microscópica do parênquima pancreático estava histologicamente preservada em todos os momentos considerados. As Figuras_1 e 2 mostram fotos do pâncreas após injeção de L-arginina.

DISCUSSÃO TANI et al.(24), demonstraram novo modelo experimental de pancreatite aguda necrotizante em ratos induzido por uma única injeção intraperitonial 9+de L- arginina. Em trabalhos anteriores, neste laboratório, observou-se que a injeção de L-arginina em dose única de 500 mg/100 g de peso corpóreo, em ratos pesando entre 350 g e 450 g, produz mortalidade em decorrência de trombose mesentérica.

Assim, no presente estudo, a dose total foi dividida em duas injeções, com intervalo de 15 minutos e os ratos selecionados pesando, desta vez, 130 g a 150 g, com o intuito de excluir tal intercorrência.

Neste estudo, os níveis de amilase sérica permaneceram constantes nos animais do grupo controle, mas elevaram-se significativamente nos animais que receberam injeção de L-arginina. Todos os animais que receberam L-arginina intraperitonial demonstraram aumento na atividade da amilase sérica mais pronunciado no período de 12 horas e retornaram aos níveis dos controles em 48 horas. Embora os níveis séricos de amilase tenham demonstrado maior elevação entre 12 e 24 horas após a injeção de L-arginina, a maioria das alterações severas, como a necrose de células acinares, foi encontrada em 72 horas. A significativa redução de síntese das enzimas pancreáticas, em período subseqüente às 72 horas após indução de pancreatite, pode resultar em diminuição dos seus níveis séricos. Nesta etapa, observou-se que os valores de amilase foram significativamente menores nos ratos do grupo com pancreatite, quando comparados com o controle no período de 72 horas e que retornaram aos níveis basais em 2 semanas, acompanhando a regeneração pancreática, como evidenciado pelos padrões histológicos neste período de evolução.

Estes achados permitem referir que os níveis de amilasemia não se correlacionam diretamente com a gravidade da inflamação. A maior parte dos autores são concordes quanto à especificidade da elevação da amilase sérica ser deficiente como valor de prognóstico da pancreatite aguda(18). Até mesmo a correlação inversa entre este parâmetro e a severidade da lesão pancreática aguda, como observada nos períodos de 72 horas e 7 dias deste experimento, foram descritas e atribuídas ao declínio na capacidade de secreção quando o dano celular pancreático é severo(1, 5). Esta análise é compatível com a observação de que os níveis mais altos de amilase sérica são encontrados nos modelos experimentais de pancreatite caracterizados por edema intersticial e morte mínima de células(11). No presente estudo e em concordância com estudo previamente realizado(20), o edema pancreático, que não é indicador de severidade, demonstrou melhor correlação com a hiperamilasemia, sendo que os índices usuais para o diagnóstico de pancreatite severa, como necrose acinar, apresentam correlação inadequada ou mesmo inversa com o nível da amilase sérica.

No exame histológico, após a injeção de L-arginina durante os períodos de 6, 12 e 24 horas, verificou-se infiltração progressiva no interstício e tecido pancreático de leucócitos polimorfonucleares, linfócitos e macrófagos. Após 6 horas da aplicação de L-arginina, não se observaram edema intersticial pancreático ou necrose de células acinares. Após 12 horas, observou-se edema intersticial com discreta infiltração de células inflamatórias e, decorridas 24 horas, evidenciaram-se ácinos separados por importante edema intersticial. No período entre 24 e 48 horas não ocorreram alterações histológicas significativas.

Evidenciou-se que, a partir do dia, iniciaram-se focos de necrose nas células acinares e que a necrose comprometia grande parte do parênquima, provocando desordem da arquitetura pancreática, lesões de células acinares e intenso processo inflamatório agudo ao progredir de 72 horas. Nesta fase do estudo, constatou-se que as células acinares pancreáticas haviam sido progressivamente destruídas, que os ductos pancreáticos encontravam-se dilatados e repletos de muco, enquanto as ilhotas de Langerhans pareciam preservadas. O estudo histológico, 7 dias após a aplicação de L-arginina, mostrou melhora considerável do edema e da necrose pancreática. Embora se devam considerar as dificuldades em estimar a percentagem de extensão da necrose tecidual, os baixos níveis de enzimas pancreáticas séricas nestes períodos sugerem significativa necrose das células acinares. Ao final do estudo observou-se, pela histologia do 14º dia pós-injeção de L-arginina, que a arquitetura original pancreática havia sido restaurada.

Trabalhos recentes utilizando modelo experimental de pancreatite aguda induzida pela L-arginina em ratos, sugerem que esta induz apoptose e expressão do gene da proteína associada à pancreatite em célula acinar pancreática(14). Outras alterações, como ativação NF-Kappa B(19), fator de crescimento fibroblástico FGF-7 e FGF-10(12), efeito exercido pela L-arginina como precursora do óxido nítrico no sistema circulatório e, mesmo, pela regulação da circulação pancreática(15, 23), bem como o papel de radicais livres derivados do oxigênio têm sido estudadas na patogênese da inflamação e da fibrose pancreática(6, 16).

Enfatiza-se que, embora a patogênese da pancreatite aguda induzida pela L- arginina permaneça indefinida, a metodologia empregada neste modelo experimental mostra-se útil e torna-se alternativa para o estudo da mesma.

CONCLUSÕES Provocando-se pancreatite aguda em ratos machos da raça Wistar, pela injeção intraperitonial de L-arginina através da metodologia empregada e baseado nos resultados obtidos, concluiu-se que: Os níveis séricos de amilase mostraram-se capazes de contribuir para o diagnóstico da pancreatite aguda, porém não se correlacionam com a gravidade das lesões pancreáticas.

A administração de L-arginina na dose 500 mg/100 g de peso corpóreo induz pancreatite aguda necrotizante que por não ser fatal, permite avaliar todas as fases da inflamação pancreática aguda, ou seja, desde sua instalação à regeneração do órgão.


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