Produção de fibras de hidroxiapatite por electrofiação
1. Introdução
A hidroxiapatite ou hidroxilapatite (HA) é um biocerâmico da família das
apatites de fórmula química C10(PO4)6(OH)2. Pelas suas propriedades
(biocompatível, osteocondutora, bioactiva) a HA é fundamentalmente usada na
área biomédica em ortopedia, odontologia e na produção de dispositivos médicos.
As aplicações clínicas da HA envolvem a reparação de defeitos ósseos, aumento
ósseo, e o revestimento de implantes metálicos [1,2]. Existem diferentes
técnicas de produção de HA, tais como: combustão, precipitação directa de
soluções aquosas, deposição electroquímica, sol-gel, entre outras [3]. A
técnica de sol-gel é, de entre todas as técnicas de produção de HA, a mais
simples e versátil. Nas últimas décadas, tem vindo a suscitar um grande
interesse, por permitir desenvolver materiais cerâmicos com elevadas pureza e
homogeneidade. A técnica de sol-gel baseia-se, regra geral, em reacções de
hidrólise seguidas da condensação dos precursores, com o objectivo da formação
de partículas coloidais (sol) e subsequente formação de uma rede tridimensional
(gel) [4]. Através desta técnica é possível produzir pós e fibras de HA com
dimensões à nanoescala. No domínio biomédico, em particular em engenharia de
tecidos, a produção de materiais à nanoescala conduz a uma melhor resposta
celular, e daí o interesse actual em todas as micro e nanotecnologias [5].
Neste trabalho, a técnica de sol-gel foi combinada com a técnica de
electrofiação, com o objectivo de produzir nano e microfibras de
hidroxiapatite.
A primeira descrição do processo de electrofiação surge em 1934, quando o
alemão Anton Formals patenteou uma montagem para a produção de filamentos
poliméricos, aproveitando as repulsões electrostáticas entre as cargas
superficiais. Mas foi em 1993 que esta técnica ficou conhecida por
electrostaticspinning ou fiação electrostática [6]. Na electrofiação, uma
seringa é carregada com uma solução polimérica e colocado um capilar (p. ex.
uma agulha) na sua extremidade. O conjunto seringa-capilar é colocado numa
bomba infusora que controla o caudal de solução à saída do capilar. Por sua
vez, o capilar é ligado a uma fonte de alta tensão para elevar o potencial
electrostático do fluido (ver figura 1). O aumento do potencial electrostático
aumenta a carga superficial do líquido. Uma vez que existe um campo eléctrico
aplicado entre o capilar e o colector (terra ou potencial zero), uma força
eléctrica é induzida na gota, com componentes normal e tangencial [6].
Fig._1- Representação esquemática da montagem típica na técnica de
electrofiação.
Quando as forças eléctricas induzidas na gota superam a tensão superficial do
líquido forma-se o cone de Taylor. Uma maior tensão aplicada leva a um
alongamento do cone; no limite máximo de tensão aplicada um jacto é projectado
da ponta do capilar em direcção ao colector, depositando-se neste sobre a forma
de fibras [7]. Tipicamente, as fibras depositam-se aleatoriamente, dando origem
a uma membrana de textura não-tecida (non-woven). A atractividade das
membranas de nano/microfibras produzidas por electrofiação reside,
fundamentalmente, nas suas elevadas porosidade e razão área superfícial/volume.
Os relatos na literatura relativos à produção de fibras de HA pela combinação
das técnicas de sol-gel e de electrofiação são limitados e muito recentes [8-
13]. Contudo, todos os sistemas envolvem, ao contrário do usado neste trabalho,
rigoroso controlo de pH, temperatura, e um longo tempo de hidrólise. Com base
em estudos anteriores [1-3,14,15] desenvolveu-se um novo método de produção
fibras de HA, combinando a técnica de electrofiação com um sistema sol-gel de
base não-alcóxida, utilizando precursores baratos: o pentóxido de fósforo
(P2O5) e o nitrato de cálcio tetrahidratado (Ca(NO3)2.4H2O), ambos em solução
etanólica.
As soluções de pentóxido de fósforo em etanol contêm as espécies fosforadas:
H3PO4 e PO(OH)X(OC2H5)3-X, que se caracterizam por serem muito reactiva e
moderadamente reactiva ou quase inerte, respectivamente [16,17]. O nitrato de
cálcio tetra-hidratado é um sal inorgânico em que os iões de nitrato são
agentes oxidantes que favorecem algumas reacções de decomposição, nomeadamente
de decomposição de grupos etilo.
Um possível conjunto de reacções químicas para a formação de HA a partir deste
sistema é apresentado de seguida [17]:
O P2O5 reage com o álcool para formar o hidroxil-alcóxido. A presença deste em
si não é suficiente para formar um gel, pelo que o Ca(NO3)2.4H2O desempenha um
papel importante no processo de gelificação. Weng e colaboradores [16,18]
referem a possibilidade de haver consumo incompleto do nitrato de cálcio
devido, principalmente, à fraca reactividade grupos OEt do precursor de
fósforo. Assim, o nitrato de cálcio que não reage cristaliza em sal e só deverá
desaparecer aquando da sinterização [14].
Para a produção de fibras de HA, por electrofiação, o gel formado é misturado
em proporção equivalente (m/m) a soluções de polivinilpirrolidona (PVP). Esta
mistura PVP-gel será designada daqui em diante por solução precursora. A
escolha do PVP deveu-se à sua biocompatibilidade e longa aplicação nas áreas
biomédica e farmacêutica [19].
2. Procedimento experimental
2.1. Preparação e caracterização das soluções precursoras
Na produção do gel, segundo o método sol-gel acima descrito, misturaram-se,
numa razão molar Ca/P de 1,67, soluções etanólicas de P2O5(Sigma-Aldrich) e Ca
(NO3)2.4H2O (Panreac). O sol obtido, imediatamente após misturas das soluções
de P2O5 e Ca(NO3)2.4H2O, foi agitado durante 24h, tendo-se produzido um gel de
viscosidade relativamente baixa. As soluções precursoras da electrofiação
resultam da mistura, em proporções iguais (m/m), deste gel com soluções de PVP
em misturas de etanol e água e com diferentes concentrações de polímero. Não
foram usadas soluções unicamente com etanol por se ter verificado que após
mistura da solução de PVP com o gel se formava um precipitado de cor branca.
As soluções precursoras usadas são as que se indicam na tabela 1.
Tabela 1 ' Soluções precursoras usadas na produção de fibras.
Refira-se que, após mistura da solução polimérica com o gel, a concentração de
PVP na solução precursora passa para metade. Contudo, daqui em diante, as
soluções precursoras serão sempre referenciadas a partir da concentração
inicial de PVP.
As soluções precursoras foram caracterizadas quanto às suas tensão superficial
(método da gota suspensa, goniómetro KSV CAM 100 System), condutividade
(condutímetro, HANNA Instruments HI 4521) e características reológicas
(reómetro, Bohlin Gemini HRnano da Malvern). Os estudos reológicos e de
condutividade foram realizados a 25 ºC, enquanto que a tensão superficial das
soluções foi medida a 20 ºC. Os ensaios reológicos foram efectuados em regime
estacionário.
2.2. Produção de membranas de HA
A produção de membranas de HA foi feita por electrofiação, usando uma montagem
com uma pequena modificação, relativamente à esquematizada na figura_1. A
modificação consistiu na introdução de um anel com um diâmetro interno de
16,5cm, colocado próximo da ponta da agulha (calibre 21 ' diâmetro interno de
0,508 mm) e ao mesmo potencial desta, com o objectivo de uniformizar o campo
eléctrico. O colector usado foi uma grelha de alumínio com as dimensões
apresentadas na figura 2. O caudal constante foi garantido pelo uso de uma
bomba de infusão (Kd Scientific model 100). Para gerar o potencial foi
utilizada uma fonte de alta tensão GlassMan High Voltage Inc. Series EL (0-
30kV). As membranas foram produzidas fazendo variar o potencial (V, entre 10kV
e 20kV) e o caudal de injecção (Φ, entre 0,05 ml/h e 0,15ml/h). A distância
entre o alvo e a agulha foi mantida constante e igual a 15cm.
Fig. 2 ' Fotografia do colector usado neste trabalho.
Na produção das membranas, os parâmetros de electrofiação usados são os que se
indicam na tabela 2.
Tabela_2
' Parâmetros usados na electrofiação das soluções precursoras.
Para a produção de fibras de HA, as membranas obtidas foram sinterizadas (forno
Termo lab MLM) de acordo com o seguinte procedimento: (1) aquecimento a uma
taxa de 2ºC/min até aos 350 ºC; (2) patamar de 2h a 350 oC; (3) aquecimento a
uma taxa de 10ºC/min até Ts (500ºC, 600ºC ou 700ºC); (4) patamar de 30 min a
Ts.
2.3. Caracterização das fibras
As fibras foram caracterizadas quanto à sua morfologia e composição química e
estrutural.
A caracterização morfológica das fibras foi realizada por Microscopia
Electrónica de Varrimento (MEV, Zeiss modelo DSM 962). A medição de diâmetros
foi realizada por análise de 50 fibras, recorrendo a um programa de análise de
imagem (ImageJ). A caracterização estrutural foi feita por difracção de raios-
X (DRX) num difractómetro MiniFlex+ Desktop X-ray (marca Rigaku), com
radiação da linha Kα do cobre (Cu Kα → λ= 1,5418Å). O potencial de aceleração
utilizado foi de 30kV e um feixe de corrente de 15mA. O varrimento foi
efectuado entre 20º <2θ <60º e a análise dos difractogramas foi feita por
comparação com as fichas JCPDS: 09-0432, 09-0169 e 37-1497. A determinação
do tamanho de cristalite foi efectuada a partir dos difractogramas das
amostras, pela fórmula de Scherrer, QUOTE (tc = tamanho do cristalite; λ =
comprimento de onda dos raios ' X; β = largura do pico de difracção de maior
intensidade, medida à meia altura; θ = ângulo correspondente ao pico de maior
intensidade). A avaliação das ligações químicas existentes nas membranas,
obtidas após electrofiação e depois de sinterizadas, foi feita por
espectroscopia de infravermelhos de transformada de Fourier (FTIR,
ThermoScientific Nicolet 6700). As amostras utilizadas foram as próprias
membranas e o intervalo espectral varrido foi de 4000cm-1 a 400cm-1.
3. Resultados e discussão
3.1. Caracterização das soluções precursoras
A electrofiação é uma técnica aparentemente simples, mas que depende de
factores inerentes ao processo em si e de factores inerentes às soluções
usadas. A viscosidade, a condutividade e a tensão superficial são
características da solução que ditam a possibilidade de se obter fibras por
electrofiação e, igualmente, a sua qualidade.
Todas as soluções precursoras usadas neste trabalho, bem como o gel, apresentam
um comportamento reofluidificante. Na figura 3 apresentam-se, a título de
exemplo, as curvas de fluxo do gel e das soluções precursoras preparadas a
partir de soluções de PVP a 18 %. A curva de fluxo da solução 15-100 é
apresentada, para análise comparativa, uma vez que as soluções precursoras
preparadas a partir de soluções de PVP a 15 % apresentam também um
comportamento reofluidificante, mas viscosidades sempre mais baixas, para a
mesma quantidade de água.
Fig._3 ' Curvas de fluxo do gel e das soluções precursoras, obtidas a partir de
soluções de PVP a 18% e da solução 15-100.
Verifica-se uma tendência para a diminuição da viscosidade das soluções com o
aumento da quantidade de água nas mesmas, embora este decréscimo seja mais
notório entre as soluções com 25 % e 50 % de água. A condutividade e a tensão
superficial das soluções seguem uma tendência inversa, tal como se pode
verificar na tabela 3.
Tabela 3 ' Condutividade e tensão superficial do gel e soluções precursoras.
A condutividade do gel é, provavelmente, devida à dissociação do nitrato de
cálcio que não reagiu [2,14], na água presente em solução. As condutividades
das soluções precursoras apresentam valores muito próximos para a mesma
concentração de água, independentemente da quantidade de PVP presente. Os
resultados obtidos mostram que a condutividade das soluções depende da
quantidade de água presente, reflexo da natureza condutora deste solvente.
Apesar dos valores elevados de condutividade e de tensão superficial destas
soluções, foi possível obter fibras a partir de qualquer delas. A tensão
superficial das soluções é um parâmetro determinante para a obtenção de fibras
de boa qualidade, isto é sem defeitos (tipo colar de contas).
3.2. Caracterização das fibras
Na figura 4 apresentam-se as imagens de MEV das membranas antes e após
sinterização. As membranas obtidas são constituídas por uma rede de fibras,
distribuídas aleatoriamente, originando uma matriz altamente porosa, com poros
interconectados. Conforme se pode verificar pelas imagens, as fibras após
sinterização apresentam-se mais uniformes e com menores diâmetros, o que se
deve ao facto de o polímero ser eliminado durante o ciclo de sinterização.
Fig. 4 ' Imagens de MEV da membrana 15-75: a) antes e b) após sinterização.
As imagens de MEV foram também usadas para avaliar a influência dos parâmetros
de produção e da solução na morfologia das fibras. Na figura 5 apresentam-se as
imagens de MEV de membranas produzidas a partir de soluções com diferentes
concentrações de PVP.
Fig. 5 ' Imagens de MEV das membranas: a) 15-75 e b) 18-75#2, após
sinterização.
A forma das fibras obtidas está relacionada com a concentração de polímero.
Conforme se pode verificar pelas imagens da figura 5, para uma menor
concentração de PVP na solução precursora obtêm-se fibras com a forma de fita.
O aumento da concentração de PVP na solução precursora conduz a fibras de forma
mais cilíndrica. Tal facto poderá estar associado a maiores viscosidade e
tensão superficial, das soluções com maior concentração de PVP, que deverão
promover a estabilização do cone de Taylor, permitindo a obtenção de fibras
cilíndricas.
Na figura 6 apresentam-se as imagens de MEV de fibras produzidas a partir de
duas soluções com igual concentração de PVP mas com diferentes solventes. No
caso da figura 6 a) o solvente é uma mistura etanol/água, com 50 % (v/v) de
água e na figura 6 b) apenas água. Conforme se pode observar pelos dados da
tabela_2 e da figura_3, as soluções em que o solvente é apenas água apresentam
uma maior condutividade e menor viscosidade, respectivamente. A menor
viscosidade desta solução, associada a uma maior repulsão electrostática à
superfície do fluído, resultante da maior condutividade, contribuem para um
maior estiramento do jacto durante o processo de electrofiação. Desta forma,
obtêm-se fibras com menor diâmetro (diâmetro médio de 117 nm) e menos
dispersas, tal como se verifica na figura 6 b).
Fig. 6' Imagens de MEV das membranas a) 18-50 e b) 18-100, após sinterização, e
respectivas distribuições de diâmetros.
O efeito da variação do caudal na morfologia das fibras é ilustrado na figura
7. As fibras apresentadas na figura 7 a) foram produzidas com um caudal de 0,1
ml/h, enquanto as da figura 6 b) foram obtidas com um caudal de 0,05 ml/h.
Verifica-se que com o aumento do caudal o diâmetro médio das fibras é maior.
Tal deve-se ao facto de que, para caudais maiores, mantendo as outras
variáveis, o volume de solução disponível à saída da agulha também é maior,
conduzindo a fibras de maior diâmetro.
Fig. 7 ' Imagens de MEV das membranas a) 18-75#1 e b) 18-75#2, após
sinterização, e respectivas distribuições de diâmetros.
Na figura 8 apresentam-se os difractogramas da membrana, obtida a partir de uma
solução aquosa com 18 % de PVP (18-100), sinterizada a diferentes temperaturas.
Fig. 8 ' Difractogramas da membrana 18-100, sinterizada a 500ºC, 600ºC e 700ºC.
Os difractogramas obtidos, são independentes do solvente usado na solução
precursora e iguais aos apresentados na figura 8, para a mesma temperatura de
sinterização.
O difractograma obtido a 500 ºC mostra a existência de HA amorfa, cuja
cristalinidade aumenta progressivamente até 700 ºC. Contudo, a 600 ºC e 700 ºC
surgem, também, o óxido de cálcio (CaO) e o fosfato tricálcico (β-TCP),
resultantes da decomposição da HA (equação 9) [2,3]:
Ca10(PO4)6(OH)2 à 3Ca3(PO4)2 + CaO +
H2O
(9)
Com base nos difractogramas das amostras sinterizadas a 600ºC e a 700ºC foram
calculados os tamanhos de cristalite de HA (tabela 4), tendo-se verificado que
estes aumentam com a temperatura de sinterização, confirmando o aumento de
cristalinidade já referido.
Tabela_4
' Tamanho do cristalite (Tc) em função da temperatura de sinterização (Ts).
Os tamanhos de cristalite obtidos encontram-se no intervalo entre 5 e 50 nm que
é o descrito por Dai e colaboradores para fibras de HA produzidas por
electrofiação, usando o nitrato de cálcio tetrahidratado e o trietilfosfito
como precursores [12].
A análise de FTIR teve como objectivo fundamental identificar os grupos
funcionais característicos, quer do PVP, quer da HA. Nas tabelas 5 e 6
encontram-se listados os modos de vibração identificados na literatura para o
PVP e para a HA, respectivamente.
Tabela 5 ' Modos de vibração FTIR identificados para o PVP [20,21].
Tabela 6 ' Modos de vibração FTIR identificados para a HA [1,14,16,18,22].
Na figura 9 apresentam-se os espectros de FTIR do PVP e de uma membrana obtida
a partir de uma solução aquosa com 18 % de PVP (18-100), antes e após
sinterização a 700 ºC. A temperatura de sinterização afecta apenas a
intensidade dos picos, pelo que se procederá à análise do espectro da amostra
sinterizada a 700 ºC. Os espectros de FTIR das membranas produzidas a partir de
soluções de PVP em misturas de etanol/água são iguais aos apresentados.
Fig. 9 ' Espectros de FTIR do PVP e de membranas 18-100, antes e após
sinterização a 700ºC.
O PVP apresenta as bandas características a 2950, 1656, 1459 e 1288 cm−1,
correspondentes a C-H, C=O, C-H (grupos cíclicos) e C-N, respectivamente (ver
tabela_4). A membrana não sinterizada apresenta os picos já mencionados para o
PVP, bem como o pico a 3800 cm-1, resultante da deformação simétrica dos grupos
hidróxilo presentes na HA. Verifica-se, igualmente, a presença dos picos a
600 cm-1 e 1100 cm-1, característicos do grupo fosfato da HA. Todos os outros
picos característicos da HA são mascarados pelos picos do PVP.
O espectro de FTIR da amostra sinterizada apresenta todos os picos de absorção
característicos da hidroxiapatite pura ou estequiométrica. A primeira indicação
da formação de uma estrutura apatítica é sob a forma de banda ampla centrada a
cerca de 1000 cm-1 e 1100 cm-1. As bandas a 960-965 cm-1 e a 560-601 cm-
1 correspondem ao stretching simétrico dos iões PO43-. Observa-se a presença do
pico principal do grupo fosfato, identificado na região entre 1100 cm-1 e 960
cm-1, que é o pico mais intenso de entre os modos de vibração do grupo fosfato.
Verifica-se também a presença de outros dois picos, a 560 cm-1 e 601 cm-1,
pertencentes a outros dois modos de vibração do grupo fosfato. A banda a 3571
cm-1 é atribuída ao modo de stretching dos grupos OH- da hidroxiapatite. O pico
a 1390 cm-1 está relacionado com o NO3-, resultante de algum resíduo de nitrato
de cálcio que não reagiu. As bandas características de iões de carbonato
inorgânicos estão presentes nos espectros de FTIR da membrana sinterizada. Os
modos de vibração do CO32- que podem ser observados nos espectros de FTIR
sugerem a presença de hidroxiapatite carbonatada do tipo B nas fibras obtidas
após sinterização (bandas a 1462 cm-1 e a 870 cm-1).
4. Conclusões
Produziram-se fibras de HA por combinação das técnicas de electrofiação e de
sol-gel. O sistema sol-gel usado é não-alcóxido e usa o nitrato de cálcio
tetrahidratado e o pentóxido de fósforo, como precursores de cálcio e fósforo,
respectivamente. Trata-se de um método simples, económico e que não requer
qualquer controlo de pH. As fibras foram obtidas por electrofiação de misturas
de soluções de PVP e do gel obtido.
Após sinterização das membranas produzidas por electrofiação, obtiveram-se nano
e microfibras de HA com diâmetros no intervalo de, aproximadamente, 60 nm a 1
m. A composição da solução usada na electrofiação afecta a morfologia das
fibras de HA. O solvente usado na preparação das soluções para electrofiação
tem influência na distribuição de tamanhos das fibras, enquanto a concentração
de PVP dita a sua forma. Uma maior quantidade de água nas soluções permite a
formação de fibras com diâmetros menores e o aumento de concentração de
polímero promove a formação de fibras mais cilíndricas.
Verificou-se, para temperaturas de sinterização de 600 ºC e 700 ºC, a
existência de CaO e de β-TCP nas fibras de HA. Contudo, o aumento da
temperatura de sinterização origina fibras de HA com maior cristalinidade
(tamanho de cristalite a 600 ºC = 8,97±0,42 nm; tamanho de cristalite a 700 ºC
= 12,03±0,75 nm).
As fibras produzidas após sinterização, à semelhança do osso humano, são
constituídas por HA carbonatada. O estudo realizado revelou a substituição de
iões fosfato por iões carbonato, ou seja uma HA do tipo B.
As fibras de HA produzidas são viáveis para o uso quer Biotecnológico, em
membranas de permuta iónica, quer para o uso Biomédico, por ex. na produção de
matrizes para Engenharia de Tecidos (crescimento de osteoblastos).
