Avaliação de dois porta-enxertos de videira in vitro introduzidos em meio de
cultivo contendo alumínio
Avaliação de dois porta-enxertos de videira in vitro introduzidos em meio de
cultivo contendo alumínio
Evaluation of two rootstock grapevine in vitro introduced in a culture medium
contend aluminum
Stefan Lucius Burkhardt
1
; Fabíola Villa
2
; Aparecido Lima da Silva
3
; Moacir Pasqual4.
1Departamento de Agricultura (DAG), Universidade Federal de Lavras (UFLA),
Lavras, MG, Brasil. Caixa Postal 3037, CEP: 37200-000.
E-mail: fvilla2003@libero.it, mpasqual@ufla.br
(Manuscrito recebido em 14.05.09 . Aceite para publicação em 05.11.09)
SUMMARY
The aluminum toxicity is the limiting factor of larger importance for the
productivity of cultures in the world. In this sense, this work search to
determine a method of evaluation of the behavior of 2 rootstock grapevine
(Paulsen 1103 and Gravesac), in aluminum stressful conditions in vitro. After
the disinfestations, the explants were inoculated in tubes containing 15 mL of
culture medium DSD1. The cultures in vitro were transferred for growth rooms
and maintained under temperature conditions of 25°C, photoperiod of 16 hours
and luminous intensity of 40-45 μmol.m-2.s-1. After the sterilization of
culture medium, the doses of aluminum were added to the culture medium in
camera and the pH values corrected for 4.0. Two experiments were implanted. In
the first, the explants of two rootstock were placed directly in the DSD1
liquid with different Al concentrations, where were maintained for 60 days
until the evaluation. In the second experiment, the explants were introduced in
same culture medium, in the absence of aluminum. The experimental delineate was
blocks, with six flasks containing three plants each one, in a total of seven
treatments. Different behaviors were verified among the varieties, with
relationship to aluminum concentrations. It was a negative correlation between
activities of Al+3 and biomass production. The partition of carbon among the
varieties was altered by the different aluminum concentrations.
Keywords: toxicity, Vitis spp., culture medium DSD1, tissue culture.
INTRODUÇÃO
O alumínio é o metal mais abundante e o terceiro elemento mais comum na crosta
terrestre, compreendendo aproximadamente 7% da sua massa total, e em solos
ácidos, sua toxicidez é o fator limitante de maior importância para a
produtividade das culturas no mundo (Hartwig et al., 2007). Os sintomas da
toxicidez por alumínio em vegetais muitas vezes não são facilmente
identificados. O sintoma mais expressivo e típico da toxicidez por alumínio,
indicador do estresse, ocorre na raiz que é o principal órgão afetado e tem o
seu crescimento inibido (Delhaize e Ryan, 1995).
Na viticultura catarinense verificou-se, a partir de 1985, uma acentuada queda
de produtividade dos vinhedos e uma redução da área plantada, o que
representava cerca de 30% da área total. Entre várias causas, estavam fatores
nutricionais relacionados às características dos solos (Cordeiro, 2006).
A partir de 1998/99, verifica-se uma reversão do quadro pessimista que dominava
o setor vitivinícola catarinense, com a expansão da área plantada. Para o
plantio e a renovação dos vinhedos catarinenses existe uma grande demanda de
mudas, principalmente de qualidade genética e sanitária comprovada (Desplobins
e Silva, 2005). Portanto, o emprego de genótipos adaptados às condições de solo
ácido conjuntamente com a adição de calcário e adubações racionais, são
estratégias de maior potencial para a utilização racional dos solos com
elevados teores de alumínio trocável (Kochian et al., 2005).
No entanto, poucos são os trabalhos sobre os efeitos prejudiciais de solos
ácidos, com alumínio. Verificase na literatura, a busca de estabelecer
metodologias viáveis para analisar o comportamento de portaenxertos de videira
em condições de estresse por alumínio a campo (Fráguas, 1999) e em soluções
nutritivas (Cançado et al., 2009; Tecchio et al., 2006). Visando elucidar as
principais dificuldades da introdução de novos genótipos, principalmente de
porta-enxertos, torna-se importante estudar a micropropagação e o
desenvolvimento de novas metodologias de avaliação de genótipos em condições de
estresse por alumínio. Diversos autores (Silva e Doazan, 1995; Predieri, 2001),
indicam técnicas biotecnológicas como métodos alternativos, confiáveis e
rápidos para viabilizar a seleção e a multiplicação da videira em larga escala.
Assim, este trabalho buscou determinar um método de avaliação do comportamento
de porta-enxertos de videira, Paulsen 1103 e Gravesac, em condições
estressantes de alumínio in vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
Os porta-enxertos Paulsen 1103 (Vitis rupestris x Vitis berlandieri) e Gravesac
[161-49 (Vitis riparia x Vitis berlandieri) x 3309C (Vitis riparia x Vitis
rupestris)] foram provenientes da Estação Experimental de Videira (EPAGRI),
Videira (SC) e Fazenda Experimental de Caldas (EPAMIG), Caldas (MG),
respectivamente, sendo variedades introduzidas no Brasil (Alvarenga et al.,
2002).
As plantas matrizes foram mantidas em casa de vegetação, em condições
controladas contra patógenos, e submetidas à fertirrigação com solução
nutritiva para videira (Pouget, 1984). Para seleção dos explantes,
desinfestação, introdução e manutenção in vitro foram utilizadas metodologias
de cultura de tecidos para a videira (Galzy, 1985). Após a desinfestação, os
explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15mL de meio de cultura
DSD1 (Silva e Doazan, 1995).
As culturas in vitro foram transferidas para salas de crescimento e mantidas
sob temperatura de 25°C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de
0,040-0,045 mM.m-2.s-1. A sustentação dos explantes no meio líquido foi obtida
por intermédio da utilização de segmentos de cortiça previamente preparados e
esterilizados.
Os tratamentos com alumínio (Al) foram definidos com base nos seguintes
critérios: considerando-se que a concentração final de Al na solução é
fortemente dependente do pH, adotou-se o valor 4,0 como padrão. Outro aspecto
observado foi a concentração total de alumínio encontrada naturalmente nos
solos ácidos (0-0,35mM), podendo em casos especiais, atingir 1mM (Adams e
Moore, 1983). Para corrigir as "concentrações" termodinâmicas
denominadas de atividades, foi utilizado o programa GEOCHEM-PC v.2.0 (Parker et
al., 1987), ficando, então os tratamentos (concentrações de alumínio), conforme
mostra o Quadro I .
Os explantes foram introduzidos em meio DSD1 líquido sem a presença de Al. Após
30 dias em crescimento in vitro, as plantas foram selecionadas pelo tamanho
(plantas médias) e submetidas aos diferentes tratamentos, onde aguardaram por
mais 30 dias até a fase de avaliação.
Os valores de área foliar foram determinados a partir de imagens obtidas por
digitalização e analisadas com auxílio do programa IDRISI. Desta forma foram
avaliadas variáveis relacionadas ao sistema radicular (número de raízes, peso
seco), parte aérea (área foliar, peso seco foliar e peso seco total), e
combinações entre elas. Para a avaliação do pH nos diferentes tratamentos,
retiraram-se alíquotas de 0,5 mL (em ambiente de câmara de fluxo laminar) de
cada frasco referente aos tratamentos, perfazendo uma amostra composta com
volume final de 3,0 mL. O pH foi medido em intervalo médio de 5 dias, ao longo
de trinta dias.
Para todos os experimentos o delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualisado. Para as avaliações morfológicas dos porta-enxertos
foram utilizadas seis repetições de plantas in vitro. Os experimentos com
estresse de íon Al+3 foram compostos por seis vidros, contendo três plantas
cada um, num total de sete tratamentos (Quadro I).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Quando da introdução das plantas nos tratamentos, elas já apresentavam, tanto a
parte aérea quanto o sistema radicular formados, aspecto pelo qual os
diferentes tratamentos não poderiam ter influenciado no número de raízes
primárias. Quanto ao número de raízes secundárias, a variedade Gravesac se
mostrou altamente influenciada pelas diferentes concentrações de alumínio
(Figuras 1A e 1B).
Verificou-se que as menores concentrações de alumínio promoveram uma pequena
redução do número de raízes secundárias, observado até a concentração de
0,425mM. Em concentrações superiores a 0,425mM de alumínio ocorreu um
crescimento no número de raízes secundárias até atingir o máximo próximo da
concentração de 1,2mM. Também foi observado o aparecimento de pontuações, com
tonalidades marrons e/ou negras, indicando a tentativa de emissão de primórdios
radiculares, mas devido o efeito da alta toxicidade no meio não apresentou a
capacidade de regenerar novas raízes.
QUADRO I
Concentração total de alumínio (Al), concentração de Al+3 livre e atividade do
Al+3 na solução DSD1 a pH = 4,0 (Software GEOCHEM PC versão 2.0).
Aluminum total concentration (Al), Al+3 free-concentration and Al+3 activity in
DSD1 solution with pH = 4,0 (Software GEOCHEM-PC
version 2.0).
Verifica-se na literatura que a toxicidez por alumínio provoca o aumento do
número de raízes secundárias (Dantas et al., 2001). Provavelmente o efeito
fitotóxico do alumínio promova a destruição das células meristemáticas da raiz
alterando a produção de hormônios que controlam o crescimento da parte apical
(Hartwig et al., 2007), quebrando a dominância da raiz principal e induzindo a
ramificação de raízes secundárias.
Na variedade Paulsen 1103 não foram observadas diferenças significativas com
relação ao número de raízes secundárias e totais. Este comportamento,
diferentemente do verificado para a variedade Gravesac, pode demonstrar que o
efeito de toxicidez de alumínio é dependente do genótipo, conforme sugerido por
Fráguas (1999). No entanto, Comin et al. (1999) encontraram reduções no número
total de raízes para a variedade Paulsen 1103 de 31,9; 66,9; 73,1 e 65,5% em
concentrações de Al de 0,2; 0,4; 0,6 e 0,8 mM, respectivamente, trabalhando em
solução nutritiva.
Fig._1A
- Relação de n° de raízes secundárias em função das concentrações de Al (mM)
na var. Gravesac in vitro. Relation of secondary roots number in function of Al
concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.
Fig. 1B
- Relação de n° de raízes totais em função das concentrações de Al (mM) na
var. Gravesac in vitro. Relation of total roots number in function of Al
concentrations (mM) in var. Gravesac in vitro.
Porém, existem outros sintomas também relacionados com o sistema radicular,
atribuídos ao alumínio, que puderam ser observados no cultivo in vitro. Ocorreu
a inibição do alongamento do eixo principal, também verificado por Furlani et
al. (2002) e Fráguas (1999), presença de raízes com coloração marrom,
principalmente nas extremidades (Figura_4), conforme relatado por Basso et al.
(2000) que trabalhou especificamente com porta-enxertos de videira.
Observaram-se também raízes laterais curtas e grossas (Figura 2), além de
frágeis e quebradiças, com o início de emissão de raízes próximas ao ponto de
crescimento da raiz principal (Figuras 3 e 4), também descrito por Basso et al.
(2000). Ocorreu também o aparecimento de um sintoma característico não descrito
na literatura: raízes secundárias com tamanho superior a raiz principal, que
apresentava crescimento paralisado devido a reações provocadas pelo alumínio
(Figura 3).
Quanto ao peso seco radicular, não se verificou relação com as diferentes
concentrações de alumínio em ambas as variedades. Resultados estes que estão de
acordo com Souza et al. (2000).
A redução de biomassa (peso seco) em plantas submetidas ao estresse de alumínio
foi relatada por diversos autores (Burkhardt et al, 2008; Dantas et al., 2001),
que verificaram que a ação do alumínio pode inibir o desenvolvimento radicular.
Como existe uma correlação estreita entre o desenvolvimento do sistema
radicular e a parte aérea das plantas, soluções com teores altos de alumínio
promovem a inibição do desenvolvimento da folha/caule (Furlani et al., 2002).
Fig. 2 -
Sintomas de toxicidez de alumínio no sistema radicular de porta-enxerto de
videira Paulsen 1103 in vitro. Grande número de raízes laterais curtas e
grossas (atrofiadas) com coloração escura. Concentração de Al = 0,425mM. UFSC -
Fpolis/SC, Brasil.
Aluminum toxicity symptoms in the radicular system of grapevine rootstock
Paulsen 1103 in vitro. Great number of short and thick lateral roots
(atrophied) with dark coloration. Al concentration = 0,425mM. UFSC - Fpolis/SC,
Brasil.
Fig. 3 -
Sintomas de morte do meristema apical com emissão de uma nova raiz próxima ao
ápice radicular em porta-enxerto de videira Paulsen 1103 in vitro. Evidenciado
em (A) a nova raiz que apresenta tamanho semelhante a original. Em (B) mudança
típica de coloração da nova raiz. Concentração de Al=0,425mM. UFSC - Fpolis/SC,
Brasil.
Symptoms of meristema apical death with emission of a new root next to
radicular system in grapevine rootstock Paulsen 1103 in vitro.Evidenced in (A)
the new root that presents similar size the original. In (B) typical change of
coloration of the new root. Concentration ofAl=0,425mM. UFSC - Fpolis/SC,
Brasil.
Fig. 4 -
Sintomas causados pela toxicidez por alumínio em porta-enxertos de videira
Paulsen 1103 in vitro. (A) paralisação do crescimento apical radicular; as
concentrações de alumínio são respectivamente de 0,425 mM, 0,650 mM, e 1,375
mM. (B) raízes anormais e com coloração escura (Al = 1,2 mM). UFSC - Fpolis/SC,
Brasil.
Symptoms caused for aluminum toxicity in grapevine rootstock Paulsen 1103 in
vitro. (A) Paralisation of the radicular growth apical; the aluminum
concentrations are respectively of 0,425 mM, 0,650 mM, and 1,375 mM. (B)
abnormal roots and with dark coloration (Al = 1,2 mM). UFSC - Fpolis/SC,
Brasil.
Como sintomas visuais da toxicidez por alumínio no caule, a variedade Paulsen
1103 apresentou morte das pontas de crescimento (verificado a partir da segunda
semana de tratamento). Este sintoma é normalmente relacionado à deficiência de
cálcio provocado pelo alumínio (Foy, 1988). Tais observações estão de acordo
com Fráguas (1999), que relatou grandes reduções nos teores de cálcio da
variedade Paulsen 1103, submetida ao estresse de alumínio.
Observa-se que a variedade Gravesac (Figura 5A) apresentou uma regressão
quadrática, onde aumentos nas concentrações de alumínio até 0,650mM promovem um
incremento da área foliar, e concentrações superiores a 0,650mM restringem
progressivamente o crescimento das folhas. A variedade Paulsen 1103 (Figura
5B), apresentou redução da área foliar nas concentrações de alumínio a partir
de 0,250mM. Em concentrações superiores a esta, o alumínio passa a exercer um
efeito fitotóxico reduzindo o crescimento da área foliar até a concentração de
1,0mM, estabilizando em concentrações mais elevadas.
Fig. 5A - Relação da área foliar (cm2), em função das concentrações de Al (mM)
para a var. Gravesac in vitro.
Relation of foliar area (cm2), in function of Al concentratios (mM) in var.
Gravesac in vitro.
Fig. 5B - Relação da área foliar (cm2), em função das concentrações de Al (mM)
para a var. Paulsen 1103 in vitro.
Relation of foliar area (cm2), in function of Al concentratios (mM) in var.
Paulsen 1103 in vitro.
De modo geral, foi constatado que as folhas jovens apresentaram redução
significativa de crescimento, sintoma relacionado com a deficiência de fósforo
(Furlani et al., 2002). Também se verificou o enrolamento das folhas, um
sintoma típico de toxicidez por alumínio que normalmente está envolvido com a
deficiência de cálcio (Freitas et al., 2006). Para porta-enxertos de videira, a
absorção de nutrientes em presença de alumínio apresenta respostas variadas; no
entanto, as maiores reduções observadas se referem ao teor de cálcio nas folhas
(Tecchioet al., 2005).
Diversos pesquisadores sugerem que as células das raízes e protoplastos
respondem, na presença do alumínio, com mudanças fisiológicas necessárias para
restabelecer a homeostase interna, mecanismos possíveis apenas em altas
concentrações de Ca+2 e K+ (Lindberg e Strid, 1997). E, que o alumínio bloqueia
os transportadores de Ca+2 presentes na membrana plasmática, podendo ser uma
das principais atividades fitotóxicas exercidas pelo alumínio (Jones et al.,
1998).
De maneira geral, as médias do peso seco das folhas para a variedade Gravesac
(Figura 6A) não apresentaram correlações negativas com as concentrações de
alumínio, demonstrando um certo efeito positivo na produção de biomassa seca
nas concentrações de alumínio entre 0.650mM e 1.0mM, com decréscimo em
concentrações superiores. Na variedade Paulsen 1103 (Figura 6B), observou-se
que em 0,250mM de Al ocorreu um pequeno acréscimo de biomassa nas folhas, porém
nas concentrações superiores a esta, verificou-se redução dos pesos secos das
folhas até atingir valores mínimos de crescimento foliar nas concentrações
superiores a 1,0mM de Al. O alumínio induz reduções na fotossíntese, mecanismo
que está em parte associado com o fechamento dos estômatos, fenômeno que
provavelmente é resultante de prejuízos causados pelo alumínio, que afetam o
metabolismo de carbono e a regulação dos estômatos (Codognotto et al., 2002;
Peixoto et al., 2002).
Fig. 6A -Relação do peso seco das folhas (mg) em função das concentrações de Al
(mM) na var. Gravesac in vitro.
Relation of dry weight of leves (mg), in function of Al concentratios (mM) in
var. Gravesac in vitro.
Fig. 6B - Relação do peso seco das folhas (mg) em função das concentrações de
Al (mM) na var. Paulsen 1103 in vitro.
Relation of dry weight of leves (mg), in function of Al concentratios (mM) in
var. Paulsen 1103 in vitro.
Através dos resultados apresentados nas Figuras 7A e 7B, pode-se observar o
comportamento do peso seco da parte aérea em função das diferentes
concentrações de alumínio. Para a variedade Gravesac (Figura 7A), observa-se
que as baixas concentrações de alumínio não exercem nenhum efeito sobre o peso
seco para a parte aérea. A partir da concentração de 0,425mM de alumínio,
ocorre um incremento de biomassa aérea até as concentrações próximas de
0,650mM. A partir desta concentração verifica-se uma inibição do crescimento
das plantas, de forma que nas concentrações superiores (1,2mM e 1,375mM) de
alumínio o crescimento torna-se limitado.
Fig. 7A -Relação do peso seco da parte aérea (caule + folhas), em função das
concentrações de Al (mM) na var. Gravesac in vitro.
Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in
var. Gravesac in vitro.
Fig. 7B -Relação do peso seco da parte aérea (caule + folhas), em função das
concentrações de Al (mM) na var. Paulsen 1103 in vitro.
Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in
var. Paulsen 1103 in vitro.
Para a variedade Paulsen 1103 (Figura 7B), observouse uma maior sensibilidade
ao alumínio. Verificouse na concentração 0,250mM de alumínio um estímulo ao
acúmulo de biomassa na parte aérea. Entretanto, a partir desta concentração
verifica-se uma queda acentuada no peso seco da parte aérea.
Comin et al. (1999), trabalhando com as variedades de videiras Paulsen 1103 e
Gravesac, em solução nutritiva, verificaram redução do peso seco da parte
aérea, correlacionado com acréscimo nas concentrações de alumínio. Entretanto,
Fráguas (1999), em trabalhos de campo, avaliando diferentes variedades de
porta-enxertos de videira, verificou que existe variabilidade entre genótipos
com relação a estresse de Al. Essas diferenças são devidas aos vários fatores
que estão envolvidos, como questões de tolerância de genótipos, metodologias,
concentrações e/ou atividades de Al.
Os resultados para peso seco da parte aérea permitiram verificar que as
respostas, em função da atividade de Al+3, apresentam diferenças significativas
entre as duas variedades. As concentrações de Al superiores se mostraram bem
limitantes para o crescimento das plantas da variedade Gravesac, mostrando que
nestas concentrações as respostas das plantas em termos de crescimento passam a
ser mínimas. A variedade Paulsen 1103, por sua vez, apresentou proximidade nas
observações de peso seco aéreo naqueles tratamentos com concentração de Al
entre 0,250mM e 0,650mM. A resposta do tratamento com 1,0mM de alumínio está
mais próxima das verificadas nas concentrações de 1,20mM e 1,375mM que não
apresentaram desenvolvimento das plantas. Supõem-se que o Al no meio cultura
induz mecanismos bioquímicos e fisiológicos na planta, que melhoram as
condições de crescimento neutralizando a toxicidez por H+ e Al+3.
Como análises finais, buscaram-se comparar a distribuição do carbono (partição
de biomassa) entre o sistema radicular e a planta como um todo. Os resultados
para a variedade Gravesac estão apresentados nas Figura 8A.
Fig. 8A - Relação peso seco raízes/peso seco total, em função das concentrações
de Al (mM) para a var. Gravesac in vitro.
Relation of dry weight roots/total dry weight, in function of Al concentratios
(mM) in var. Gravesac in vitro.
Verificou-se que existe uma grande estabilidade entre a relação do peso seco
radicular e o peso seco total (PSR/PST), até a concentração de alumínio de
0,650. Para concentrações superiores esta relação se altera, apresentando
valores maiores. A variedade Paulsen 1103 (Figura 8B), por sua vez, apesar de
não ter apresentado regressão significativa para esta variável, apresentou um
padrão de elevação da relação bem definido, com acréscimos praticamente
constantes a medida que aumenta a concentração de alumínio. Elevação esta que
se faz notar desde a primeira concentração de Al utilizada.
Fig. 8B - Relação peso seco raízes/peso seco total, em função das concentrações
de Al (mM) para a var. Paulsen 1103 in vitro.
Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in
var. Paulsen 1103 in vitro.
Os valores apresentados pelas testemunhas, da relação (PSR/PST), dentro dos
tratamentos testados, provavelmente representam o valor mais próximo daqueles
verificados em condições de crescimento adequadas. Tomando isto como premissa,
os valores da relação (PSR/PST), que se afastam daqueles verificados na
testemunha, provavelmente estão relacionados com os efeitos fitotóxicos do Al
sobre as plantas. Assim, o Gravesac, que apresentou relação (PSR/PST) constante
até a concentração de 0,650mM de Al, parece ter um crescimento adaptado às
condições de acidez e toxicidez de Al+3.
O alumínio é um dos principais responsáveis pela baixa performance de plantas
economicamente importantes em solos ácidos. Das espécies de alumínio, a forma
Al3+ é comprovadamente tóxica e o sintoma inicial, e mais nocivo de sua
toxicidade, é a inibição do crescimento da raiz. Espécies de plantas variam
extensivamente no grau de tolerância ao Al e as plantas tolerantes apresentam
diferentes mecanismos para sobreviverem à presença desse metal. Os mecanismos
de tolerância são extremamente complexos e vários estudos vêm sendo realizados
na tentativa de elucidá-los (Echart e Cavalli-Molina, 2001).
Devido à complexidade da fitotoxicidade do Al e dos mecanismos de tolerância
apresentados pelas plantas, bem como da interação com diferentes fatores do
solo, esse problema, além de ser um desafio para a biotecnologia vegetal, tem
que ser alvo de cooperação entre cientistas multi-disciplinares. A elucidação
dos vários aspectos envolvidos na fitotoxicidade do Al e obtenção de cultivares
tolerantes ao mesmo permitirão futuramente um melhor aproveitamento dos solos
ácidos ricos em Al que representam em algumas regiões brasileiras um sério
problema brasileiro.
CONCLUSÕES
As avaliações morfo-fisiológicas demonstraram comportamentos distintos entre as
variedades, com relação às concentrações de Al.
Ocorreu correlação negativa entre atividades de Al+3 e produção de biomassa.
A partição de carbono entre as variedades foi alterada pelas diversas
concentrações de Al.
