Experimentação animal, um mundo com regras: do planeamento à publicação
INVESTIGAÇÃO EM CIRURGIA
Experimentação animal, um mundo com regras - do planeamento à publicação
Ana Isabel Moura Santos1 e Luis Antunes2
1Professora Auxiliar, SPCAL - Sociedade Portuguesa de Ciências em Animais de
Laboratório, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa
2Professor Associado, SPCAL - Sociedade Portuguesa de Ciências em Animais de
Laboratório, Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-
Montes e Alto Douro (UTAD) Responsável Best4R - Investigação com animais de
laboratório (UTAD)
Correspondência
INTRODUÇÃO
A utilização de animais para fins experimentais em cirurgia é relativamente
frequente como forma de desenvolver e testar melhoramentos técnicos ou como
forma de treino dos profissionais. Este artigo pretende colaborar no
esclarecimento de algumas questões práticas e legais com que os profissionais
se deparam quando recorrem à utilização de animais para fins experimentais,
científicos ou de treino.
No livro "The principles of humane experimental tecnique", William
Russel e Rex Burch (1959) foi proposto o princípio dos 3 R's da experimentação
animal. Este princípio baseia-se em 3 ideias: a) "replace", que se
traduz por substituir os animais capazes de experimentar dor, prazer,
felicidade, medo, frustração e ansiedade; b) "reduction", que
significa reduzir o número de animais utilizados, sem prejudicar a qualidade
dos resultados e c) "refinement" que quer dizer refinamento, ou seja,
a diminuição da incidência ou severidade de procedimentos aplicados. Os
utilizadores de animais podem e devem sempre contribuir para a aplicação da
regra dos 3 R´s na utilização de animais, de que tanto se fala em Ciências de
Animais de Laboratório.
A discussão das condições legais para a utilização de animais é, nesta altura,
muito pertinente, pois a comunidade científica está a aguardar a transposição
de novas recomendações para a lei nacional. Na área da cirurgia é muito
frequente o uso de alguns modelos animais com o objectivo de possibilitar a
transposição dos resultados para benefício da saúde humana. Pretendemos, com
esta reflexão, colaborar para que na fase de planeamento da utilização alguns
passos sejam sempre considerados.
REGULAMENTAÇÃO
Em Portugal a utilização de animais depende da obtenção de autorização ou
creditação por parte da Direção Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV), que
é a entidade governamental competente para a proteção dos animais utilizados
para fins experimentais e/ou outros fins científicos. Dentro da DGAV é
especificamente a divisão de Bem-Estar Animal que pertence à Direção de
Serviços de Proteção Animal que executa esta tarefa.
A regulamentação legal em Portugal derivará em breve da transposição da
Diretiva da Comunidade Europeia (2010/63/EU). Esta diretiva comunitária surge
como o resultado da revisão da Diretiva n.º 86/609/CEE do Conselho da Europa e
visa melhorar e reduzir a utilização de animais para fins experimentais, além
de tentar harmonizar os procedimentos legais entre os vários Estados membros.
Até à data da conclusão deste artigo, estava em vigor a Portaria n.º 1005/92
de 23 de Outubro, relativa à proteção dos animais utilizados para fins
experimentais e/ou outros fins científicos. Em Portugal esta regulamentação
abrange a utilização de animais para fins de ensino ou treino, situação que não
acontece noutros Estados membros da Comunidade Europeia que não permitem a
utilização desses referidos animais. Para mais informações e atualizações o
leitor pode visitar o sitio http://www.dgv.min-agricultura.pt/portal/page/
portal/DGV/genericos?actualmenu=61974&generic_o=15470&cboui=15470.
TREINO E CREDITAÇÃO DE PESSOAS
Por determinação legal, em Portugal, a creditação é feita pela DGAV, é
obrigatória para todas as pessoas envolvidas na utilização de animais para fins
experimentais ou de ensino e está sempre dependente da frequência de ações de
formação prévias, nomeadamente em Ciências de Animais de Laboratório. Este
factor deve ser considerado pelas Instituições acolhedoras dos potenciais
utilizadores de animais de laboratório e é considerado um requisito fundamental
para as funções a desempenhar pelos usuários. A formação e treino específico em
animais de laboratório, de todos os envolvidos, são obrigatórios em Portugal
desde 1992 independentemente da área de formação prévia. Até publicação de nova
legislação, as pessoas podem obter creditação com o nível de tratador, técnico
de investigação, investigador e investigador-coordenador. Estes quatro níveis
de creditação são os identificados com as categorias de A a C das recomendações
publicadas pela FELASA (Federation of European Laboratory Animals Sciences
Associations) para formação e treino. Mais informações disponíveis em http://
www.felasa.eu/recommendations. Estas recomendações sugerem sempre a frequência
de ações de formação específicas em Ciências de Animais de Laboratório como
forma de garantir uma formação harmonizada que garanta uma atualização adequada
em termos teóricos e práticos e acima de tudo uma utilização mais consciente do
ponto de vista do bem-estar animal. Para além de melhorar as condições humanas
de utilização, a formação facilita também a mobilidade dos utilizadores,
requisito cada vez mais pertinente nos tempos que correm. Em Portugal, as ações
de formação em Ciências de Animais de Laboratório podem utilizar animais. No
entanto a utilização de animais para formação e treino levanta algumas
preocupações sob o ponto de vista ético, situação que levou alguns Estados da
Comunidade Europeia a limitar ou interditar a utilização de animais para
ensino.
Embora até à data as creditações individuais tenham sido dadas sem data limite
e baseadas no pressuposto da aquisição de competências, após a transposição da
nova Directiva Comunitária é previsível que passe a ser requerida a formação
continuada para manutenção da creditação. A formação continuada em Ciências de
Animais de Laboratório baseia-se na estratégia já aplicada a algumas carreiras
ligadas à ciência e à saúde que requerem uma formação flexível e variada
adequada a cada profissional, adquirida posteriormente à formação considerada
mínima para cada nível. Nesta nova situação a formação continuada implica a
necessidade de ao longo da carreira de utilizador manter uma atualização
periódica. Isto significa que será necessária a frequência de ações de formação
regulares em Ciências de Animais de Laboratório para se poder continuar a
utilizar animais para fins experimentais. Cada individuo é responsável pela sua
creditação, sendo também responsabilidade das Instituições onde se desenvolve o
trabalho garantir o não envolvimento em procedimentos de experimentação animal
de elementos sem a competente formação e creditação.
CREDITAÇÃO DE LOCAIS E PROJECTOS
Além da creditação das pessoas envolvidos na produção, manutenção e utilização
dos animais é ainda necessária a obtenção de alvará para todos os
estabelecimentos de criação, fornecimento e utilização de animais. O pedido de
licenciamento de instalações é da responsabilidade dos órgãos de gestão dos
mesmos e deve ser obtido antes da sua entrada em funcionamento. A capacidade de
acomodar e manter animais é dispendiosa e trabalhosa pelo que em geral está
centralizada e nível institucional ou local.
Os projetos de investigação têm também que ser submetidos à avaliação da DGAV e
só devem ser colocados em prática após obtenção de aprovação para a sua
execução. Idealmente um projeto só deverá ser submetido para financiamento após
obtenção de todas as creditações referidas. O investigador responsável deve
avaliar e identificar o nível de severidade de todos os procedimentos a
executar e definir os pontos terminais aceitáveis (humane end points). Com a
implementação da nova directiva o investigador deverá ainda fazer uma análise
retrospetiva da severidade infligida durante a execução do seu projecto.
A PUBLICAÇÃO DE RESULTADOS DE TRABALHOS EXPERIMENTAIS COM ANIMAIS
A publicação de dados científicos através de artigos contendo informação obtida
após a realização de experiências com animais é atualmente alvo de um
particular escrutínio por parte de editores e revisores. Estes tendem a ser
particularmente assertivos para garantir que a informação fornecida foi
recolhida tendo por base as melhores práticas, que assegurem o bem estar
animal, rigor dos dados obtidos e elevados princípios éticos.
Diversas revistas apresentam uma secção específica de recomendações de
preparação de manuscritos para autores que tenham realizado estudos em animais.
Nos Estados Unidos por exemplo é frequente pedir que os trabalhos experimentais
com animais devam estar de acordo com as diretrizes estabelecidas no Guia para
o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals). Este guia está amplamente disponível, podendo ser
consultado em http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-
Laboratory-animals.pdf. É também prática comum requerer a referência da
aprovação dos projectos pelas Comissões Institucionais de Utilização e Bem
Estar Animal (IACUC-Institucional Animal Care and Use Committee). A adesão a
todos os regulamentos pertinentes e / ou aprovação do Comité de Ética e de
cuidados animais institucionais ou licenciamento governamental do investigador
e / ou laboratorial deve ser obtido antes do início dos estudos. A declaração
sobre a aprovação deve ser incluída no início da seção de Material e Métodos.
Casos os revisores de qualquer revista demonstrem preocupações com os cuidados
animais durante a realização dos procedimentos, podem requerer via editor-
chefe, uma cópia da aprovação das diversas licenças. No caso particular de
trabalhos de índole cirúrgica, os autores podem ser questionadas sobre o uso de
anestésicos, relaxantes musculares e analgésicos. A utilização de analgésicos
pós-operatórios é frequentemente desprezada e a utilização de fármacos
bloqueadores neuromusculares, particularmente em animais deficientemente
sedados é motivo de diversas preocupações. A aprovação prévia do comité local
ou nacional, não garante que em termos éticos, um artigo venha ou não a ser
aceite por uma revista pois a decisão final é tomada pelo Editor-Chefe.
No mesmo sentido, foi recentemente elaborado pelo National Centre for the
Replacement, Refinement and Reduction on Animals in Research (NC3Rs) do Reino
Unido, uma lista de aspetos essenciais, que se devem seguir aquando da
preparação de protocolos experimentais. Estes pontos são fulcrais para que os
dados obtidos possam mais facilmente ser traduzidos em material publicável. As
linhas de orientação ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)
estão disponíveis através de vários jornais científicos, ou no sítio: http://
www.nc3rs.org.uk/downloaddoc.asp?id=1206&page=1357&skin=0. Estas linhas
de orientação destinam-se a melhorar a comunicação de resultados de
experiências com animais. Trabalhos anteriores do NC3Rs e outras instituições
mostraram que muitas publicações com animais não tinham informações importantes
sobre como o estudo foi concebido, realizado e analisado. Tal pode limitar o
valor da informação para futuros estudos científicos e políticos.
As diretrizes desenvolvidas pelo NC3Rs visam melhorar os padrões de relatórios
e publicações, garantindo que os dados de experiências com animais possam ser
totalmente avaliados e utilizados. As diretrizes são primariamente destinadas a
cientistas que descrevem os seus resultados para publicação e para aqueles que
estão envolvidos na revisão. Estas diretrizes consistem numa lista de 20 pontos
essenciais que devem ser incluídos em publicações envolvendo experimentação
animal. Nos próximos parágrafos salientamos os pontos que consideramos mais
relevantes no âmbito da cirurgia.
INTRODUÇÃO DO PROJETO/TRABALHO
Relativamente à introdução do projeto ou artigo, esta deve conter uma
justificação clara para a realização do estudo e deve incluir informação
científica suficiente e fundamentada com referências relevantes de trabalhos
anteriores. Desta forma deverá ser fácil entender a motivação e contexto para
realização do estudo. A introdução deve explicar a abordagem experimental e
deixar claro como e porquê as espécies animais e modelo a ser utilizado podem
permitir abordar os objetivos científicos. Sempre que pertinente, deve incluir
detalhes da espécie ou estirpe de animais utilizados, principais métodos e
potenciais conclusões essenciais.
MATERIAL E MÉTODOS
O material e métodos de projetos ou artigos com trabalhos com animais, deve
para além das secções clássicas de descrição de métodos e materiais, deixar
claro o esforço despendido na correta preparação e delineamentos das
experiências. São assim pilares muito importantes nesta secção as seguintes
subsecções: declaração e/ou aprovação ética, animais e alojamento,
enriquecimento ambiental, procedimentos, desenho experimental e métodos
estatísticos.
Declaração ética
Nesta subsecção deve ser indicado a natureza das permissões da revisão ética,
licenças relevantes, e as diretrizes nacionais ou institucionais para o cuidado
e uso de animais que cobrem a investigação. Exemplos destas declarações
utilizadas pelos autores e que podem ser aplicadas no contexto da investigação
com animais realizada em Portugal são: "All procedures were carried out
under personal and project licenses approved by the NationalAnimal Care
Committee, Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbon, Portugal"
ou "This project was reviewed and ethically approved by the local ethics
committee and Portuguese competent authority for animal protection, Direcção
Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbon, Portugal, protocol /project Nº
00000, from day, month and year".
Animais e Alojamento
Esta subsecção deve oferecer detalhes sobre os animais utilizados, incluindo
espécie, estirpe, sexo, estádio de desenvolvimento e peso. Sempre que possível
deve fornecer outras informações relevantes, tais como a origem dos animais,
nomenclatura, genética (por exemplo, knock-out ou transgênicos), estado de
saúde e imunológico. Devem ser deixados claros detalhes sobre o alojamento,
nomeadamente: tipo de instalações onde os animais são mantidos, material de
cama, número de animais por gaiola, recinto ou por área, forma de
enriquecimento do meio ambiente, ciclos de luz / escuridão, temperatura,
humidade, tipo e regime de alimentação e abeberamento.
Procedimento
Para todos os grupos experimentais e todos os procedimentos, deve ser fornecida
informação detalhada de todas as intervenções realizadas. Por exemplo:
formulação de medicamentos e doses, via de administração, anestesia e analgesia
utilizada, monitorização da anestesia, descrição do procedimento cirúrgico,
destino dado aos animais ou método de eutanásia e análise efetuadas. A fim de
garantir que a experiência possa mais facilmente ser replicada noutro
laboratório deve ser ainda dada informação adicional relativa a quando (por
exemplo, hora do dia) e onde (por exemplo, gaiola ou laboratório) a experiência
foi realizada.
Desenho experimental
Particularmente crítica nesta secção, é a inclusão de informação relativa aos
detalhes do desenho experimental, grupos de animais utilizados e o número de
animais alocados a cada grupo experimental e de controlo. Devem ser também
salientadas as providências tomadas para minimizar os efeitos de enviesamento
(bias) dos dados, nomeadamente garantir que animais são escolhidos para os
procedimentos de uma forma aleatória e que a avaliação dos resultados é feita
por alguém sem informação relativamente aos tratamentos efectuados. Assim,
nesta secção ou na secção de métodos estatísticos deverá ser sempre
especificado o número total de animais utilizados em cada experiência além do
número de animais em cada grupo experimental. O tamanho da amostra utilizada e
a determinação do número de animais por grupo a estudar deve ser justificada
através da utilização de métodos de cálculo de poder da amostra tendo por base
trabalhos anteriormente realizados.
Métodos estatísticos
A secção de estatística deve ser particularmente clara e requer preparação para
evitar erros grosseiros à posteriori. Erros frequentes em trabalhos com animais
são por exemplo a incorreta definição da unidade experimental ou uso abusivo do
teste t de student. A primeira situação pode ser ilustrada pela utilização de
um único grupo de animais ou gaiola de animais sujeito a um mesmo tratamento.
Este grupo deve ser considerado como uma única observação e não como o número
de observações igual ao número de animais presentes na gaiola ou recinto. Para
minimizar este tipo de erros é cada vez mais conveniente a consulta de um
investigador com experiência em delineamento experimental com animais, antes da
realização das experiências. Nesta secção devem ficar claros todos os detalhes
sobre os métodos estatísticos utilizados para cada análise e para demonstrar
que os dados preencheram os pressupostos da abordagem estatística escolhida.
RESULTADOS
A secção dos resultados deve ser clara e objetiva, recorrendo a figuras e
tabelas sempre que adequado. Relativamente a outras publicações científicas, as
secções de resultados dos trabalhos com experimentação animal devem relatar
características relevantes e estado de saúde dos animais (por exemplo, peso e
estatuto microbiológico) antes do tratamento ou testes efectuados. Nesta secção
deve ser claro o número de animais em cada grupo e incluído em cada análise. Os
números devem ser apresentados através de valores absolutos, por exemplo: 10/20
e não em termos de percentagem, nesse caso 50%. Animais ou dados não incluídos
na análise final devem ser reportados e apresentadas as razões que levaram à
sua exclusão. Os resultados e estimativas obtidas devem ser reportados com uma
medida de precisão como por exemplo indicar o desvio padrão ou apresentar
intervalo de confiança. Esta secção deve conter informação sobre detalhes de
todos os eventos adversos importantes em cada grupo experimental e modificações
nos protocolos experimentais feitos para reduzir esses eventos adversos. As
implicações destes últimos factores terão que ser discutidos na seguinte
secção.
DISCUSSÃO
A discussão, como em qualquer publicação científica consiste na interpretação
dos resultados, tendo em conta os objectivos do estudo e hipóteses formuladas.
A discussão tem por base a teoria atual e outros estudos relevantes na
literatura. Neste contexto devem ser comentadas eventuais limitações do estudo,
incluindo todas as fontes potenciais de enviesamento, quaisquer limitações do
modelo animal e de imprecisão associada aos resultados. Neste contexto é
particularmente importante comentar sobre se, e como, os resultados deste
estudo são susceptíveis de serem extrapolados para outras espécies ou sistemas,
incluindo a sua relevância para os seres humanos. Do ponto de vista dos 3Rs é
importante descrever todas as implicações dos métodos experimentais ou
resultados para a substituição, refinamento e redução do uso de animais em
trabalhos futuros dentro da área em estudo.
FUTURO
Com a finalidade da promoção do bem estar animal, a nova Directiva Comunitária
relativa ao Bem-estar e Experimentação Animal exigirá a criação de Animal
Welfare Bodies (ORBEA - Orgãos de Bem-Estar Animal, em Portugal). Estas
Comissões deverão ter um cariz local e devem integrar os responsáveis pelos
cuidados com os animais, cientistas e a sociedade civil. Contudo, a partir
destes mínimos, cada país poderá acrescentar mais competências. Para Portugal,
tanto quanto nos foi dado a conhecer, os ORBEA deverão ter, obrigatoriamente:
a) pessoa responsável pelos cuidados aos animais,
b) veterinário ,
c) diretor do estabelecimento (biotério),
d) representante dos investigadores e
e) representante da sociedade civil.
Algumas destas figuras podem estar delegadas na mesma pessoa. Opcionalmente,
poderão também integrar: um representante dos tratadores, um especialista em
desenho experimental, uma pessoa externa ligada a Ciências de Animais de
Laboratório, um representante de um comité de ética para a saúde.
Este órgão visa a descentralização da análise de projetos e é responsável pela
aprovação dos projetos antes da sua execução a nível local. As perspectivas
apontam para que durante a execução dos projetos os ORBEA devam acompanhar os
projetos e, depois de concluídos, reportar à DGAV diversa informação. Este
órgão é uma modificação dos atuais comités de ética aplicados a animais, com
poderes mais abrangentes, não estando limitada à aprovação do projeto para
execução. A nova diretiva cria ainda a necessidade da criação de um quadro de
tratadores em fulltimeligados ao biotério e o desenvolvimento de uma estreita
colaboração com os técnicos de manutenção de todas as condições físicas das
instalações a fim de assegurar o normal funcionamento das mesmas.
Correspondência
ANA ISABEL MOURA SANTOS
e-mail: aisantos@fcm.unl.pt
