Determinação de pesticidas organofosforados em água usando microextração em
fase sólida e CGAR-EM
INTRODUÇÃO
Os pesticidas organofosforados constituem uma classe importante de inseticidas
usados atualmente no combate a diversos tipos de pragas na agricultura. A
aplicação indiscriminada no campo tem originado graves problemas ao meio
ambiente. Entre eles, ressalta-se a contaminação dos mananciais usados no
abastecimento de água potável das cidades. Embora estes pesticidas se degradem
rapidamente em água, existe sempre a possibilidade de permanecerem resíduos e
subprodutos, em níveis relativamente nocivos para o consumo humano. Eles
apresentam uma alta toxicidade com os valores DL50variando entre 10-50 mg/Kg e
a sua ação tóxica no organismo se processa pela inibição da enzima
colinesterase com consequente acúmulo de acetilcolina nas fibras nervosas, o
que impede a transmissão de novos impulsos gerando uma série de efeitos no
organismo tais como convulsões, paradas respiratórias e coma1. A Organização
Mundial de Saúde (OMS) recomenda como valor máximo permitido em água 0,1 mg/
L para cada pesticida e 0,5 mg/L para o total de pesticidas 2.
Em geral, os métodos usados na análise de resíduos de pesticidas em água exigem
que se efetue previamente a extração e pré-concentração destes compostos. Os
métodos oficiais utilizam técnicas analíticas de extração líquido-líquido (ELL)
e extração por fase sólida (EFS). A ELL envolve grandes quantidades de
solventes caros e tóxicos e elevados tempos de análise; já a EFS, embora
apresente uma série de vantagens em relação à ELL, tem como desvantagens
entupimento, falta de reprodutibilidade e a não reutilização dos cartuchos3.
Uma nova técnica de extração e pré-concentração, denominada microextração em
fase sólida (MEFS) foi desenvolvida pelo grupo de Pawliszyn4a partir de 1989 e
aplicada na extração de diversos grupos de analitos voláteis e semivoláteis em
matrizes, tais como água, ar e solo. Esta técnica de extração apresenta uma
série de vantagens com relação à simplicidade da amostragem, baixo custo, a não
utilização de solventes, maior precisão, menor limite de detecção, reutilização
da fibra e fácil automação5-8. Basicamente, este processo ocorre em duas
etapas: na primeira etapa, uma fibra de sílica fundida coberta com uma fase
estacionária e adaptada em uma seringa é colocada em contato direto com amostra
ou em "headspace" para efetuar a extração dos analitos. Em seguida a
fibra é introduzida diretamente no injetor de um cromatógrafo a gás, onde os
compostos são liberados termicamente e analisados. Pawliszyn e colaboradores em
recentes publicações mostram a aplicação da MEFS no desenvolvimento de
metodologias para análise de pesticidas organofosforados, herbicidas
nitrogenados em águas e solos9-15.
A proposta deste trabalho foi a de desenvolver e avaliar um método para análise
de vários pesticidas organofosforados em níveis de ppt em água, utilizando como
técnica de extração e pré-concentração a microextração em fase sólida, seguida
de análise por cromatografia gasosa de alta resolução usando um detector
seletivo de massas.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Utilizou-se uma mistura padrão EPA 8270 (Supelco, Bellefonte,USA) constituida
pelos pesticidas O,O,O-Trietil fosforotioato, Tionazin, Sulfotepp, Forate,
Dimetoato, Disulfoton, Paration Metílico, Paration Etílico, Famphur e mais os
pesticidas Etion e Diazinon (POLYSCIENCE, Niles, USA). A mistura padrão foi
preparada em metanol grau HPLC (Carlo Erba, Roma, Itália) para uma concentração
de 200,0 mg/L e as diluições feitas em água pura proveniente do sistema MILLI-
Q (Millipore, São Paulo, Brasil).
Aparelhagem
As análises foram efetuadas usando um cromatógrafo a gás modelo Hewlett Packard
5890 serie II, equipado com um injetor com e sem divisão de fluxo (split/
splitless) e um detector seletivo de massas HP modelo 5971 A com o
multiplicador de elétrons à 2300 volts e operado no modo de monitoração de íons
selecionados (SIM). A temperatura da linha de transferência e o tempo de não
ionização (delay time) foram respectivamente 280oC e 5 min. O injetor sem
divisão de fluxo (splitless) foi mantido a 240oC e a purga do divisor fechada
por 5 min. Utilizou-se uma coluna capilar HP-5 de 30 m x 0,2 mm d. i. e 0,33 mm
de espessura do filme com a pressão na cabeça da coluna de 15 psi e a seguinte
programação de temperatura no forno: 50oC por 5 min, 20oC/ min de 50 a 195oC,
5oC/min de 195 a 220oC, 10oC/min de 220a 280oC mantendo por 2 min a 280oC. As
amostras foram coletadas em frascos de 1L de cor âmbar com tampa de teflon,
resfriadas entre2-5oC e analisadas em 24 horas.
Procedimento para a microextração em fase sólida (MEFS)
Efetuou-se a microextração em fase sólida com uma seringa manual e fibras com a
fase de polidimetilsiloxano com 100 mm de espessura (SUPELCO). Um agitador
magnético Cimarec (Thermolyne) e barras magnéticas de teflon foram usados na
agitação das amostras aquosas durante o processo de microextração.
A extração e pré-concentração dos pesticidas organofosforados foi feita usando
o procedimento padrão de extração direta (Figura_1), onde a fibra é imersa na
amostra aquosa por um determinado tempo. Em seguida os compostos extraídos são
dessorvidos termicamente dentro do injetor de um CG. As fibras novas foram
condicionadas a 250oC por 3-4 horas no injetor do cromatógrafo antes da sua
utilização. No processo de microextração utilizou-se um volume constante de
16,00mL dos padrões e amostras em frascos tipo espaço confinado (headspace) de
20 mL com septos de borracha butílica faceados com teflon e sob agitação
magnética. O tamanho da agulha foi de 2 cm, o tempo de extração foi de 25
minutos e o tempo de dessorção térmica foi de 5 minutos para evitar efeito
memória.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Processo de Concentração
Durante a microextração, a partição dos pesticidas organofosforados entre a
fase aquosa e a fase polimérica de polidimetilsiloxano se processa até que o
equilíbrio seja obtido. A constante de equilíbrio de cada pesticida depende da
maior ou menor solubilidade dos pesticidas na fibra. A Figura_2mostra o estudo
da otimização do tempo de extração usando um padrão de 1,60 ng/mL, onde se pode
observar que para a maioria dos compostos o equilíbrio é alcançado após 60min
de extração. Como em MEFS não há a necessidade de se usar o tempo de equilíbrio
desde que seja mantido o tempo de extração constante, o tempo determinado
experimentalmente foi de 25 min, pois apresentou uma boa relação entre as áreas
dos picos e um tempo de análise aceitável. O tempo de dessorção e a
profundidade da agulha também foram determinados experimentalmente verificando
as intensidades das áreas dos picos com a mudança destes parâmetros.
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O dimetoato apresentou problemas no processo de extração, provavelmente devido
à sua alta solubilidade em água, que é em torno de 25 g/L16. Foram feitas
algumas tentativas com solução saturada de NaCl para aumentar a recuperação do
dimetoato através do aumento da força iônica da solução. Os resultados não
mostraram grandes variações no índice de recuperação do dimetoato, entretanto,
observou-se uma redução no número de reutilizações da fibra, o que se deve
provavelmente a alta concentração do sal.
Soluções tampão17 de glicina 0,1 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, HCl 0,1 mol/L com pH 2
e ácido cítrico 0,1 mol/L e hidrogenofosfato dissódico 0,1 mol/L com pH 4 foram
testadas no preparo dos padrões. Verificou-se que não houve uma mudança
significativa no índice de recuperação dos pesticidas organofosforados pela
variação do pH.
Validação do Método
A determinação qualitativa dos pesticidas organofosforados foi realizada
através da injeção de uma mistura padrão de 5,00 mg/L com o detector seletivo
de massas no modo varredura (SCAN). Na análise quantitativa utilizou-se o
detector de massas no modo monitoração de íons selecionados (SIM) para a
construção das curvas de calibração dos pesticidas da mistura padrão. Na Tabela
1 encontram-se os tempos de retenção e os íons selecionados, sendo um deles
como íon quantitativo e os outros dois como íons qualitativos
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A linearidade do método foi determinada usando padrões aquosos dos pesticidas
organofosforados na faixa de concentração de 0,20 a 20,00 ng/mL. Na construção
das curvas de calibração foram utilizados cinco pontos com as seguintes
concentrações: 0,20; 0,50; 0,80; 4,00 e 20,00 ng/mL. A mistura padrão aquosa
foi extraída e analisada por três vezes e calculou-se as equações de regressão
e os coeficientes de correlação para cada pesticida, que se encontram
relacionados na Tabela_2. Pode-se observar que a maioria dos coeficientes de
correlação está acima de 0,999, mostrando que as equações são lineares e que é
possível quantificar estes pesticidas por padronização externa. Fez-se através
de um programa de Análise de Variância18,a validação dos modelos e a
significância estatística das curvas de calibração de cada pesticida. Os
resultados mostraram que não há evidências de falta de ajuste das curvas, ou
seja, as razões das médias quadráticas (MQfaj/MQep) é bem menor que o valor da
distribuição F no nível de confiança de 95% (Fvfaj,vep). Os altos valores da
razão Mqreg /MQr com relação ao Fvreg, vr e os erros relativamente pequenos
indicam que as regressões são estatisticamente significativas. Os pesticidas
dimetoato e o famphur não foram relacionados na Tabela_2, pois apresentaram
variações significativas nas suas respostas impossibilitando a quantificação
destes compostos. A precisão do método foi determinada extraindo e injetando
por sete vezes consecutivas a mistura padrão aquosa de 4,00 ng/mL dos
pesticidas organofosforados. Os valores de desvio padrão relativo (S%)
calculados para os pesticidas se encontram entre 5,70 a 10,20%, exceção ao
etion que apresenta o S% de 17,20. Na Tabela_3, estão relacionados os limites
de detecção calculados por comparação da relação sinal-ruído (S/R) determinados
com um padrão de 25,00 ng/L usando uma relação S/R igual a três (S/R=3).
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Foram analisadas amostras de águas coletadas nos rios Paraopeba, Rio Serra
Azul, Ribeirão Serra Azul, Ribeirão, Córrego Barro Preto e Córrego Laranjo, que
abastecem a cidade de Belo Horizonte e munícipios vizinhos, pois próximo a
estes rios encontram-se grandes plantações de hortaliças que utilizam vários
pesticidas da nossa mistura padrão tais como diazinon, etion e forato. Tentou-
se, inicialmente, determinar qualitativamente os compostos presentes nas
amostras usando o detector de massas no modo varredura (scan). Neste modo de
detecção a sensibilidade é limitada e não foi possível identificar os poucos
compostos presentes nas amostras, visto que os íons apresentavam abundâncias
relativamente baixas. Em seguida foram feitas as análises das amostras dos rios
usando as curvas de calibração construídas para cada pesticida da mistura
padrão com o detector de massas no modo monitoração de íons selecionados (SIM).
Os resultados obtidos não evidenciaram a presença de resíduos ou subprodutos
dos pesticidas organofosforados usados na mistura padrão nas amostras de água
dos rios. Existem duas possibilidades para este resultado negativo: a primeira
é que, devido ao controle da EMATER (BH) sobre o uso de pesticidas nesta
região, os agricultores reduziram substancialmente a aplicação dos mesmos. A
segunda, pode estar relacionada a degradação química (hidrólise19) destes
pesticidas em água. Não foi constatado, também, efeitos significativos da
matriz conforme cromatogramas apresentados na Figura_3_a-b, da mistura padrão
(a) e da amostra do rio Serra Azul (b) contaminadas com 0,50ng/mL.
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CONCLUSÕES
A análise de pesticidas organofosforados em matrizes aquosas usando a técnica
de extração de MEFS associada com CG-EM no modo íons selecionados(SIM)
apresenta grandes vantagens em relação aos métodos tradicionais, tais como, a
simplicidade da técnica de pré-concentração e extração, tempo de análise
reduzido, fácil automação e a não utilização de solventes. O processo de
validação para esta metodologia apresentou uma boa série de linearidade e
precisão. Os limites de detecção em níveis de ppt são adequados aos valores
estabelecidos pelas normas oficiais usadas no controle ambiental de pesticidas
organofosforados. Caso seja necessário, existe a possibilidade de se aumentar a
sensibilidade do método usando maiores quantidades de amostra ou aumentando o
tempo de extração. Efeitos de matriz significativos não foram observados quando
se efetuou a contaminação da amostra de água do rio Serra Azul com a mistura
padrão dos pesticidas. Outra vantagem é que o processo de extração via MEFS
pode ser totalmente automatizado através de um amostrador automático,
resultando em uma melhor precisão, além do que a automação permite a análise de
um grande número de amostras.
