MICROPROPAGAÇÃO DE CLONES DE BANANA cv. TERRA EM BIORREATOR DE IMERSÃO
TEMPORÁRIA
MICROPROPAGAÇÃO DE CLONES DE BANANA cv. TERRA EM BIORREATOR DE IMERSÃO
TEMPORÁRIA1
INTRODUÇÃO
A cultura da banana comprida (cv. Terra) tem se desenvolvido de forma notável
em Alagoas nos últimos 10 anos. Sem nenhum incentivo governamental, a cultura
vem crescendo baseada exclusivamente na demanda de um mercado cada vez mais
exigente. Cerca de 60% de toda a banana comprida comercializada na Ceasa do
Recife tem origem em Alagoas. Atraídos pelos bons preços obtidos com a banana
comprida, os produtores têm respondido com um significativo aumento da área
plantada no Estado e, portanto, com um aumento na oferta. Entretanto, a
qualidade da banana produzida tem sido bastante inferior àquela solicitada pelo
mercado. Tem sido observado que os novos plantios são instalados sem o uso de
tecnologia adequada, sobretudo no que diz respeito à qualidade das mudas
utilizadas. Mudas doentes, praguejadas e desclassificadas têm sido
freqüentemente utilizadas como material propagativo por serem mais baratas e
estarem à mão dos produtores. Essa situação tende a perdurar ainda por algum
tempo, considerando-se a inexistência de produtores de mudas de banana cv.
Terra qualificados no Estado e a falta de critérios tecnológicos dos produtores
ao implantarem os seus pomares.
Recentemente, apareceram no mercado brasileiro mudas de bananas micropropagadas
in vitro produzidas através de técnicas de cultura de tecidos. Tais mudas,
embora mais caras do que os propágulos naturais da bananeira, têm a vantagem de
serem isentas de pragas e doenças além de apresentarem maior vigor e facilidade
no transporte e plantio. Os principais obstáculos enfrentados para o aumento do
uso de bananeiras micropropagadas têm sido a falta de divulgação e oferta das
mudas em Alagoas. Seu preço, embora mais elevado do que o das mudas
convencionais, é geralmente compensado pela maior produtividade e qualidade das
bananas produzidas.
Apesar de a técnica de propagação in vitro da bananeira ser bastante difundida,
percebe-se que há deficiência em trabalhos que visem ao aumento da taxa de
multiplicação de algumas variedades importantes, levando em consideração, além
das variações somaclonais, os custos de produção.
Alguns fatores como a composição do meio de cultura, o seu contato com os
tecidos e a sua oxigenação parecem influir na capacidade micropropagativa dos
explantes (Lemos, 1996). Debergh (1982) observou que, quanto maior for a área
de contato da planta com o meio, maior será a absorção dos seus compostos e, em
conseqüência, maior também a taxa de crescimento dos explantes.
No sistema tradicional de micropropagação da bananeira, utiliza-se meio semi-
sólido. A natureza física deste meio possibilita apenas a absorção dos
nutrientes pelas partes da planta que estão em contato direto com o meio,
refletindo em uma baixa produção de biomassa.
Recentemente, um novo método de cultivo in vitro foi idealizado por Teisson e
Alvard (1994), que propuseram o cultivo de plantas em um sistema de imersão
temporária. O mesmo vem sendo utilizado com sucesso na França e Cuba, para
micropropagar banana e abacaxi (Ponce, 1997; Daquinta et al., 1997). Segundo
George (1993), os sistemas de biorreatores em geral têm sido uma opção
fortemente considerada quando se deseja aumentar a taxa de multiplicação, bem
como diminuir o custo de produção de mudas originárias de embriões somáticos,
suspensões celulares ou órgãos inteiros, uma vez que não é necessária a
freqüente transferência dos explantes como no sistema tradicional. Este método
baseia-se no princípio de que as plantas se desenvolvem melhor e mais
rapidamente quando cultivadas em intervalos regulares de imersão em meio
líquido seguido de drenagem. O maior contato das plantas com o meio de cultura
aumenta, consideravelmente, a sua absorção, uma vez que os nutrientes podem ser
absorvidos pelas folhas, caules e raízes. Em tese, as plantas absorvem mais
nutrientes no sistema de imersão do que no tradicional e, conseqüentemente,
produzem mais biomassa.
É fundamental que métodos mais eficientes e seguros de multiplicação da
bananeira sejam estabelecidos, de modo que a taxa de multiplicação seja
aumentada, mas que a fidelidade genética do material seja assegurada e que
produtos de melhor qualidade sejam produzidos.
O presente trabalho objetivou melhorar a taxa de multiplicação de propágulos de
banana cv. Terra, utilizando biorreatores de imersão temporária.
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal (BIOVEG) do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas. Para a obtenção
dos explantes, foram coletadas bananeiras matrizes da variedade
"Terra", também conhecida como "Comprida" na região, na
fazenda "Equipe Agropecuária" localizada no município de Jundiá,
Alagoas. Foram utilizados filhotes do tipo "chifre" colhidos de
touceiras sadias e produtivas. Os filhotes tiveram suas raízes removidas
juntamente com todos os tecidos escurecidos do córtex e foram tratados com uma
solução de fungicida (Benomyl 2g/L) antes de serem iniciados os procedimentos
de extração do domo meristemático.
Os rizomas tratados e selecionados foram reduzidos a 1/5 do seu tamanho
original, imersos em álcool absoluto por 10 segundos e flambados até a extinção
natural do fogo. Os rizomas foram então levados à câmara de fluxo laminar para
excisão e tratamento de desinfecção dos domos apicais.
Os domos apicais foram tratados com uma solução de hipoclorito de sódio (0.7%
v/v) por 30 minutos sob agitação e depois lavados com água destilada
autoclavada por três vezes. Posteriormente, foram imersos em uma solução de
cloreto de mercúrio (0.002g/100mL H2O) por 15 minutos e, em seguida, lavados
três vezes com água destilada autoclavada.
Os ápices caulinares desinfectados foram reduzidos para 0.5 cm3 e inoculados em
meio de cultura semi-sólido formado a partir dos sais e vitaminas de MS
(Murashige e Skoog, 1962) enriquecido com 30 g/L de sacarose e 3 mg/L de
benzilaminopurina (BAP). Após 30 dias, os explantes foram cortados ao meio e
reinoculados em meio fresco de mesma composição. A cada período de 30 dias, os
explantes foram repicados até a obtenção de uma quantidade suficiente para o
início dos experimentos. Todos os meios de cultura semi-sólidos ou líquidos
utilizados neste trabalho foram esterilizados em autoclave a 121 oC por 20
minutos.
Os biorreatores foram artesanalmente construídos no laboratório (BIOVEG/CECA/
UFAL), sendo constituídos por dois frascos com capacidade para 3 litros,
interligados entre si por tubos de silicone através das tampas contendo 1 litro
de meio de cultura líquido em um dos frascos. O outro frasco continha os
explantes de banana que eram imersos a cada 4 ou 12 horas(dependendo do
tratamento) por 10 minutos, após bombeamento de um frasco para outro. O
bombeamento foi feito utilizando-se de pequenas bombas para oxigenação de
aquários reguladas por dois temporizadores Siemens, de acordo com o esquema
abaixo:
Neste trabalho, foi utilizado em cada experimento o mesmo número inicial de 40
brotos para todos os tratamentos. No sistema de cultivo tradicional em meio
semi-sólido, os brotos foram individualizados e tiveram suas folhas e raízes
cortadas antes de serem inoculados em grupos de 4 explantes com cerca de 15 mm
de comprimento por frascos de vidro (100 x 180 mm). No sistema de imersão
temporária, os explantes também tiveram suas folhas e raízes cortadas e em
seguida inoculados em 2 ou 3 grupos de explantes unidos entre si
("clumps"). Neste caso, o tamanho dos explantes variou entre 10 e 15
mm de comprimento. As contaminações nos meios de cultura nos dois sistemas
foram evitadas utilizando-se explantes novos de culturas limpas e aplicando-se
aos meios 0.1% do biocida "Plant Preservative Mixture"
(PhytoTecnology Laboratories).
Experimento_1
O experimento teve um delineamento inteiramente casualizado, com fatorial (2 x
2) e duas repetições por tratamento. Os tratamentos utilizados foram:
- Ciclos de Imersão: 10 minutos de imersão a cada 4 horas, e 10 minutos de
imersão a cada 12 horas
- Renovação do Meio de Cultura: Sem renovação do meio e com renovação do meio
aos 30 dias de cultivo
O meio de cultura utilizado foi formado a partir dos sais e vitaminas de MS
(1962) enriquecido com 30 g/L de sacarose. Cada repetição do sistema de imersão
utilizou 1 biorreator de imersão temporária constituído por 2 frascos de 3
litros interligados entre si, contendo 1L de meio de cultura líquido.
Os explantes e microplantas foram submetidos a um fotoperíodo de 16 horas com
uma intensidade luminosa de 50 µmol.m-2.s-1 obtida de lâmpadas fluorescentes
frias. Após 60 dias de cultivo, as plântulas foram retiradas dos biorreatores,
avaliando-se o número de brotos totais e viáveis à aclimatação (> 3cm), peso da
biomassa fresca produzida, peso da matéria fresca das raízes e da parte aérea,
número de folhas e comprimento do pseudocaule. Em seguida, as plântulas foram
aclimatadas em casa de vegetação, utilizando como substrato uma mistura de
subsolo, torta de filtro e fibra de coco na proporção de 2:1:1.
Experimento 2
Mediante os resultados do Experimento 1, realizou-se um outro experimento para
avaliar o efeito do meio de cultura inicial no desenvolvimento de explantes de
banana cultivados em sistema de biorreatores com 10 minutos de imersão a cada
ciclo de 4 horas.
O delineamento foi inteiramente casualizado, com duas repetições por
tratamento. Foram utilizados dois tratamentos:
- Meio de cultura MS + 30 g/L de sacarose (MS0) com renovação do meio aos 30
dias para o mesmo meio.
- Meio de cultura MS + 30 g/L de sacarose + 3 mg/L de BAP (MSB) com renovação
do meio aos 30 dias para MS0
Os tratamentos foram comparados entre si e o que apresentou melhores
resultados, foi comparado ao sistema em meio semi-sólido (tradicional). O meio
de cultura utilizado no sistema tradicional foi o MSB com renovação do meio aos
30 dias para MS0. Cada repetição do sistema tradicional foi representada por 10
frascos (100 x 180mm) com 4 brotos de banana/frasco. Cada repetição do sistema
de imersão utilizou 1 biorreator constituído por 2 frascos de 3 litros
interligados entre si, contendo 1L de meio de cultura líquido. Foi utilizada no
biorreator a mesma biomassa inicial do sistema tradicional com o mesmo número
inicial de brotos. As condições de cultivo e as variáveis avaliadas foram as
mesmas utilizadas no experimento 1, descritas anteriormente. As contaminações
nos meios de cultura, nos dois sistemas, foram evitadas, utilizando-se
explantes novos de culturas limpas e aplicando-se aos meios 0.1% do biocida
"Plant Preservative Mixture" (Phyto Tecnology Laboratories).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento_1
Com base nos resultados apresentados na Figura_1, observa-se que o menor ciclo
de imersão (4 horas), ou seja, quando os explantes foram imersos por 10 minutos
a cada ciclo de 4 horas, proporcionou uma produção de biomassa cerca de 20%
superior, independentemente de o meio de cultura ter sido ou não renovado.
Um maior peso da matéria fresca da raiz e da parte aérea foi observado no ciclo
de 4 horas (Tabela_1). Neste ciclo, os explantes foram imersos no meio de
cultura oito vezes ao dia o que, provavelmente, possibilitou uma maior absorção
e aproveitamento do meio, ao contrário do ciclo de 12 horas em que os explantes
foram imersos apenas 2 vezes ao dia.
A renovação do meio de cultura aos 30 dias promoveu uma maior produção de
biomassa nos dois ciclos de imersão estudados, como mostra a Figura_1. Na
Tabela_1, pode-se observar o efeito significativo da renovação do meio de
cultura no crescimento dos explantes, onde o comprimento do pseudocaule e o
número de folhas foram maiores nos biorreatores que tiveram o meio de cultura
renovado, independentemente do ciclo de renovação do meio. Isso se deve,
provavelmente, à depleção dos nutrientes (açúcar, sais minerais e vitaminas) do
meio de cultura, tornando necessária a renovação do mesmo para um contínuo
crescimento dos explantes.
A percentagem de brotos aclimatados nos 4 tratamentos não variou
significativamente (Tabela_1), uma vez que, em todos, as condições testadas dos
explantes apresentaram um comprimento satisfatório para aclimatação.
Experimento_2
A Tabela_2 mostra os efeitos isolados do meio de cultura no desenvolvimento de
explantes de banana cultivados em biorreatores durante 60 dias. Observou-se que
a composição do meio de cultura influenciou a produção de biomassa. O
tratamento com o meio MSB (3 mg/L BAP), seguido do meio MS0, promoveu um maior
peso da matéria fresca da parte aérea, mas o peso da matéria fresca da raiz foi
menor quando comparado com o meio MS0 seguido do mesmo meio fresco (MS0).
O conceito clássico de Skoog & Miller (1957) define as auxinas e as
citocininas como as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas em
cultura de tecidos. A formação de raiz, parte aérea e calo em cultura de
tecidos é regulada pela disponibilidade e interação dessas duas classes de
reguladores de crescimento. O comprimento médio do pseudocaule dos explantes
cultivados sempre no meio sem hormônio (MS0) foi maior do que o daqueles
explantes cultivados na primeira fase em meio com BAP (MSB). Estes apresentaram
duas vezes mais brotos produzidos do que aqueles devido à ação da citocinina
(benzilaminopurina = BAP) aplicada ao meio (Tabela_2). Inúmeros trabalhos
(Lemos et al., 1998; Neziet al., 1998; Flores et al., 1999) relatam o efeito
positivo do BAP na formação de grandes números de brotos e alta taxa de
multiplicação em sistemas de micropropagação. Segundo Caldas et al., a
composição e concentração de hormônios no meio são fatores determinantes no
crescimento e no padrão de desenvolvimento, na maioria dos sistemas de cultura
de tecidos. Todavia, o meio de cultura não influenciou o número médio de folhas
produzidas pelos explantes (Tabela_2).
O número de brotos aclimatados também foi maior no tratamento que utilizou o
meio com BAP na primeira etapa (Tabela_2). Entretanto, observou-se que a sua
percentagem em relação ao total de brotos produzidos foi um pouco menor que
50%. Contrariamente, no tratamento que não utilizou hormônios (MS0), a
percentagem de brotos aclimatados em relação a seu total produzido foi de cerca
de 70%. Este fato pode ser explicado pelo grande número de brotos de tamanho
inferior a 3 cm (> 50%) que surgiram devido à indução pelo BAP e que não
tiveram tempo suficiente para se desenvolver nos 30 dias de cultivo no meio
MS0.
A Tabela_3 mostra o efeito do sistema de cultivo na produção de biomassa de
explantes de banana cultivados in vitro. Observa-se que, no sistema de imersão
temporária, a produção de biomassa foi 2,86 vezes maior do que a apresentada
pelo sistema tradicional. Essa maior produção de biomassa, observada no sistema
de imersão, deve-se, provavelmente, a um maior contato do meio líquido com os
explantes, o que proporcionou uma maior área de absorção e, conseqüentemente,
melhor aproveitamento do meio de cultura. Diferentemente, no sistema
tradicional, onde o meio de cultura utilizado foi semi-sólido, a área de
contato da planta com o meio estava limitada a sua base. Resultados semelhantes
foram obtidos por Lemos (1996) quando duplicou as taxas de produção de matéria
seca de graviola micropropagada ao utilizar o meio líquido no lugar do meio
semi-sólido com Gelrite.
A maior eficiência do sistema de imersão no aproveitamento do meio de cultura
pode ser também observada na Tabela_4, em que o sistema de imersão proporcionou
uma maior produção tanto de raízes quanto de biomassa da parte aérea quando
comparado com o sistema tradicional. Um significativo aumento da biomassa
vegetal produzida nos biorreatores de imersão foi também observado por Teisson
e Alvard (1994) e Daquinta et al. (1997).
O número de folhas das microplantas nos dois sistemas não apresentou diferença
significativa (Tabela_5). Entretanto, o comprimento médio do pseudocaule das
microplantas produzidas no sistema de imersão foi significativamente maior do
que no sistema tradicional ( Tabela_5).
Debergh (1982) observou que, quanto maior a área de contato da planta com o
meio, maior a absorção dos seus compostos e, em consequência, maior também a
taxa de crescimento dos explantes.
Um outro fator que parece favorecer o crescimento dos explantes nos
biorreatores é a constante renovação do ar durante o período de transferência
do meio, eliminando os possíveis gases prejudiciais produzidos pelo metabolismo
das plantas que normalmente se acumulam na fase gasosa dos sistemas.
Comparando-se os dois sistemas quanto ao número de brotos produzidos, observou-
se que, no sistema de imersão, foi possível obter-se 2,19 vezes mais brotos do
que no sistema tradicional (Tabela_6). O número de brotos aclimatados foi
superior no sistema de imersão, uma vez que as plantas obtidas nos biorreatores
apresentaram um maior crescimento.
Segundo Lemos (1996), a composicão do meio de cultura, o seu contato com os
tecidos e a sua oxigenação são alguns dos fatores que parecem influir na
capacidade micropropagativa dos explantes. Trabalho realizado por Lemos et al.
(2000), com cana-de-açúcar (Saccharum spp.), mostrou que, no sistema de imersão
temporária, a taxa de multiplicação foi 40% maior do que no sistema tradicional
e a biomassa produzida, 3 vezes superior. Resultado semelhante com cana-de-
açúcar foi observado por Feria et al. (1998) ao obter um coeficiente de
multiplicação de 10,92 no sistema de imersão contra 3,5 no tradicional.
CONCLUSÕES
1 - O ciclo de imersão de 4 horas proporcionou um maior aproveitamento do meio
de cultura.
2 - A renovação do meio de cultura foi essencial para um contínuo crescimento
dos explantes cultivados em sistema de biorreatores.
3 - A composição do meio de cultura teve influência significativa no
desenvolvimento dos explantes cultivados nos biorreatores. O meio de cultura
MSB, com renovação aos 30 dias para MS0, proporcionou uma maior produção de
biomassa e taxa de multiplicação.
4 - A micropropagação de bananeiras variedade "Terra" em biorreator
de imersão temporária apresentou maior eficiência na produção de biomassa,
maior número de brotos viáveis à aclimatação e maior crescimento dos explantes
quando comparado com o sistema tradicional.
