Alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado de ratos submetidos a
manipulação tímica com células dendríticas
GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTALINTRODUÇÃO
O objetivo do transplante de pâncreas ou de ilhotas de Langerhans é prover
fonte de insulina que seja suficiente para manter a glicemia dentro dos limites
da normalidade. Como conseqüência, o transplante deve prevenir as complicações
secundárias do diabetes, como também melhorar a qualidade de vida dos
pacientes, liberando-os da dependência de injeções de insulina.
A maior indicação do transplante de pâncreas ou de ilhotas de Langerhans é o
diabetes mellitus do tipo I, doença em que as células beta das ilhotas de
Langerhans são destruídas por processo auto-imune, resultante de inter-relação
complexa entre fatores genéticos e ambientais desconhecidos(5).
Antes do início da chamada era "insulínica", o coma diabético era a causa de
morte em pelo menos 2/3 dos pacientes com diabetes mellitus do tipo I, de
qualquer idade, porém com a introdução da insulina, em 1922, houve notável
regressão nesses números, aumentando, significativamente, a longevidade dos
doentes(3).
Mais de meio século após a introdução do tratamento do diabetes mellitus pela
insulina, os diabéticos ainda morrem mais cedo do que os não-diabéticos. A taxa
de mortalidade por sexo e por idade, nos diabéticos, é mais alta, em qualquer
faixa etária, quando comparada à população normal.
A diferença na taxa de mortalidade é, em parte, dependente da idade. Entre 20 e
40 anos de idade, o risco de morte é 10 ou mais vezes maior no diabético do
tipo I do que em não-diabéticos, enquanto em diabéticos acima de 50 anos, é,
apenas, de duas vezes.
A causa de morte está, também, relacionada com a idade: pacientes mais jovens
tendem a morrer de nefropatia, enquanto os mais idosos de doenças
cardiovasculares(3).
Na Inglaterra, a causa mais comum de cegueira, no período produtivo da vida, é
o diabetes mellitus. A retinopatia diabética é esperada em praticamente todos
os diabéticos e pode ser detectada em, aproximadamente, 80% dos pacientes
doentes por mais de 20 anos e em 100% daqueles com 40 anos de doença
diagnosticada(12, 30).
A prevalência da doença, em nosso meio, ainda não está bem estabelecida, porém
nos Estados Unidos é bem conhecida. Existe mais de 1 milhão de pacientes com
diabetes mellitus insulino-dependente, nesse País. A incidência anual da doença
é de 55 novos casos por milhão de população, ou 12.000 novos casos por ano. A
maioria dos casos são crianças, embora em todas as faixas etárias existam
grupos de risco(9, 31).
A alternativa de tratamento para esses doentes é o transplante de pâncreas que,
como se sabe, pode normalizar o metabolismo de carboidratos(17). No entanto, se
por um lado essa terapêutica pode prevenir ou reverter as complicações
vasculares, comumente vistas nos diabéticos tratados com insulina, por outro,
parece improvável que o estrito controle da glicemia pela administração de
insulina minimize as complicações(16, 29).
Os resultados do transplante vascularizado de pâncreas têm melhorado nos
últimos anos, no entanto, a cirurgia e a necessidade de imunossupressão
continuam sendo responsáveis pela significante morbimortalidade do
procedimento.
Desde que muitos dos problemas relacionados com este procedimento terapêutico
são inerentes da técnica cirúrgica ou da porção exócrina do pâncreas
transplantado, a simples implantação de ilhotas purificadas de Langerhans seria
uma alternativa viável.
Muito tem sido feito nos últimos 20 anos para o aperfeiçoamento das técnicas de
transplante de ilhotas de Langerhans: a grande atração dessa modalidade
terapêutica é de que elas podem ser injetadas, por via endovenosa, em órgão bem
vascularizado (como por exemplo o baço ou o fígado), evitando-se assim, a
necessidade de intervenção cirúrgica, como também as inconveniências
imunólogicas e inflamatórias conseqüentes do transplante de tecido exócrino
pancreático.
Apesar dos resultados encorajadores em roedores, o transplante alogênico de
ilhotas de Langerhans em grandes animais como também no homem, não tem
demonstrado produção significativa de insulina, por longos períodos(14, 24).
Por outro lado, o transplante de ilhotas de Langerhans vem enfrentando
dificuldades não só na rejeição imunológica, como também problemas anatômicos
específicos(29).
Sabe-se que as ilhotas de Langerhans dispersam-se entre os ácinos pancreáticos
e constituem entre 1% e 2% da massa do pâncreas. Assim, o seu transplante tem
necessitado de métodos complexos e às vezes ineficientes de seu isolamento e
purificação.
Um dos principais problemas da perda do enxerto é a rejeição aguda. Grande
passo para a sua solução foi dado por POSSELT et al.(22), que obtiveram pela
primeira vez a tolerância ao alotransplante das ilhotas de Langerhans em ratos,
inoculando no timo desses animais as mesmas ilhotas transplantadas em outro
órgão, associando-se dose única de soro anti-linfocitário, por via sistêmica.
Neste estudo serão apresentados os efeitos da inoculação de células
apresentadoras de antígenos (células dendríticas) no timo de ratos submetidos
ao alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado, como forma de manipulação
para provável obtenção de tolerância imunológica.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi realizado em 68 Rattus albinus, sendo 51 doadores fêmeas
da raça Wistar (RT1u) e 17 receptores machos, da raça Lewis (RT11). Água e
dieta foram administradas ad libitum.
Para a separação das ilhotas de Langerhans, foram utilizados ratos fêmeas
(Wistar (RT1u)), de peso corpóreo entre 120 e 210 g. Para receptores das
ilhotas de Langerhans, utilizaram-se ratos machos (Lewis (RT11)), com peso
corpóreo entre 170 e 220 g, onde o diabetes foi induzido por injeção de
estreptozotocina, na veia peniana.
Separação e purificação das ilhotas de Langerhans
Digestão do pâncreas ' O pâncreas distendido pela colagenase era colocado em
tubo com solução de Hanks e, a seguir, em banho com água a 37ºC e incubado por
17 minutos. Tomava-se cuidado para se monitorizar o tempo e a temperatura após
a água estar a 37ºC.
A fim de se interromper a digestão pancreática, o tubo era retirado da água
morna e a solução de Hanks aquecida era desprezada e substituída pela mesma
solução fria, sendo o tecido pancreático colocado em box com gelo e, a seguir,
passado por peneira com poros de 400 u.
O tecido digerido era re-suspenso em 20 mL de líquido de lavagem (solução de
Hanks) e centrifugado por 2 minutos à 1000 rpm, sendo este procedimento
repetido por 2 ou 3 vezes.
O tempo de centrifugação era curto e a velocidade não muito alta para remover-
se apenas células exócrinas e os "debris".
Método de purificação das ilhotas de Langerhans 'Após a digestão enzimática
tecidual, o pâncreas era lavado como descrito acima e após a decantação do
sobrenadante, obtinha-se o material para ser purificado.
O método de purificação utilizado foi com Dextran (Sigma Industrial D - 3759)
com peso molecular entre 70.000 e 90.000. Cento e sessenta e nove mg de Dextran
eram dissolvidos em 500 mL de Hanks (densidade = 1094) no período de 1 hora,
sendo a densidade da nova solução conferida com hidrômetro.
O material digerido era re-suspenso em 10 mL de Dextran a 31%, dissolvido em
solução de Hanks e misturado cuidadosamente. Os gradientes de Dextran usados
foram: 29% (11,27 mL Dextran + 1,3 mL de Hanks), 25% (9,8 mL Dextran + 2 mL de
Hanks) e 11% (4,4 mL Dextran + 6,4 mL Hanks).
Em tubo universal colocavam-se 3 mL de Dextran a 31%, a seguir a solução obtida
(tecido pancreático) era sobreposta por 4 mL de Dextran a 29%, 4 mL a 25% e 4
mL a 11%, sendo todo o material centrifugado a 400 rpm por 4 minutos e 2000 rpm
por 16 minutos(3).
Separação das ilhotas de Langerhans
Após a centrifugação, a separação das ilhotas era obtida da interface das
seguintes concentrações de Dextran: 11%-25% e 25%-29%. A seguir, eram removidas
com pipeta plástica de Pasteur e lavadas duas vezes com solução de Hanks: a
primeira por 3 minutos a 1000 rpm, e a segunda por 1 minuto.
Amostra de cada interface era examinada e contada numa placa de Petri, sob
visão direta, com auxílio de microscópio. As ilhotas obtidas eram, então,
utilizadas imediatamente para o transplante.
Método de contagem das ilhotas isoladas
O método usado para a contagem do número das ilhotas isoladas era, em resumo, o
seguinte: re-suspenção das células em 2 mL de solução de Hanks, misturando-se
adequadamente, a seguir 10 alíquotas de 20 µL eram colocadas em placa de Petri.
As ilhotas eram contadas sob visão direta de microscópio com aumento de 10
vezes.
A fórmula usada para calcular o número de ilhotas era:
_________________________________________________________________
| média do número total de ilhotas (10 gotas) x 100 = |
|_________________número_total_de_ilhotas_em_2_mL________________|
Identificação das ilhotas de Langerhans
Embora as ilhotas em roedores possam ser facilmente identificadas usando-se
microscópio de dissecção, método simples de coloração das mesmas foi usado para
quantificar-se a pureza da preparação.
As ilhotas podem ser coradas antes ou depois da separação com DTZ
(diphenylthiocarbazone - Sigma D-5130), que facilita a visualização das células
na interface das concentrações do Dextran.
Também foi demonstrado que este método de coloração não altera a função das
ilhotas in vitro e in vivo(11). O DTZ é substância que se liga às moléculas de
zinco nos grânulos de insulina, produzindo a cor avermelhada.
A solução de coloração foi preparada acrescentando-se seis gotas de 1 mMol de
hidróxido de amônio (30%) à 20 mg de DTZ dissolvido em 6 mL de etanol a 96%, o
que resultou numa solução de 13 mMol de DTZ com pH = 7,8.
A solução final com Ph = 7,4 foi obtida acrescentando-se 300 µLl dessa solução
a 100 mL de PBS (phosphate-buffered saline). Assim, um volume do pâncreas
digerido e nove volumes da solução de DTZ foram misturados e incubados à
temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
Procedimento operatório
Todo procedimento operatório foi realizado sob condições limpas. Os
instrumentos cirúrgicos eram colocados em recipiente com etanol a 70%, pelo
menos 6 horas antes do ato cirúrgico.
Os ratos eram anestesiados em câmara de vidro utilizando-se éter etílico (May;
Baker Ltd., Dagenham, Inglaterra). Essa anestesia era utilizada para os
procedimentos de curta duração. Para as intervenções prolongadas usava-se o
Hypnorm (0,04 mL/100 g de peso corpóreo) (Janssen Pharmaceuticals Ltd., Grove,
Oxford - OX12 ODQ, UK), citrato de fentanyl (0,315 mg/mL) e fluanizone (10 mg/
mL) através de injeção intramuscular na coxa dos animais, juntamente com o
Diazepan (CP Pharmaceuticals Ltd., Wrexham, UK), 10 mg/2 mL, por via
intraperitonial.
A tricotomia do abdome era realizada com máquina elétrica e o animal era
colocado em prancha de cortiça na posição supina, com os membros fixados.
Indução do diabetes mellitus
O animal era submetido a anestesia superficial por inalação de éter etílico
(May; Baker Ltd., Dagenham, Inglaterra) e colocado em posição supina em prancha
de cortiça.
Colhia-se neste momento, da veia da cauda do animal, amostra sangüínea para
dosagem da glicemia sérica. A seguir, a veia peniana era canulada (com seringa
de insulina de 1 mL e agulha de 12 mm x 0,4 mm) e a estreptozotocina (60 mg/kg)
era injetada (a estreptozotocina era dissolvida em PBS na concentração de 10
mg/mL). O pH do PBS era ajustado previamente para 4,5 com ácido cítrico).
A seguir, suspendia-se a anestesia inalatória e o animal era colocado em gaiola
isolada para controle da glicemia a cada 2 dias.
Os animais com níveis de glicemia acima de 13 mmol/L foram utilizados para o
transplante de ilhotas de Langerhans.
Cirurgia do doador - pancreatectomia
Utilizaram-se 51 ratos, fêmeas, da raça Wistar (RT1u), com peso corpóreo que
variou de 120 a 210 gramas.
Incisão mediana era feita no abdome do animal e o ducto biliopancreático era
visualizado. A ligadura da parte proximal do ducto era feita o mais próximo
possível do duodeno, usando-se fio monofilamentar 5-0 (Ethicon Ltd., UK) e
reparando-o com uma pinça hemostática tipo "mosquito" para visualização de sua
parte distal.
O ducto era, então, canulado com auxílio de microscópio (Zeiss, Alemanha - OPM1
6-SH), inserindo-se cânula de plástico fina e amarrando-a com fio de algodão 4-
0.
Antes da injeção enzimática o animal era exsanguinado, por secção da aorta
abdominal, na emergência dos vasos ilíacos.
Após o coração parar de bater, volume de 4 a 5,5 mL (25 mL/kg) de solução de
colagenase (Sigma do tipo XI, C-7657, na dosagem de 0,7 mg/mL + DNase
dissolvida em HBSS (Hanks balanced salt solution) - Sigma D-0876) era injetado
no ducto biliopancreático, onde se observava a distensão pancreática.
Após o órgão encontrar-se totalmente preenchido pela colagenase, era realizada
a pancreatectomia, dissecando-se o pâncreas da grande curvatura gástrica, do
duodeno, do retroperitônio, do intestino grosso, do intestino delgado e do
baço, com tesoura de microcirurgia, tomando-se o cuidado de não se romper a
cápsula pancreática, para que não houvesse extravazamento da colagenase.
A seguir, o pâncreas era colocado em tubo universal que, imediatamente, era
transferido para "box" de gelo, e levado ao laboratório. O tempo de isquemia
fria não era superior a 30 minutos.
Cirurgia do receptor - transplante de ilhotas de Langerhans
Nove ratos, machos da raça Lewis (RT11) pesando entre 170 e 220 g foram usados
como receptores de ilhotas de Langerhans de doadores fêmeas da raça Wistar
(RT1u).
O diabetes era induzido por injeção, endovenosa, na veia peniana de
estreptozotocina (60 mg/kg). Quatro dias depois da indução do diabetes, o
animal era anestesiado com a associação Hypnorm intramuscular (0,04 mL/100 g de
peso corpóreo) e Diazepan intraperitonial (0,05 mL/100 g de peso corpóreo)
colhendo-se amostra sangüínea, da veia da cauda do rato, para dosagem da
glicemia antes da laparotomia.
O estômago, o intestino grosso e o delgado eram envolvidos em gaze úmida e
afastados para o lado direito do abdome. A veia porta era visualizada e
puncionada com Butterfly nº 23 (Venisystems, TM, Abbott, Ireland Ltd.), com
agulha de 19,1 mm e diâmetro de 0,5 mm.
As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS, eram aspiradas em seringa de 1 mL com
solução salina e injetadas, via veia porta, no fígado. Após a injeção, a agulha
era retirada da veia porta e esponja de material absorvível (Spongostan e
Standard 70 x 50 x10 mm, Ferrosan - Denmark) era colocada no local da punção,
comprimindo-se o vaso suavemente por 2 minutos, para evitar o sangramento.
O abdome era, então, fechado em dois planos de sutura contínua usando-se
algofil 4-0 para o plano muscular e para a pele.
O animal era avaliado diariamente no pós-operatório, e dosagens de glicemias
eram feitas a cada 2 dias.
Separação e purificação das células dendríticas do baço
Ratos fêmeas, da raça Wistar (RT1u), foram utilizados como doadores de células
dendríticas. As células dendríticas purificadas eram extraídas do baço dos
animais, segundo modificação do método de Klinkert.
Resumindo, o animal era esplenectomizado e todo tecido gorduroso e conectivo
periesplênico era retirado, sendo o órgão colocado em solução de HBSS dentro de
recipiente com gelo e transferido para o laboratório. A seguir, o material
obtido era macerado e passado suavemente através de peneira de metal, onde os
esplenócitos eram coletados e colocados em placa de Petri.
As células mononucleares eram obtidas por centrifugação (1200 rpm por 10
minutos), utilizando-se gradiente com 1 mL de albumina bovina sérica (ABS),
(densidade 1,1 g/mL, 330 mOsm) e 4,85 mL de PBS (densidade de 1081 g/mL). A
seguir, as células eram recobertas por 0,5 mL de PBS (phosphate-buffered
saline) e centrifugadas a 12500 rpm por 10 minutos, em centrífuga do tipo
Beckeman.
As células aderentes eram removidas, ficando em cultura de tecido por uma noite
a 37º C com 5% de CO2 no ar ambiente. Coletavam-se, cuidadosamente, as células
da interface e lavavam-se as mesmas, por duas vezes com HBSS (Hanks balanced
salt solution), sendo em seguida, centrifugadas (2300 rpm por 20 minutos),
utilizando-se 5 mL da solução de células e misturando-as a 3 mL de metrizamide
a 13,68%.
As células dendríticas obtidas da interface das soluções tinham pureza de mais
de 90%, estavam contaminadas por alguns linfócitos do tipo B e eram avaliadas
por coloração imunoistoquímica, utilizando-se anticorpos monoclonais (Figura
1).
Inoculação de células dendríticas
O animal era anestesiado utilizando-se a associação Hypnorm (0,04 mL/100 g de
peso corpóreo) e Diazepan (0,05 mL/100 g de peso corpóreo), colocado em posição
supina, com sua região cervical sob microscópio cirúrgico (Zeiss, Alemanha,
OPMI 6-SH) e com o cirurgião posicionando-se na extremidade cefálica do animal.
Incisão mediana, de 3 cm , na região cervical anterior era realizada,
estendendo-se até o 1/3 superior do esterno. Os músculos pré-traqueais eram
dissecados e os pólos superiores do timo eram expostos.
O timo era, então, liberado do seu ligamento mediastinal fixo ao esterno. A
margem cefálica do esterno e a junção esterno-clavicular direita eram expostas,
utilizando-se eletrocautério para pequenos animais. A seguir, esta junção era
seccionada.
Neste momento, um assistente sentado em posição oposta ao cirurgião, afastava o
esterno e a clavícula para melhor dissecção dos lobos do timo. Essa mobilização
permitia ao cirurgião colocar o 1/3 superior do timo sob visão direta, através
da lente do microscópio, utilizando-se 16 vezes de aumento. A injeção celular
era realizada utilizando-se seringa Hamilton de 100 µL, com agulha de 25 mm,
injetando-se 20 µL da suspensão celular (células dendríticas do baço -
suspensão celular contendo 4 x 105 destas células, diluídas em 20 µL de solução
de Hanks), em cada um dos lobos do timo.
Para evitar a ruptura capsular do timo, o seu 1/3 superior era afastado
cuidadosamente, sendo a agulha introduzida no pólo superior e movendo-se em
direção ao pólo inferior, onde a injeção celular era completada. A agulha era
retirada cuidadosamente, para minimizar a possibilidade de extravazamento.
O lobo contra-lateral do timo era injetado, utilizando-se a mesma técnica. A
junção esterno-clavicular era reconstruída com ponto único, de fio
monofilamentar 4-0, sendo os planos musculares e a pele fechados com algofil 4-
0 em sutura contínua.
A inoculação destas células no timo era realizada 7 dias antes do transplante
de ilhotas de Langerhans e 3 dias antes da indução do diabetes mellitus.
Injeção intraperitonial de soro anti-linfocitário
Junto com a inoculação das células dendríticas no timo dos animais, um
mililitro de soro antilinfocitário (Accurate Scientific Company, Westbury,
EUA), era injetado na fossa ilíaca direita dos animais receptores (Lewis -
RTIl), utilizando-se seringa de insulina de 1 mL e agulha de 12 mm x 0,4 mm, 7
dias antes do transplante de ilhotas de Langerhans e 3 dias antes da indução do
diabetes mellitus.
Cirurgia do receptor - transplante de ilhotas de Langerhans
Grupo alogênico - solução de Hanks (Controle) ' Oito ratos machos, da raça
Lewis (RT11), pesando entre 140 e 320 g, foram usados como receptores para o
transplante de ilhotas de Langerhans de doadores fêmeas da raça Wistar (RT1u).
Três dias antes da indução do diabetes, os animais haviam sido submetidos a
injeção intra-tímica de 20 µL de solução de Hanks em cada lobo do timo.
O diabetes foi induzido nos ratos por injeção endovenosa na veia peniana de
estreptozotocina (60 mg/kg). Quatro dias depois da indução do diabetes, o
animal era anestesiado com a associação Hypnorm intramuscular (0,04 mL/100 g de
peso corpóreo) e Diazepan intraperitonial (0,05 mL/100 g de peso corpóreo),
colhendo-se amostra sangüínea da veia da cauda do rato, para dosagem da
glicemia antes da laparotomia.
O estômago, o intestino delgado e o grosso eram envolvidos em gaze úmida e
afastados para o lado direito do abdome. A veia porta era visualizada e
puncionada com Butterfly nº 23 (Venisystems, TM, Abbott, Ireland Ltd.), com
agulha de 19,1 mm e diâmetro de 0,5 mm.
As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS eram aspiradas em seringa de 1 mL com
solução salina e injetadas no fígado, via veia porta. Após a injeção a agulha
era retirada da veia porta e esponja de material absorvível (Spongostan e
Standard 70 x 50 x 10 mm, Ferrosan - Dinamarca) era colocada no local da
punção, comprimindo-se o vaso suavemente por 2 minutos, para evitar-se o
sangramento.
O abdome era, então, fechado em dois planos de sutura contínua, usando-se
algofil 4-0 para o plano muscular e para a pele. O animal era avaliado
diariamente, no pós-operatório.
Os níveis da glicemia foram medidos antes do transplante e valores acima de 15
mmol/L (em 2 dias consecutivos) confirmavam o estabelecimento do diabetes e/ou
rejeição aguda após o transplante das ilhotas.
Grupo alogênico - células dendríticas 'Nove ratos, machos, da raça Lewis
(RT1l), pesando entre 170 e 220 g foram usados como receptores de ilhotas de
Langerhans de doadores fêmeas da raça Wistar (RT1u).
Três dias antes da indução do diabetes, haviam sido submetidos a injeção intra-
tímica de 4 x 105 células dendríticas em 20 µL de solução salina, em cada lobo
do timo.
O diabetes era induzido por injeção endovenosa na veia peniana, de
estreptozotocina (60 mg/kg). Quatro dias depois desta indução, o animal era
anestesiado com a associação Hypnorm intramuscular (0,04 mL/100 g de peso
corpóreo) e Diazepan (0,05 mL/100 g de peso corpóreo) colhendo-se uma amostra
sangüínea, da veia da cauda do rato, para dosagem da glicemia antes da
laparotomia.
O estômago, o intestino delgado e o grosso eram envolvidos em gaze úmida e
afastados para o lado direito do abdome. A veia porta era visualizada e
puncionada com Butterfly nº 23 (Venisystems TM, Abbott, Ireland Ltd.), com
agulha de 19,1 mm e diâmetro de 0,5 mm. As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS
eram aspiradas em seringa de 1 mL com solução salina e injetadas, via veia
porta, no fígado. Após a injeção, a agulha era retirada da veia porta e esponja
de material absorvível (Spongostan e Standard 70 x 50 x 10 mm, Ferrosan -
Dinamarca) era colocada no local da punção, comprimindo-se o vaso suavemente
por 2 minutos, para evitar o sangramento.
O abdome era, então, fechado em dois planos de sutura contínua, usando-se
algofil 4-0 para o plano muscular e a pele. O animal era avaliado diariamente,
no pós-operatório.
Os níveis de glicemia foram medidos antes do transplante e valores acima de 15
mmol/L (em 2 dias consecutivos), confirmavam o estabelecimento do diabetes e/ou
rejeição aguda após o transplante das ilhotas.
Análise estatística
Utilizou-se o teste, não-paramétrico, de Mann-Whitney na comparação entre as
glicemias antes e depois do transplante de ilhotas de Langerhans dos seguintes
grupos: controle (solução de Hanks ) x (células dendríticas). Para todo o
estudo foi considerado o nível de significância de 5%.
RESULTADOS
Grupo Alogênico - (Wag-Lewis) ' Controle-solução de Hanks
Cirurgia do doador ' Com o método de purificação e separação das ilhotas de
Langerhans obteve-se 3637 ± 783,3 ilhotas com pureza de 85,12 ± 3,52% (Tabela
1).
Cirurgia do receptor ' A dose de estreptozotocina utilizada para a indução do
diabetes mellitus, nos animais deste grupo, foi de 11,51 ± 3,39 mg, obtendo-se
níveis de glicemia de 26,48 ± 7,07 mmol/L (Tabela_1).
O transplante de 3637 ± 783,3 ilhotas de Langerhans no fígado desses animais,
normalizou a glicemia que chegou a 7,21 ± 0,57 mmol/L no segundo dia de pós-
operatório (PO) (diferença significativa com relação ao pré-operatório). Do PO
imediato até o 8º dia de PO, a glicemia não se elevou significativamente, porém
a partir do 10º dia de PO houve aumento significativo desse parâmetro, o que
pode ser compatível com rejeição aguda do enxerto (Tabela_1). A demonstração
gráfica desses valores pode ser observada na Figura 1.
O tempo médio de sobrevida das ilhotas transplantadas está na Tabela_5.
Grupo alogênico - (Wag-Lewis) - Células dendríticas
Cirurgia do doador ' Com o método de separação e purificação das ilhotas de
Langerhans obteve-se 3268 ± 378 ilhotas com pureza de 87 ± 4,47 % (Tabela_2).
Com o método de separação e purificação das células dendríticas do baço obteve-
se 3,34 x 105 ± 1,16 células (Tabela_2).
Cirurgia do receptor ' A dose de estreptozotocina utilizada para a indução do
diabetes mellitus, nos animais deste grupo, foi de 11 ± 1,16 mg, obtendo-se
níveis de glicemia sérica de 27,5 ± 8,04 mmol/L (Tabela_2).
O transplante de 3258 ± 378 ilhotas de Langerhans no fígado desses animais,
normalizou a glicemia que chegou a 9,3 ± 2,85 mmol/L no 2º PO (diferença
significativa com relação ao pré-operatório). Do 4º PO ao 10º PO a glicemia
elevou-se significativamente, o que pode ser compatível com quadro de rejeição
aguda do enxerto e certamente precoce (Tabela_2). A demonstração gráfica desses
valores pode ser observada na Figura 2.
O tempo médio de sobrevida das ilhotas transplantadas está na Tabela_5.
"Primary non-function"
Cirurgia do doador ' Com o método de separação e purificação das ilhotas de
Langerhans obteve-se 3080 ± 878,3 ilhotas com pureza de 86,75 ± 2,36 % (Tabela
3).
Com o método de separação e purificação das células dendríticas do baço obteve-
se 4,12 x 105 ± 1,04 células (Tabela_3).
Cirurgia do receptor ' A dose de estreptozotocina utilizada para a indução do
diabetes mellitus, nos animais deste grupo, foi de 11,6 ± 2,09 mg, obtendo-se
níveis de glicemia sérica de 26,37 ± 7,77 mmol/L (Tabela_3).
O transplante de 3080 ± 878,3 ilhotas de Langerhans no fígado desses animais
não normalizou a glicemia, que se manteve em níveis superiores a 20 mmol/L por
todo o P.O., o que é compatível com o não funcionamento do transplante (Tabela
3). A demonstração gráfica desses valores pode ser observada na Figura 3.
A média e o desvio-padrão do grupo controle (solução de Hanks) comparado ao de
células dendríticas, estão representados na Tabela_4.
DISCUSSÃO
O método de isolamento, purificação e transplante isogênico das ilhotas de
Langerhans em ratos, já foi descrito por CHAIB et al.(4), assim passou-se a
investigar o transplante alogênico (entre espécies), em animais manipulados no
timo com injeção de células alogênicas apresentadoras de antígenos (células
dendríticas), com intuito de induzir-se tolerância imunológica.
Optou-se pela utilização de ratos da raça Wistar, como doadores de células
(ilhotas de Langerhans e células dendríticas), com complexo de
histocompatibilidade maior ou haplotipo (RT1u) e ratos da raça Lewis, como
receptores, também, com haplotipo conhecido (RT11) e incompatíveis.
No grupo controle seriam transplantadas as ilhotas de Langerhans, dos ratos da
raça Wistar, em ratos da raça Lewis diabéticos (por injeção de estreptozotocina
endovenosa) já imunossuprimidos, com dose única de soro antilinfocitário, e
manipulados no timo apenas com injeção de solução tampão de Hanks, 7 dias antes
do transplante.
Neste grupo injetava-se estreptozotocina na veia peniana dos animais
receptores, 4 dias antes do transplante de ilhotas de Langerhans, na dosagem de
11,51 ± 3,39 mg. A dose era suficiente para a indução do diabetes, mostrando
que a glicemia, no dia do transplante (dia 0), era de 26,48 ± 7,07 mmol/L,
significativamente superior aos valores pré-operatórios.
O transplante de 3637 ± 783,3 ilhotas de Langerhans no fígado, via veia porta,
foi eficiente na normalização da glicemia que até o 4º dia de PO, manteve-se
igual aos valores pré-operatórios. A partir daí, iniciou-se o processo de
provável rejeição aguda que se estabeleceu, definitivamente, a partir do 9º dia
de PO, quando a glicemia sérica superou os níveis de 15 mmol/L, chegando no 10º
dia de PO a 20,01 ± 10,15 mmol/L, o que é, significativamente, superior aos
níveis encontrados até o 4º dia de PO, como demonstra a Figura 1.
Sabendo-se que o alotransplante (Wag-Lewis) das ilhotas de Langerhans, em
receptores imunossuprimidos com soro antilinfocitário, eram rejeitadas no 9º
dia de PO, restava investigar em primeira etapa, se a inoculação de células
dendríticas purificadas extraídas do baço dos ratos doadores atuariam como
moduladoras da resposta imunológica.
O "rationale" para esta inferência seria que as células apresentadoras de
antígenos (células dendríticas), provindas dos animais doadores, quando
injetadas no timo dos animais receptores, entrariam em contato direto com este
órgão e por conseguinte com os linfócitos T e B, que por certo são os
responsáveis pela aceitação ou rejeição dos transplantes de órgãos.
Supondo-se que durante a gênese e maturação, no timo, dos linfócitos T e B,
estes reconhecessem as células apresentadoras de antígenos (células
dendríticas) como próprias, provavelmente não rejeitariam as ilhotas de
Langerhans que, posteriormente, seriam transplantadas e provindas, também, dos
mesmos doadores, conseguindo-se com isto a obtenção de um estado de não
resposta imunológica ou tolerância ao transplante, como conseguiu POSSELT et
al.(22), quando injetou as próprias ilhotas de Langerhans, que seriam
transplantadas posteriormente no timo dos animais receptores.
Assim, nesse grupo de estudo os animais foram, 7 dias antes do transplante de
ilhotas, inoculados em ambos os lobos do timo com 3,94 ± 1,16 x 105 células
dendríticas purificadas, ao mesmo tempo em que era administrado, por via
intraperitonial, o soro antilinfocitário.
A injeção de 11 ± 2,12 mg de estreptozotocina endovenosa, na veia peniana
desses animais, 4 dias antes do transplante das ilhotas de Langerhans, foi
eficiente na produção do diabetes, mostrando que a glicemia no dia do
transplante (dia 0) era de 27,5 ± 8,04 mmol/L, o que é significativamente
superior aos valores pré-operatórios.
O transplante de 3268 ± 378 ilhotas no fígado, por via portal, fez com que a
glicemia tivesse queda significativa no 2º dia do PO, chegando a níveis de 9,3
± 2,85 mmol/L, no entanto, a partir do 3º dia de PO observou-se elevação
significativa nos níveis da glicemia, estando no 4º dia de PO em 20,42 ± 9,86
mmol/L, denotando com isso início de processo de rejeição aguda ao enxerto,
como mostra a Figura 2.
Assim, ficou evidente que a sobrevida média dessas ilhotas de Langerhans
transplantadas não foi superior a 3 dias e que a inoculação das células
dendríticas purificadas no timo desses animais, ao contrário do que se
esperava, não proporcionou melhor aceitação do enxerto e sim acelerou o
processo de rejeição aguda, fazendo supor que houve, o que se poderia chamar de
rejeição aguda precoce.
Vale neste ponto destacar que não se acredita que tenha havido processo de
sensibilização do receptor ao enxerto, uma vez que a imunossupressão com soro
antilinfocitário em ratos é bastante potente para manter os animais
imunodeprimidos por tempo relativamente longo, por depleção dos linfócitos
circulantes. Corroborando com este fato, viu-se que no grupo controle a
rejeição aguda, em animais também imunodeprimidos, somente se iniciou no 9º dia
de PO.
O tratamento com soro antilinfocitário rapidamente depleta os linfócitos T
periféricos circulantes, ocorrendo então, profunda linfopenia que persiste por
2-4 semanas(18), ficando a resposta imunológica bastante suprimida, como
também, acelera a cinética de células toti-potentes para o timo(13).
Em ratos, com a injeção única de soro antilinfocitário a população de células T
periféricas é transitoriamente (14 dias ) depletada a 10% dos níveis normais,
quando avaliado por FACS ("fluorescence-activated cell sorter")(22).
Outros pesquisadores produziram linfopenia em animais tratando-os com soro
antilinfocitário(32).
SACHS et al.(25) mostraram que em ratos tratados por soro antilinfocitário
produzido em coelho, por via intraperitonil, o grau de linfopenia em 24 horas é
dose dependente e, ao contrário de outros, esses autores não acharam perda da
efetividade do soro em períodos longos de administração deste imunossupressor.
Nem todos os estudos apontam para papel único do soro antilinfocitário no
controle da rejeição de transplante. Assim, sabe-se que as células T
periféricas não entram no timo(28), permitindo que células transplantadas com
antígenos estranhos sobrevivam em ambiente relativamente protegido da
vigilância imunitária.
Outros experimentos(1), mostraram que as células T maduras inativadas, quando
ativadas, não têm capacidade de migrar para o timo, do mesmo modo que a
inoculação de células sangüíneas estranhas no timo evitaram a interação de
antígenos do doador com as células T periféricas circulantes maduras(21),
prevenindo assim, a sua ativação. Isto permite aos timócitos maduros reconhecer
antígenos estranhos sem rejeição.
Além do mais, os achados de que o pré-tratamento com pequenas doses de
imunossupressão é irrelevante para alcançar-se a subseqüente tolerância,
sugerem que as lesões das células tímicas, induzidas por imunossupressão(27),
não são os mecanismos responsáveis pela sobrevida dos transplantes em estudos
prévios(23).
Quatro dos nove animais deste grupo (células dendríticas) apresentaram "primary
non-function" ou seja, o mal funcionamento primário do enxerto. Este fato
ocorreu apesar dos cuidados técnicos na separação e preparação das ilhotas, e
assim os animais após serem transplantados com 3080 ± 878,3 ilhotas, não
conseguiram normalizar a glicemia sérica que se manteve em patamares elevados,
não mostrando diferença significativa entre os valores pré e pós-transplante
como mostra a Figura 3.
Alguns fatores estão envolvidos na síndrome do não funcionamento adequado do
transplante de ilhotas de Langerhans. Os principais são: má perfusão do órgão
quando do momento da realização da cirurgia do doador, o não resfriamento do
pâncreas logo após a injeção da colagenase, a demora no processo de digestão
pancreática, pela colagenase, no laboratório, aumentando, com isto, o tempo de
isquemia fria das ilhotas de Langerhans, e por fim, o implante não adequado das
ilhotas no tecido hepático.
Os mecanismos celulares envolvidos na rejeição aguda dos alotransplantes são
complexos e o papel preciso das várias subpopuplações de células T nesse
processo, continua obscuro.
Muitos estudos têm mostrado que as células CD+4, são os pivôs da indução da
rejeição(10), enquanto outros estudos têm, também, identificado a ativação
dependente das células CD+4 das células T citotóxicas (CD+8) como importante
mecanismo efetor na rejeição dos alotransplantes com complexo de
histocompatibilidade, classe I e classe II, incompatíveis(15).
A expressão celular do antígeno do complexo de histocompatibilidade maior
classe II é considerado como envolvido na iniciação ou na perpetuação da
destruição mediada imunologicamente, que ocorre em doenças auto-imunes(2) e na
rejeição de alotransplantes(19).
No transplante de ilhotas um decréscimo de suas células, que expressam
antígenos classe II, está correlacionado com o prolongamento da sobrevida dos
enxertos(6).
Dentro das ilhotas de Langerhans, células classe II positivas residem com
células endócrinas que, normalmente, não expressam antígenos classe II e sim,
apenas pequenos níveis de antígenos classe I(11).
Essas células classe II positivas "leucócitos passageiros", células dendríticas
ou apresentadoras de antígenos são necessárias para a apresentação do antígeno
para o hospedeiro ou na produção de um co-estimulador (citocina primária ou
secundária) para ativação do processo do antígeno pelo hospedeiro que
resultaria na iniciação da rejeição do enxerto(11).
As ilhotas podem ser preparadas de pâncreas de ratos neonatos que estão sem
células apresentadoras de antígenos, como também transplantadas contra grande
diferenças de antígenos de histocompatibilidade, sem rejeição ou
imunossupressão(11).
A rejeição de aloilhotas de Langerhans isoladas mostra número de achados que
são típicos da rejeição de órgãos vascularizados, como também de outros
alotransplantes como: controle genético(20), latência(26), dependência da
dosagem(8), expressão sistêmica(7) e dependência da célula T(26).
Em conclusão, a inoculação de células alogênicas apresentadoras de antígenos
(células dendríticas) no timo de ratos imunossuprimidos e diabéticos, antes do
alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado, ao contrário de inibir a
reação do receptor contra o enxerto, prolongando a sobrevida média das ilhotas
e, possivelmente, levando ao estado de tolerância imunológica, induziu à
aceleração do processo de rejeição aguda.