Inibidores seletivos de prostaglandina endoperóxido sintase-2 (PGHS-2): nova
estratégia para o tratamento da inflamação
INTRODUÇÃO
O tratamento das doenças inflamatórias ganhou recentemente um novo alento pela
descoberta de uma segunda isoforma da prostaglandina-endoperóxido sintase
(PGHS), PGHS-2, descrita em 1992 por Holtzman e colaboradores1. Os resultados
subseqüentes dos estudos sobre sua função fisiológica indicaram que esta
enzima, responsável pela bioformação de prostaglandinas (PG's) a partir do
ácido araquidônico (AA)2, é a forma induzida por estímulos inflamatogênicos em
células que promovem a inflamação tais como fibroblastos, macrófagos, monócitos
e células sinoviais3.
A principal limitação dos fármacos antiiflamatórios não esteróides (NSAI's)
clássicos reside na incidência de efeitos gastro-irritantes4 e, menos
freqüentemente, nefro-tóxicos5, resultantes do mescanismo de ação desta classe
de agentes terapêuticos que atuam inibindo a biossíntese de PG's ao nível da
enzima PGHS6. O reconhecimento das diferenças morfo-fisiológicas entre as duas
isoformas de PGHS, sendo a forma constitutiva (PGHS-1) relacionada aos efeitos
secundários dos NSAI-clássicos e a segunda isoforma, mais recentemente
descoberta (PGHS-2), a induzida, permitiu prever-se a possibilidade de se
desenvolverem inibidores seletivos desta última, como estratégia para se obter
efeito antiinflamatório desprovido de efeitos colaterais indesejáveis7.
A indução da PGHS-2 por agentes pró-inflamatórios conhecidos (e.g. nterleucina-
18-10; lipopolissacarídio11-13; fator de necrose tumoral-a8,10,14; éteres de
forbol14,15,16; fator de transformação de crescimento b18; soro8,17;
endotelina-118; fator de ativação plaquetária19) explica a elevada concentração
desta isoforma nos tecidos inflamados e, conseqüentemente, a maior concentração
de PG's nos sítios inflamatórios. Por outro lado, a PGHS-1 é a isoforma da PGHS
que, sob condições fisiológicas, produz PG's necessárias à modulação das
funções gastrintestinais, renais e a homeostase vascular20.
Os NSAI's clássicos disponíveis no mercado (Quadro_1)21 reduzem a biossíntese
de PG's fisiológicas e fisiopatológicas através da inibição indiscriminada da
PGHS-1 e PGHS-222. É possível que a inibição da PGHS-2 seja responsável pelo
efeito antiinflamatório apresentado pelos NSAI's e que a inibição da PGHS-
1 seja responsável pelos efeitos secundários indesejados destes agentes23.
Entretanto, esta divisão simplista não contempla todos os dados experimentais
disponíveis para os agentes NSAI. O ácido 6-metoxi-naftilacético (6-MNA),
metabólito ativo da nabumetona (8), possui baixos efeitos gastro-irritantes sem
ser um agente seletivo para PGHS-220, com valores de IC50 de 64 mM e 93 mM para
PGHS-1 e PGHS-2, respectivamente2425 propos uma nova classificação para os
agentes NSAI, baseando-se na ação seletiva entre PGHS-1 e PGHS-2. Esta
classificação, ainda polêmica, não considerou todos os agentes NSAI's, mas
representa importante contribuição no sentido de classificar estes agentes em
função da seletividade que apresentam frente a cada uma das isoformas de PGHS.
Entretanto, considerando-se que a eficiência da inibição seletiva observada
frente PGHS-2 varia de acordo com o modelo farmacológico estudado, esta
classificação continua provisória.
INIBIDORES SELETIVOS DE PGHS-2
O planejamento de inibidores seletivos de PGHS-226 passou a representar para o
químico medicinal nova e atraente estratégia terapêutica, mais efetiva e
segura, de combate aos quadros inflamatórios, especialmente crônicos, como
artrite reumatóide27. Sabe-se que o efeito inibitório mais potente dos NSAI's
sobre a PGHS é obtido através de inibição irreversível tempo-dependente, a
qual, provavelmente, envolve a formação de ligação inicial rápida e reversível
do inibidor à enzima, seguida por mudança conformacional mais lenta e
essencialmente irreversível do complexo enzima-inibidor (Esquema 1)28. O
mecanismo de inibição dos inibidores seletivos de PGHS-2, descritos na
literatura29, tem sido relatado como sendo irreversível e tempo-dependente,
enquanto sua ação sob a PGHS-1 se caracteriza pela reversibilidade29. Este
componente tempo-dependente é, aparentemente, a base para a seletividade desta
nova geração de NSAI's23,29.
A maioria dos NSAI's-clássicos possui uma função ácido carboxílico, que
interage ionicamente com o grupo guanidina do resíduo Arg120 de ambas isoformas
de PGHS humana (hPGHS)3,29,30. Entretanto, nos inibidores seletivos de PGHS-2,
este importante grupo farmacofórico dos NSAI clássicos, com uma única exceção
que será citada posteriormente, está substituído por uma função metilsulfona ou
sulfonamida. Outra característica estrutural importante nos compostos seletivos
é a presença de dois anéis aromáticos, substituídos ou não, intercalados por um
heteroátomo (e.g. O, S, NH) ou por um anel central (heterocíclico, carbocíclico
ou aromático) (Esquema 2).
Gans e colaboradores, em 199031, antes da confirmação da hipótese da existência
da isoforma induzidada da PGHS, descreveram o composto DuP 697 (12) (Tabela_1),
o qual apresentou potência antiinflamatória comparável ao piroxicam (5) e à
indometacina (6), porém sem os efeitos secundários comuns ao emprego
terapêutico de NSAI's clássicos. Este composto (12), mesmo na dose de 400 mg/
kg, não induziu lesão gástrica em animais de laboratório quando administrado
por via oral (p.o.)31.
Procurando compreender, posteriormente, as características estruturais de (12)
que controlam sua seletividade, realizou-se estudo de SAR ("structure-
activity relationship") com diversos análogos (Tabela_1). O isômero de
posição entre os grupos SO2Me e F de (12) foi ligeiramente menos ativo (12 vs
13a; Tabela_1). O análogo desbromado (13b), apesar de menos potente do que (12)
para PGHS-2, foi mais seletivo por ter sido inativo para PGHS-1. O grupo
metilsulfona em (12 e 13b) mostrou-se crítico para a atividade e seletividade
nesta série32. Os derivados metil-sulfeto (13h) e metil-sulfóxido (13i) foram
inativos contra PGHS-232. Por outro lado, o homólogo etilsulfônico (13d) perdeu
substancialmente a atividade32. Contudo, a sulfonamida (13e) foi mais potente
do que seu análogo metilsulfona (13b), mas menos seletiva para PGHS-2. O
derivado (13g) isóstero apresentando o grupo SeO2Me no lugar da metilsulfona,
mostrou-se equipotente, porém também menos seletivo do que (13b)32. A
substituição do grupo metilsulfona por outros grupamentos -CONH2, -COMe, -CO2H,
-CO2Me e -CH2OH, forneceu compostos (13j a 13o) que foram inativos para PGHS-2.
Entre estes, (13j, 13l, 13n e 13o) foram de 2-86 vezes mais seletivos para
PGHS-132.
Outro composto que possui propriedades antiinflamatórias, analgésicas e
antipiréticas tão potentes quanto as apresentadas pelos NSAI's é o derivado NS-
398 (14)33. Com uma simples administração de 1000 mg/kg ou administração oral
durante três meses, as lesões renais e gastrintestinais observadas foram muito
baixas33. Copeland e colaboradores34 observaram posteriormente que este
derivado apresenta velocidade de inativação de PGHS-2 ligeiramente maior do que
a do DuP 697 (12), a qual é compensada pelo fato de este último possuir
afinidade para PGHS-2 ligeiramente maior34. O NS-398 (14), entretanto,
apresenta baixa biodisponibilidade oral e toxicidade devido à presença do
grupamento nitro35 que, in vivo,fornece metabólitos hepatotóxicos.
O derivado SC-58125 (15) apresentou efetiva atividade antiinflamatória em
vários modelos de inflamação crônica, tais como edema de pata de rato induzido
por carregenina e artrite adjuvante36. Mesmo em doses superiores àquela
antiinflamatória, este composto não inibiu a biossíntese de PGE2 no estômago,
nem causou ulceração gástrica37. Em condições experimentais similares, o AAS
(1) causa 55% de incidência de úlcera estomacal37. A ED50 de (15) para
toxicidade gastrintestinal é superior a 600 mg/kg, enquanto que a ED50 da
indometacina (6) é muito menor (8 mg/kg), mostrando o baixo perfil tóxico de
(15) quando comparado a agentes NSAI's amplamente utilizados na terapêutica
clássica36.
Vários trabalhos foram realizados a fim de se verificar o tipo de inibição que
os compostos Dup 697 (12), NS-398 (14) e SC-58125 (15) exercem sobre ambas as
isoformas de PGHS 23,28,34,38,39. Tais estudos permitiram identificar que estes
derivados são inibidores irreversíveis tempo-dependente para a isoforma 2,
enquanto que reversíveis para a isoforma 1, atuando de forma competitiva, ou
seja, ligando-se ao sítio ativo da enzima 23,28,34,38,39.
Gierse e colaboradores23 observaram que a mutação do resíduo Val509 encontrado
no sítio ativo da hPGHS-2 (correspondente ao resíduo Ile523 da hPGHS-1, vide
infra) por um resíduo Ile nesta posição, fazia com que estes inibidores
apresentassem um IC50 para a forma PGHS-2 mutante similar àquele observado com
a hPGHS-123. Estes dados sugerem que o mecanismo da seletividade observada com
estes derivados está intimamente associado com a presença de um grupo metileno
adicional, ou seja, as enzimas que apresentam este grupamento (hPGHS-2 mutante
Ile509 e hPGHS-1 Ile523 x hPGHS-2 Val509) não possuem a etapa de inibição
tempo-dependente23.
Reitz e colaboradores7, utilizando como substâncias-protótipo os compostos DuP
697 (12) e SC-58125 (15), planejaram novos derivados híbridos que, após
sintetizados, foram avaliados segundo sua atividade inibitória das enzimas
PGHS-1 e PGHS-2 humanas (hPGHS). Dentre estes, os compostos (16a) e (16b)
apresentaram o maior índice de seletividade7. Este estudo permitiu identificar
que a contribuição dos anéis heterocíclicos presentes nos compostos DuP 697
(12) e SC-58125 (15) correspondia apenas à manutenção da geometria cis entre os
anéis aromáticos substituídos, critério estrutural aparentemente necessário à
seletividade. Por outro lado, os anéis heterocíclicos centrais, por si só, não
pareciam ter importância significativa para inibição seletiva da PGHS-2,
podendo ser substituídos pelo anel ciclopentênico. Além disto, sustituição
geminal em C-4 do anel ciclopentênico (16c e 16d) diminui a seletividade para
PGHS-2 devido a um aumento da atividade inibitória sobre a PGHS-1 e/ou
diminuição da potência sobre a PGHS-2, sugerindo que o domínio enzimático de
ligação nesta região é estericamente sensível. A substituição do átomo de cloro
de (16a) por um átomo de flúor, clássica troca bioisostérica, resultou na perda
de atividade para PGHS-2 em aproximadamente 10 vezes (16a vs 16e), mas forneceu
um derivado mais ativo in vivo7.
Os autores observaram ainda que os derivados não substituídos em C-4 do anel
ciclopentênico possuíam baixa biodisponibilidade p.o. e um t1/2 relativamente
curto, devido, provavelmente, ao rápido metabolismo oxidativo que o grupo
metileno-alílico deste anel pode sofrer in vivo40. Conseqüentemente, a
introdução de substituintes em C-4 poderia exercer impedimento estérico
suficiente para evitar a oxidação enzimática40. Desta forma, foi desenvolvida
uma nova série de análogos 4-espiro-1,2-diarilciclopenteno-metilsulfonas e
sulfonamidícos (e.g. 17a a 17f)41. Nesta série observou-se que os derivados
sulfonamidícos eram os mais potentes, porém menos seletivos para PGHS-2 (17a e
17c vs 17b e 17d). A homologação do anel 4-espiro-ciclopropânico para
ciclobutânicos produziu aumento dramático na seletividade (17a e 17b vs 17c e
17d)41. Entretanto, homologia superior reduziu significativamente a atividade
do derivado ciclopentânico frente a PGHS-2 (17c vs 17e)41. O derivado com o
anel cicloexila (17f) foi essencialmente inativo, indicando mais uma vez que o
domínio enzimático de ligação do inibidor é estericamente sensível41. O
derivado (17a) foi nesta série aquele que apresentou melhor atividade in vivo
e, mesmo na dose de 200 mg/kg, não induziu lesão gástrica quando administrado
intragastricamente41. Em contraste, o derivado sulfonamidíco correspondente
(17b) induziu lesões gástricas nos 10 ensaios realizados, revelando sua baixa
seletividade41.
Face a estes resultados, foi postulado pelos autores,40 que a introdução da
sub-unidade espirociclopropila no anel ciclopentênico ocasiona restrição
conformacional responsável pelo aumento da atividade para PGHS-1 (16e vs 17a).
Para confirmar esta hipótese foi sintetizado o análogo espirociclopropila
ciclopentadiênico (18)40, que possui maior tensão angular e menor
flexibilidade. De fato foi observada menor seletividade, em virtude de aumento
na atividade em PGHS-140. De modo contrário, quando o tamanho do espiro-ciclo é
aumentado por homologia, causa redução na tensão do anel central ciclopentênico
e introduz um grau de liberdade conformacional que produz um composto mais
seletivo (17a vs 17c)40.
Utilizando como compostos-protótipo os derivados (17a e 17b), Huang e
colaboradores40 realizaram novo estudo de SAR, variando desta feita o resíduo
4'-flúor destes compostos. Nos compostos 4'-monossubstistituídos observou-se
relação direta entre o efeito retirador de elétrons dos substituintes e a
seletividade frente a PGHS40. Quanto maior este efeito, maior a seletividade
observada devido à menor atividade PGHS-1 (19a a 19i; Tabela_2)40. Os derivados
sulfonamídicos apresentaram menor seletividade do que aqueles metilsulfônicos
correspondentes. Contudo, estes por sua vez, apresentaram propriedades
farmacológicas superiores nos ensaios realizados in vivo40.
Na série de derivados dissubstituídos em um dos resíduos fenila, Huang e
colaboradores40 observaram que os derivados 3'-halo-4'-metoxifenila (19j a 19p;
Tabela_2) foram seletivos para PGHS-2 40. Este efeito inesperado pode ser
atribuído ao equilíbrio entre os efeitos retirador e doador de elétrons dos
substituintes presentes40. Dentre os análogos sulfonamídicos (19l, 19n e 19p),
o que apresentou maior seletividade foi o composto 3'-cloro-4'-metoxifenila
(19n), indicando que a seletividade para PGHS-2 não pode ser apenas atribuída
ao efeito eletrônico dos substituintes40.
Outros derivados indênicos análogos de (16e) foram descritos42. Nesta nova
série os compostos metilsulfônicos (20a) e sulfonamídicos (20b) foram os mais
ativos, sendo que o derivado com a função sulfonamida produziu, mais uma vez,
um composto mais potente para PGHS-2, porém menos seletivo42.
Sendo a posição alílica um sítio suscetível à metabolização oxidativa pelas
enzimas hepáticas43, nos derivados (20a) e (20b) a natureza benzil-alílica do
metileno indênico representa alvo fácil para a oxidação metabólica,
comprometendo a biodisponibilidade destes derivados. Desta forma, os autores42
aplicaram a estratégia do bioisosterismo44 para introduzir novas modificações
moleculares nestes compostos e obtiveram os derivados benzofurânicos (21a a
21d)42. Estes se mostraram menos potentes do que os protótipos (20a e 20b vs
21a a 21b), o mesmo ocorrendo quando o núcleo 4-fluorfenila foi substituído
pelo 3-flúor-4-metoxifenila42.
A flosulida (22) (CGP 28238) foi descrita como um composto antiinflamatório
altamente potente, com reduzidos efeitos gastrintestinais indesejáveis45,46.
Posteriormente, o estudo do mecanismo de inibição deste derivado sobre a PGHS-
2 evidenciou que, inicialmente, se observa uma ligação reversível de baixa
afinidade que evolui para ligação de alta afinidade, tempo-dependente47. Foi
proposto, que esta ligação de alta afinidade era, provavelmente, devida à
formação de intermediário tipo base de Schiff entre a carbonila indanônica de
(22) e um resíduo amínico no sítio de ligação enzimático, ocasionando uma
mudança conformacional na enzima47. O hidrogênio ácido da sulfonamida também
foi considerado essencial para a atividade inibitória seletiva, visto que sua
substituição por grupamento metila aboliu a atividade35.
A nimesulida (23)48 já era conhecida como agente antiinflamatório de baixos
efeitos gastro-irritantes antes da descoberta da PGHS-2. Sua atividade foi
inicialmente atribuída ao efeito "sequestrador de radicais-livres"
("radical scavenger") que possui49,50. Por apresentar relações
bioisostéricas com os derivados NS-398 (14) e flosulida (22), descritos como
inibidores seletivos de PGHS-2, esta substância foi recentemente re-avaliada
quanto a ação inibitória seletiva. Os resultados destes estudos recentes
indicaram que a nimesulida (23) é inibidor seletivo tempo-dependente da PGHS-
2 51.
O L-745,337 (24a) foi eleito, após extensivo estudo de SAR35, como o melhor
composto de uma série de tioéteres análogos da flosulida (22)35,52. Este
composto mostrou-se superior ao protótipo quanto às propriedades
farmacocinéticas e índice de ulcerogenidade em modelos em animais35,52. Os
análogos dissubstituídos 2',4'-dialogenados foram os mais potentes in vitroein
vivo (24a, 24b vs 24c). O derivado 4'-bromofenila (24d) apresentou boa potência
in vitro35. Posterior modificação bioisostérica clássica44 do espaçador
presente entre os anéis indanônico e aromático revelou que somente os átomos de
oxigênio e enxofre são bem tolerados nesta série (flosulida e 24a vs 24e, 24f,
24g, e 24h), indicando, ainda, que o grupo metilsulfonamida é
farmacoforicamente importante para a atividade observada, uma vez que a
substituição do grupamento metila por etila ocasiona perda na atividade
inibitória sobre PGHS-2 (24a vs 24i)35.
Buscando um grupo espaçador que apresentasse maior estabilidade in vivo em
relação ao ciclopentênila, Li e colaboradores53 desenvolveram novos compostos
utilizando como ligante vários anéis aromáticos (e.g. 25a-25g; Tabela_3)53.
Nestes estudos os autores observaram que a interação destes compostos com a
PGHS-2 é sensível às propriedades estéricas e eletrônicas das posições
adjacentes ao grupos 1,2-diarila, sendo o anel 4,5-difluorobenzeno o que
confere melhor perfil de inibidor seletivo potente (derivado 25b)53. Apesar de
(25a) e (25d) apresentarem boa atividade in vitro, estes compostos foram
praticamente inativos nos ensaios in vivo53.
Uma vez eleito o melhor grupo espaçador nesta série, os autores buscaram, em
seguida, desenvolver novos compostos oralmente ativos, variando desta feita o
anel 4-fluorofenila (derivados 25h a 25p)53. Mais uma vez, os derivados
sulfonamídicos foram mais potentes do que os metilsulfônicos (25h, 25j, 25m e
25o vs 25i, 25l, 25n e 25p), não só nos ensaios in vitro com também in vivo53.
O derivado sulfonamídico (25i) foi aquele que apresentou o melhor perfil
antiinflamatório nos ensaios in vivo53.
Sabendo que o sítio ativo da PGHS-2 pode ser menos estericamente sensível do
que aquele da PGHS-154 (vide infra), Black e colaboradores56 desenvolveram nova
estratégia para o planejamento de inibidores seletivos de PGHS-2. Esta nova
estratégia consistiu no aumento do volume molecular do núcleo da indometacina
(6), agente NSAI clássico não seletivo para PGHS-2, produzindo o composto
seletivo (26a), capaz de interagir com o sítio ativo da PGHS-2, mas não com o
da PGHS-156. A principal modificação realizada em (6) foi a substituição do
grupo N-(4-clorobenzoíla) da indometacina (6) pelo núcleo 2',4',6'-
triclorobenzoila (26a)56. Esta modificação molecular com dois átomos de cloro
vizinhos à ligação benzoílica introduziu restrição conformacional ao nível do
substituinte 2',4',6'-triclorobenzoila, forçando este núcleo a adotar
conformação perpendicular ao anel indólico, resultando em maior volume estérico
para este derivado em relação à indometacina (6) utilizada como protótipo neste
exemplo56. O composto (26a) apresentou razoável atividade PGHS-2 sem atividade
sobre a PGHS-156.
Em etapa subseqüente de modificação molecular, visando melhorar a potência do
derivado (26a), uma nova série de novos análogos foi sintetizada56.Entretanto,
o aumento suplementar do volume do substituinte orto-benzoíla resultou na
diminuição da atividade PGHS-2, com perda de seletividade56. A modificação
molecular seguinte, proposta pelos atores, consistiu em investigar análogos
indólicos da coleção de amostras dos laboratórios Merck, resultando na
identificação do derivado ácido N-benzil-indolilpropiônico (26b), o qual
apresentou melhor seletividade e potência do que (26a)56. Entretanto, (26b) foi
apenas moderadamente ativo in vivo, provavelmente devido à presença do grupo N-
benzila, que se constitui em sítio metabolicamente vulnéravel43. A maior
atividade PGHS-2 observada em (26b) foi racionalizada como resultante de
fatores conformacionais atribuídos à presença do grupo benzila, que ao se
projetar abaixo do plano do anel indólico introduz um maior volume estérico à
molécula do que aquele de (26a)56. O melhor substituinte eleito para o grupo
benzila foi o 4'-bromo e a remoção da metila no resíduo ácido carboxílico
produziu aumento na seletividade conduzindo ao composto (26c)56.
Modificação da extensão da cadeia ácido carboxílico em (26c) originou os
derivados ácido n-propanóico (26d) e n-butanóico (26e), que se mostraram
inibidores potentes de PGHS-2, com elevada seletividade56. O derivado homologo
ácido n-pentanóico correspondente mostrou-se inativo para ambas as enzimas56.
Apesar de (26d) ser mais potente do que (26e) nos ensaios in vitro, este
composto apresentou fraco perfil terapêutico in vivo, devido, provavelmente, à
sua rápida eliminação por metabolismo de b-oxidação43 da cadeia ácida56. O
mesmo pode ocorrer com o derivado (26e), o qual pode ser considerado como pró-
fármaco de (26c)63.
Introduzindo um grupo alquila na cadeia ácido carboxílico de (26d), afim de
bloquear por impedimento estérico esta rota metabólica, foram obtidos vários
novos derivados ácidos n-propiônicos e n-butanóicos56. Entre estes, o composto
(26f) (L-761,000) foi o que apresentou melhor perfil antiinflamatório in vitroe
in vivo, sendo ativo por via oral e com alto nível de tolerância
gastrintestinal56. As atividades in vitro do enanciômero-(R) (L-761,066) e do
enantiômero-(S) (L-761,065) são comparáveis ao racemato (L-761,000)57. Porém,
(L-761,066) foi mais potente possuindo ED50 de 0,4 mg/kg no teste de edema de
pata de rato (ED50 > 3 mg/kg para L-761,065)57. A diferença de atividade in
vivo tem origem, provavelmente, no melhor perfil farmacocinético (em ratos) de
L-761,066, Cmáx de 24,3 µM (14,4 µM para L-761,065) e clearance de 2,8 mL/kg/
min (21 mL/kg/min para L-761,065)57. Estes resultados indicaram que a
estratégia de modular a atividade de NSAI's-clássicos através de modificações
moleculares adequadas representa estratégia de sucesso com a obtenção de novos
inibidores seletivos de PGHS-256.
A modificação do anel tiofênico de Dup 697 (12) pelo sistema bicíclico imidazo
[2.1-b]tiazola levou a uma nova classe de compostos58. Nesta nova série, o
derivado (27) (L-766,112) foi o que apresentou o melhor perfil antiiflamatório
devido à sua alta potência e seletividade frente a PGHS-258. Entretanto, com o
estudo do metabolismo de (27) observou-se que o maior metabólito formado era
uma espécie S-óxido, a qual é aceptor de Michael potente, que pode ligar-se a
proteínas, ocasionando efeitos tóxicos graves59. Desta forma, buscou-se novo
análogo de (27) que mantivesse a desejada seletividade com idêntica potência,
mas com distinto perfil metabólico. A substituição do sistema imidazo[2.1-
b]tiazola pelo sistema tiazolo[3,2-b]triazola forneceu compostos (28a a 28q;
Tabela_4) altamente potentes frente a PGHS-260. Adicionalmente, derivados com
R1 igual a H, metila ou vinila apresentaram boa seletividade, que é perdida
quando R1 é trifluorometila, etila e isopropila. A redução da seletividade
também foi observada quando R2 é 3',5'-diflúor ou 3'-metoxi60. O derivado (28a)
(L-768,277) apresentou a menor IC50 para hPGHS-2 e excelente atividade in vivo
(ED50 de 1,7 mg/kg no teste de edema de pata de rato). Este derivado apresentou
também boas propriedades farmacocinéticas e metabólicas60.
DIFERENÇAS ESTRUTURAIS E DE LIGAÇÃO COM AGENTES NSAI'S NO SÍTIO CICLOXIGENASE
DE PGHS-1 E PGHS-2.
Assim como inicialmente identificado na estrutura da PGHS-1 ovina62 (Figura_1),
o monômero da PGHS-2 humana63 é constituído por três domínios: o domínio do
fator de crescimento epidérmico (EGF), localizado na região N-terminal, o
domínio de ligação à membrana (MBD) e o domínio catalítico na região C-
terminal. Este último, o maior deles, contém os sítios peroxidase e
cicloxigenase. O sítio ativo cicloxigenase, tanto na PGHS-1 como na PGHS-2,
está localizado em um canal hidrofóbico longo e estreito que se estende em
direção ao centro do principal domínio globular enzimático66-68.
A sobreposição dos núcleos dos domínios catalíticos da PGHS-1 ovina e da PGHS-
2 humana mostra média da raiz quadrada (rms) de 0,4 Å, indicando que eles são
praticamente idênticos. Alguns resíduos no domínio catalítico, considerados
importantes para a atividade enzimática na PGHS-1, tal como Tyr385 no sítio
cicloxigenase e a Gln203 no sítio peroxidase, são bem conservados na PGHS-2. O
MBD é aquele que possui menor conservação (cerca de 33%), embora haja boa
correlação em relação às suas estruturas secundárias e terciárias, uma vez que
foi observada experimentalmente uma rms de 0,7 Å na sobreposição de todos os
átomos do esqueleto protéico62.
Estudos baseados em cristalografia de raios-X, publicados recentemente,
demonstram a importância dos resíduos Arg120 e Tyr355 na ligação de NSAIDs
clássicos ao sítio ativo cicloxigenase da PGHS-129-30, 64-65.
A maioria dos NSAIDs já estudados bloqueia o acesso do araquidonato ao sítio
ativo por ligar-se à região superior deste, próximo ao resíduo Tyr385,
preenchendo todo o canal. Foi proposto que o araquidonato penetra no canal
cicloxigenase em conformação dobrada que permite que o seu grupo carboxilato
interaja com a Arg12030. A maioria dos NSAIDs, e.g. o flurbiprofeno (3) e a
indometacina (6), possuindo um grupo carboxilato livre, interage por ligação
iônica com um dos nitrogênios guanidínicos presentes na Arg120 em analogia ao
proposto para o araquidonato, resultando na inibição competitiva.
Adicionalmente, foi observada interação por ligação de hidrogênio entre um dos
oxigênios do grupamento carboxilato do flurbiprofeno (3) e a hidroxila fenólica
presente no resíduo Tyr35530 (Figura_2), que contribui para que a cavidade
inferior do sítio cicloxigenase (delimitado por Arg120 e Tyr355) adote,
preferencialmente, conformação fechada26,63. Além disso, demonstrou-se por meio
da mutagênese da Tyr355 para Phe355 que este resíduo é importante para a
seletividade da enzima PGHS-1 na ligação seletiva dos (S)-eutômeros da classe
dos profenos, e.g. flurbiprofeno (3)30,62.
A análise do complexo da PGHS-2 de camundongos com (3), efetuada a partir de
técnicas de substituição molecular utilizando dados de cristalografia de raios
X da PGHS-168, mostrou que este agente NSAI interage com os resíduos de
aminoácidos no sítio cicloxigenase de maneira idêntica à observada para a PGHS-
1, devido à grande conservação estrutural mencionada64.
Estudos realizados com o complexo do ácido 5-bromo-acetilsalicílico (29) e a
PGHS-1 demonstraram que o grupo acetila é transferido à Ser530 bloqueando o
acesso do araquidonato ao sítio cicloxigenase26. A PGHS-2 também sofre
acetilação no resíduo de Ser516, mas, provavelmente, devido à maior largura do
canal cicloxigenase nesta isoforma, a sua ação oxidativa é parcialmente
mantida, formando outro produto que foi identificado como o ácido 15-hidroxi-5-
cis-8-cis-11-cis-13-trans-eicosatetraenôico, 15(R)-HETE66,67. Estes dados
indicam a maior capacidade oxidativa da PGHS-263,68.
De uma maneira geral, cabe ressaltar que a estrutura da PGHS-1 complexada com
inibidores de diferentes classes tem significativa similaridade conformacional
e estabilidade em ambientes de temperatura e pH extremos62. A partir desta
observação, Meade e colaboradores55 propuseram que a ligação dos inibidores à
PGHS-1 produz mudanças conformacionais capazes de introduzirem rigidez na
estrutura protéica. Esses dados levaram alguns autores a supor que, ou as
alterações conformacionais sofridas pela enzima são realmente muito semelhantes
para as várias classes de inibidores, ou as mudanças são conformacionalmente
sutis e de difícil observação pelas técnicas atualmente disponíveis26,63.
As observações feitas a partir das interações dos inibidores não-seletivos com
o sítio cicloxigenase não permitiu esclarecer a seletividade que certos
compostos apresentam para a PGHS-2. Análise cuidadosa das vizinhanças
estruturais ao sítio cicloxigenase da PGHS-2 revelou que os únicos resíduos de
aminoácidos distintos da PGHS-1 são a Ile523 e a His513, que estão na PGHS-
2 substituídos por Val523 e Arg513.*
Estudos de mutagênese e modelagem molecular da PGHS-2 demonstraram a
importância desses resíduos na seletividade de alguns inibidores, capazes de
modificarem, principalmente, a formação do complexo mais estável característico
do mecanismo de ação dependente do tempo68,69. Adicionalmente, verificou-se a
existência de uma segunda cavidade hidrofóbica, além do canal cicloxigenase na
PGHS-2, que contribui para o aumento da sua extensão63. Na PGHS-2 a Val523 está
localizada exatamente na entrada dessa cavidade. O canal cicloxigenase central
da PGHS-2 (sítio de ligação dos NSAI's) também é mais largo. Na PGHS-1, devido
ao maior volume da Ile523, essa cavidade está mais restrita estéricamente o
que, provavelmente, impede o acesso de certos inibidores63,64. Essas diferenças
estruturais e estéricas parecem ser as prováveis razões da seletividade,
observada em alguns inibidores. Por exemplo, estudos da interação do derivado
pirazólico SC-558 (30), inibidor seletivo da PGHS-2 (S = 1903) pertencente à
classe dos 1,2-difenileterociclícos, evidenciaram que o grupamento 4'-
sulfonamida atinge o canal cicloxigenase do sítio ativo explorando a cavidade
maior PGHS-2 (Figura_3)64.
Observou-se, ainda, que os átomos de oxigênio deste grupamento interagem por
meio de ligação de hidrogênio com os resíduos His90 e Arg513, enquanto que o
átomo de nitrogênio sulfonamídico forma ligação de hidrogênio com o oxigênio
carbonílico da Phe518. A comparação entre a ligação de (30) e aquela do
flurbiprofeno (3) à PGHS-2 permitiu evidenciar que os resíduos aromáticos 4'-
bromofenila e pirazola de (30) se sobrepõem, respectivamente, ao anel fenila
distal e ao anel fluorofenila de (3). O substituinte CF3 do SC-558 (30) e o
carboxilato do flurbiprofeno (3) se ligam à mesma cavidade30,64.
Em estudo sobre a interação da PGHS-2 com dois inibidores potentes e seletivos,
a saber, o derivado pirrólico análogo à tolmetina RS104897 (31) e o derivado
piridazinônico RS57067 (32)62 foi observado o modo de ligação de (31) ao sítio
ativo da PGHS-2 e comparado com aquele relativo à interação do flurbiprofeno
(3) com a PGHS-1. Foi possível evidenciar que estes compostos ocupam
basicamente o mesmo ambiente no sítio ativo30,62. O resíduo 4-clorobenzoíla de
(31) parece interagir com a Tyr385 em analogia à interação feita por um dos
anéis aromáticos de (3) e o átomo de oxigênio carbonílico do grupamento
benzoíla distante 3,2 Å da hidroxila da Ser530, interage através de ligações de
hidrogênio65. A Arg120 e a Tyr355 também interagem, respectivamente, com o
nitrogênio e o oxigênio do grupo acil-sulfonamida de (31) de maneira análoga à
do carboxilato presente na maioria dos NSAIDs clássicos29-30,65. Um dado
interessante a destacar, resultado destes estudos, diz respeito à conformação
fechada resultante da interação de (31) com a enzima, semelhante àquela
mencionada para os complexos de NSAIDs com a PGHS-126,63. O Glu524 interage com
Arg120, tanto na PGHS-1 como na PGHS-2. Ao nível do sítio cicloxigenase da
PGHS-2 detectou-se que a Arg120, a Tyr355 e o Glu524 participam de uma rede de
ligações63,64. Essas observações reforçam a tese de que mudanças dinâmicas
sutis, resultantes das interações com os inibidores, possam estar ocorrendo no
sítio enzimático. Entretanto, os dados disponíveis até o momento não permitem
que seja possível determinar-se as diferentes contribuições farmacofóricas
responsáveis pela seletividade observada em certos inibidores de PGHS-226.
A partir da análise do complexo de (32) com o sítio cicloxigenase da PGHS-2 foi
aventada a hipótese de que existam conformações alternadas neste sítio causadas
pela ligação com este inibidor. Evidenciou-se, ainda, a preferência deste sítio
para conformação aberta, na qual a Arg120 não mais participa da rede de
ligações de hidrogênio que define o sítio ativo. Isto ocorre devido à presença
da unidade piridazinônica de (32), que interage através de ligações de
hidrogênio com os átomos de oxigênio carbonílicos do resíduo Glu524, deslocando
a Arg120 e gerando modificações conformacionais detectáveis numa região da
proteína que está ligada ao MBD. Estas mudanças conformacionais no fundo do
canal não parecem provocar alterações significativas no restante da estrutura
do sítio cicloxigenase, uma vez que se observou rms de 0,6 Å na sobreposição
dos átomos do backbone das conformações aberta (complexada com 32) e fechada
(complexada com 31) e a PGHS-264.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
A descoberta da PGHS-2 como isoforma induzida da PGHS permitiu nova abordagem
terapêutica para o tratamento de quadros inflamatórios70. Conseqüentemente,
várias classes de compostos bioativos na inflamação, sem os efeitos gastro-
irritantes mecanismo-dependentes dos agentes NSAI's-clássicos, foram
descobertos, representando novas entidades químicas úteis para tratamento de
doenças inflamatórias crônicas que atingem ca. 1% da população mundial70.
Recentemente, foi descrito o meloxicam (33), comercializado no Brasil sob o
nome Movatec,, como promissor agente antiinflamatório seletivo para PGHS-
271,72,73.
O LASSBio tem dado sua contribuição nesta área, desenvolvendo estudos sobre o
planejamento e a síntese de novos candidatos à protótipo de inibidores
seletivos de PGHS-2, tendo recentemente descoberto os compostos (34) e (35)74,
sintetizados a partir do safrol (36) (Esquema 3), principal componente químico
do óleo de sassafrás, e a nova série de derivados (37)75 .
Vimos, ainda, desenvolvendo no LASSBio, com a colaboração do Prof. Alencastro
do Instítuto de Química da UFRJ, estudos de modelagem molecular76 com
inibidores seletivos descritos na literatura, que têm subsidiado o planejamento
estrutural de novos compostos candidatos a protótipos de inibidores seletivos
de PGHS-2, cujas respectivas sínteses77, são objeto de estudos em nosso
laboratório, no momento.
Pelo exposto, pode-se concluir que, apesar de ser estratégia terapêutica
recente (ca. de seis anos) para o tratamento da inflamação, a busca de novos
protótipos de inibidores seletivos de PGHS-2, objeto de inúmeros relatos na
literatura, representa nova estratégia terapêutica para a descoberta racional,
pelos Químicos Medicinais, de novos agentes antiiflamatórios não esteróides
seletivos e mais seguros26,27. Os estudos de modelagem molecular e
"docking" de inibidores seletivos da PGHS-2 com o sítio cicloxigenase
da enzima humana78, embora ainda emergentes, deverão ajudar a esclarecer os
fatores estruturais responsáveis pela seletividade observada em determinados
compostos para esta isoforma enzimática e fornecer os subsídios necessários ao
desenvolvimento de novos antiinflamatórios mais potentes, seletivos e seguros.
NOTA ADICIONADA NAS PROVAS
Durante a publicação deste trabalho foi descrita uma revisão sobre inibidores
seletivos de COX-2, veja: Prasit, P.; Riendeau, D.; Ann. Rept. Med. Chem.1997,
32, 211.
