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Síntese do anti-helmíntico praziquantel,a partir da glicina

INTRODUÇÃO O praziquantel (1) é um anti-helmíntico utilizado no tratamento da esquistossomose, parasitose de grande importância médica e socio-econômica ao Brasil.

A esquistossomose é, atualmente, endêmica em setenta e seis países, ocorrendo principalmente na Ásia, na África, na América do Sul e no Oriente Médio, infestando cerca de duzentos milhões de pessoas, e, ainda, seiscentos milhões correm o risco de contraí-la1.

Esta parasitose teve origem nas bacias de dois importantes rios: o Nilo e o Yangtse. Os ovos do gênero Shistosoma, agente etiológico da esquistossomose, já foram encontrados nas vísceras de múmias egípcias1,2. Esta helmintose espalhou- se por todo o continente africano e, através do tráfico de escravos, foi trazida para as Américas. Entretanto, apenas o S. mansoni aqui se fixou, seguramente pelo encontro de bons hospedeiros intermediários e de condições ambientais semelhantes às da região de orígem3,4.

A esquistossomose penetrou no Brasil em meados do século XVI, disseminando-se a partir de 1920, com o início das migrações internas. Atualmente, o Brasil é considerado uma das principais áreas de distribuição da doença no mundo, não somente devido à vastidão de sua zona endêmica e à existência de grande número de pacientes portadores de formas graves da doença, mas também pela expansão desta endemia para outras áreas do país, até então indenes5,6.

A transmissão da esquistossomose no Brasil é ativa em 16 estados, atingindo principalmente a região compreendida entre a Paraíba, a Bahia e Minas Gerais, infestando cerca de 10 milhões de brasileiros, incluindo as regiões endêmicas e focos isolados4.

O tratamento medicamentoso da esquistossomose sempre foi limitado, pela dificuldade de serem encontrados quimioterápicos que exibissem alta eficácia e grande tolerabilidade4,5. No início, foram utilizados o tartarato de potássio e antimônio, tártaro emético, introduzido em 1918, seguido pelo dimercaptossuccinato de sódio e antimônio e o di-(pirocatecol-2,4-dissulfonato) de sódio e antimônio, conhecido como estibofeno6,7. Os derivados antimoniais, apesar de atuarem com eficácia contra as três principais espécies do gênero Shistosoma, o S. mansoni, o S. haematobium e o S. japonicum, deixaram de ser usados no tratamento desta helmintose, por ocasionarem inúmeros efeitos colaterais, como a trombocitopenia e outras discrasias sanguíneas6.

Posteriormente, foram utilizados o cloridrato de 1-N-b-dietil-amino-etil-amino- 4-metil-9-tioxantona, a lucantona, e seu metabólito principal, o 1-N-b-dietil- amino-etil-amino-4-(hidroximetil)-9-tioxantona, a hicantona, que são eficazes, especificamente, contra o S. mansoni e o S. haematobiume também o fármaco 1-(5- nitro-2-tiazolil)imidazolidina-2-ona, o niridazol, eficaz contra o S.

haematobium e o S. japonicum7.Estes fármacos não são mais utilizados na terapia medicamentosa da esquistossomose, por apresentarem reações adversas, tais como lesões hepáticas e renais, convulsões, psicoses, alucinações visuais e auditivas, estados confusionais e outros efeitos indesejáveis sobre o sistema nervoso central2,6.

Atualmente, são utilizados no tratamento, os fármacos (±)-2ciclo-hexilcarbonil- 1,2,3,6,7,11b-hexa-hidro-4H-pirazino[2,1 -a]isoquinolin-4-ona, praziquantel, e o 6-hidroximetil-2-isopropilaminometil-7-nitro-1,2,3,4-tetra-hidroquinolina, oxamniquina5,6.

O praziquantel age, com eficácia, contra outros trematódeos e alguns cestódeos, exibindo atividade farmacológica muito superior à da oxamniquina8, que age somente contra oS. mansoni e, preferencialmente, sobre os machos adultos9-12.

Em pesquisa conjunta, realizada pelas indústrias E. Merk e Bayer A.G.4,5, em 1972, selecionou-se o praziquantel, por exibir baixa toxicidade, maior eficácia e tolerabilidade entre outros compostos análogos testados.

O praziquantel tem sido estudado experimentalmente em animais desde 1975, mostrando-se altamente eficaz contra infestações de várias espécies de trematódeos e cestódeos, principalmente: S. mansoni13,14, S. haematobium15, S.

japonicum7, S. intercalatum7, S. matheei7, S. bovis7, Taenia solium7, Taenia saginata7, Hymenolepis nana7, Hymenolepis diminuta16 e Diphyllobothrium latum7, Cysticercus boviseCysticercus cellulosae7,Echinochasmus fujianensis17, Opisthorchis viverrini18, atuando contra os vermes maduros, imaturos e na fase larval dos cestódeos.

A ação anti-helmíntica do praziquantel deve-se provavelmente à inibição da bomba Na+, K+ dos esquistossomos, aumentando a permeabilidade da membrana do helminto a certos cátions monovalentes e divalentes, principalmente o cálcio que leva à intensificação da atividade muscular, seguida por contração e paralisia espática. Como consequência, os helmintos se separam dos tecidos do hospedeiro e são rapidamente deslocados das veias mesentéricas para o fígado, ao passo que os helmintos intestinais são expelidos19.

SÍNTESES DESCRITAS DO (±)-2 CICLOEXILCARBONIL-1,2,3,6,7,11B-HEXA-HIDRO-4H - PIRAZINO[2,1-A]ISOQUINOLIN-4-ONA: PRAZIQUANTEL (1) Na literatura existem poucas rotas sintéticas descritas para a preparação do praziquantel (1), sendo que a maioria foi desenvolvida e patenteada20-28por indústrias farmacêuticas. As seqüências sintéticas patenteadas foram publicadas apenas em parte e, em sua maioria, referem-se à preparação de outros derivados do praziquantel que possuem o sistema pirazino[2,1-a]isoquinolínico substituído em diferentes posições.

A primeira síntese total do anti-helmíntico 1, patenteada pelos grupos Merck e Bayer, foi realizada por Seubert23, em 1972 (Esquema 1).

Entretanto, o intermediário 4 já havia sido preparado, em 1939, através da Reação de Reissert29 ,seguida de redução a alta pressão e elevada temperatura.

A acilação de 4, com cloreto de cloroacetila, forneceu o composto 5, que, após ciclização em presença de bases fortes, produziu 1 e 1a. Porém, esta estratégia foi modificada porque a reação de Reissert foi reprodutível apenas com número limitado de cloretos de ácido30,31, obtendo-se quantidade reduzida de derivados contendo o sistema pirazino[2,1-a]isoquinolínico, os quais são importantes por exibirem atividade anti-helmíntica.

Os principais trabalhos, descritos nas outras patentes dos grupos Merck e Bayer, utilizaram os intermediários chaves 6 a 927,28.

A conversão de 6a no praziquantel (1), via o aminoácido 6b e o composto tricíclico oxo-hidropirazino-isoquinolina 7, foi relatada como sendo de importância prática20, possivelmente devido à viabilidade industrial do processo.

As sínteses do praziquantel (1) partindo-se do 3-hidroxi-5-fenilpirazina, via a diamida 8 ou, ainda, utilizando-se, como matéria-prima, a dioxopiperazina 9, envolvendo a ciclização de Bischler-Napieralski, são apenas de interesse acadêmico20.

A resolução óptica e o estudo de dicroísmo circular permitiu afirmar5,28 que a atividade anti-helmíntica do praziquantel e também do seu análogo N-benzoila, deve-se principalmente ao enantiômero (R)-(-), de configuração absoluta ainda desconhecida (Tabela_1).

As N-acilamino tetraidroisoquinolinas (6a e 6c) podem ser resolvidas em seus isômeros ópticos, antes da acilação com cloreto de cloroacetila e ciclização com bases fortes, obtendo-se o praziquantel e seus análogos opticamente ativos.

Alternativamente, este objetivo foi atingido utilizando-se como etapa chave, a resolução óptica da amina tricíclica 7, junto com procedimento de reciclagem do enantiômero com a estereoquímica indesejada (7b), descrita em patente por Seubert (1975) (Esquema 2)28. Este processo foi alcançado após a acilação com cloreto de benzoíla, desidrogenação com enxofre e redução catalítica do intermediário desidro derivado 10, sem citação do rendimento obtido.

Em 1983, Frehel & Maffrand 32 desenvolveram duas rotas sintéticas para a obtenção do praziquantel. Na primeira utilizaram como etapa chave a redução seletiva33,34 da função imida da piperazina-2,6-diona 16, produzindo a hidroximida 17 que, seguida por ciclização em meio ácido, forneceu 1 com alto rendimento (Esquema 3).

Em um segundo caminho sintético, Frehel & Maffrand 32 utilizaram, como matérias-primas, a 4-acetil e a 4-benzoil piperazina-2,6-diona (18a e 18b) na preparação dos intermediários tricíclicos 21a e 21b. Após a retirada dos grupos acetila em 21a e benzoila em 21b, foi obtido o composto 7, facilmente acilável e que, em presença do cloreto do ácido cicloexanocarboxílico, forneceu 1 com rendimento global menor do que o obtido no processo anterior (Esquema 4).

Uma outra preparação sintética interessante foi realizada por Berkowitz & John, em 198435(Esquema 5).

Os autores utilizaram como reagente de partida o cianobenzociclobuteno36 (22), que, após redução catalítica com Níquel de Raney, forneceu a amina 23. A alquilação de 23 com cloroacetamida originou 24. A neutralização de 24, seguida pela reação com o ácido cicloexanocarboxílico em presença de DCC, produziu a diamida 26. A reação entre 26, paraformaldeído e anidrido acético produziu a acetoximetildiamida 27, que, tratada com metanol e carbonato de potássio, forneceu a metoximetildiamida 28. Após a pirólise de 28, foi obtido o composto 1.

Um outro método encontrado na literatura foi descrito por Yuste & colaboradores37 (Esquema 6).

A estratégia básica, utilizada na construção da estrutura tricíclica, foi a redução seletiva da função imida na piperazina-2,6-diona 30, seguida pela ciclização de 31 em meio ácido, que é o mesmo procedimento adotado por Frehel & Maffrand32. Todavia, a rota desenvolvida por Yuste & colaboradores37 envolveu caminho sintético menor na preparação do composto 1-fenetilpiperazina- 2,6-diona 31, que foi obtido após a ciclização do ácido N-benziliminodiacético (29) com a fenetilamina, que são compostos disponíveis comercialmente.

A amina 7 foi obtida pela hidrogenólise de 32, em metanol e ácido clorídrico aquoso usando paládio como catalizador. A acilação de 7, com o cloreto do ácido cicloexanocarboxílico, forneceu o praziquantel (1).

SÍNTESE DO PRAZIQUANTEL, A PARTIR DA GLICINA Visando à obtenção do (±)-2-cicloexilcarbonil-1,2,3,6,7,11b-hexa-hidro-4H- pirazino[2,1-a]isoquinolin-4-ona, praziquantel (1), foi realizado o estudo de uma rota sintética simples utilizando como matéria-prima o aminoetanoato de etila (2), disponível comercialmente e de baixo custo38.

No Esquema7 apresenta-se a análise retrossintética para a obtenção de 1. No esquema sintético proposto, a etapa chave seria a ciclização Pictet-Spengler entre o "synthon" 5 e a fenetilamina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Realizou-se, inicialmente, a síntese do intermediário N-alil éster 4 (Esquema 8). A matéria-prima 2 foi alquilada com brometo de alila, fornecendo o produto desejado 3 com 75% de rendimento, após purificação por cromatografia rápida (flash chromatography). O amino éster 3 mostrou-se relativamente instável à temperatura ambiente, detectando-se sua decomposição por cromatografia de camada delgada (CCD) após dois dias.

O amino éster 3 foi acilado com o cloreto do ácido cicloexanocarboxílico39,40, fornecendo o N-alil éster 4 com 80% de rendimento após a purificação por cromatografia rápida.

A clivagem do N-alil éster 4 foi realizada com ozônio, sob condições redutivas (Esquema 9), fornecendo o aldeido éster 5 com 72% de rendimento, após purificação por cromatografia rápida.

Tendo preparado e caracterizado o intermediário chave 5, foram iniciados os estudos da reação Pictet-Spengler visando à formação do sistema tetraidroisoquinolínico.

Trabalhos anteriores41,42indicam que no provável mecanismo da condensação ocorre inicialmente a formação da imina 7, via o intermediário amino álcool 6, seguido pelo ataque eletrofílico ao anel aromático fornecendo o sistema tetraidroisoquinolínico (9). O fechamento do sistema pirazino por lactamização da substância 9 fornece o praziquantel (1) (Esquema 10).

Considerando-se que a ativação do carbono da carbonila do aldeído, bem como a nucleofilicidade da função amino da fenetilamina depende do pH do meio37,42,43,foram estudados inicialmente os fatores que, adequadamente combinados, poderiam favorecer a ciclização.

Foi realizada a condensação utilizando o aldeído éster 5 e fenetilamina, em quantidade equimolar, em presença de ácido acético glacial (Esquema 11).

Após várias horas de reação, três produtos foram isolados. Os espectros de IV e do RMN1H de um dos produtos purificados, obtido com rendimento de 12%, mostraram-se idênticos aos espectros do praziquantel padrão e aos dados obtidos na literatura37, descritos na parte experimental.

Com o objetivo de melhorar o rendimento obtido inicialmente na etapa da condensação, foram investigadas outras condições experimentais visando à condensação Pictet-Spengler, com modificação nas variáveis reacionais: solvente (ácido acético aquoso42, metanol, acetato de sódio/ácido acético), temperatura (ambiente,60 0C, refluxo), catalizador (ácido clorídrico 37%, p-TsOH), porém sem sucesso. Verificou-se em quase todas as tentativas realizadas, que o produto bruto apresentou inúmeras manchas na CCD, levando à purificação laboriosa e a um baixo rendimento do produto 1. O aldeído éster 5, quando submetido a condições ácidas e a elevadas temperaturas do meio reacional, sofria decomposição e polimerização, dando origem a misturas de difícil caracterização.

PARTE EXPERIMENTAL Procedimentos experimentais gerais: todos os solventes e reagentes utilizados em nosso trabalho foram purificados pelos métodos usuais44,45.

As reações foram realizadas sob atmosfera inerte (nitrogênio ou argônio) e agitação magnética, com exceção da reação de ozonólise. Os solventes foram removidos no evaporador rotatório.

O desenvolvimento das reações químicas foi verificado por CCD, utilizando-se placas de sílica-gel G (E. Merck) ou alumina básica (WB2, Sigma) e como eluentes: n-hexano/acetona, n-hexano/acetato de etila em proporções variadas e éter etílico. Como revelador, foram utilizados vapores de iodo.

Os produtos foram purificados por cromatografia rápida, utilizando-se como adsorvente sílica-gel 60 (230-400 mesh - E. Merck), ou por cromatografia em coluna, utilizando-se alumina básica (WB2, Sigma) e como eluente os mesmos solventes empregados em CCD.

Os pontos de fusão, não corrigidos, foram determinados no bloco de Köfler.

Os espectros de RMN1H foram registrados no espectrômetro Varian EM 390, 90 MHz.

Os deslocamentos químicos (d) são expressos em parte por milhão (ppm) usando tetrametilsilano (TMS) como padrão interno e deuteroclorofórmio (CDCl3) como solvente. Cada valor de (d) foi seguido de parênteses, onde foi definida a multiplicidade (s-singleto, d-dupleto, t-tripleto, q-quarteto, m-multipleto), o número de hidrogênios deduzidos da integração e o tipo de hidrogênio.

Os espectros de IV foram registrados nos espectrômetros Perkin-Elmer 283B ou Nicolet 5ZDX-FT. As absorções máximas foram registradas em número de onda (cm- 1).

Os espectros de massa de baixa resolução foram realizados no espectrômetro de massa VGMM 12F. Foi usado potencial de ionização de 70 ev e as principais fragmentações foram expressas como porcentagens da intensidade do pico base (100%).

Liberação do aminoetanoato de etila (2), a partir do cloridrato À solução do cloridrato do aminoetanoato de etila (2,48g; 17,7mmol) em DME (50ml), contendo 3% de água, adicionou-se trietilamina (2,7ml; 1,79g; 17,7mmol) à temperatura ambiente, permanecendo sob agitação durante oito horas. A mistura reacional foi filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida, fornecendo 2 (1,55g; 15mmol; 85%).

Preparação do N-(alil)aminoetanoato de etila (3) À solução do aminoetanoato de etila (2) (2,47 g; 24mmol) em dimetoxietano (DME) (40 ml), resfriado a 0oC, adicionou-se, gota a gota, durante 55 minutos, solução do brometo de alila (0,4 ml; 0,31 g; 4,8 mmol) em DME (10 ml). A mistura reacional permaneceu sob agitação durante a noite, permitindo que chegasse lentamente à temperatura ambiente. Em seguida, foi filtrada e o solvente, removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de cromatografia rápida (SiO2 desativada com 20% de água / éter etílico) e recromatografado (SiO2, n-hexano/acetato de etila 4:2), fornecendo o composto 3 (0,49g; 3,4mmol; 75%) como um óleo alaranjado. Uma amostra analítica foi obtida por destilação molecular (120 oC/0,3 mmHg), fornecendo um óleo incolor e homogêneo em CCD; IV (filme, cm-1): 3350 (-NH), 1740 (-CO2Et), 1644, 1020, 900 (H2C=CH-); RMN1H (CDCl3, d): 1,27 (t, J=7Hz, 3H, -CO2CH2CH3), 1,77 (s, 1H, -NH, troca-se com D2O), 3,16-3,33 (m, 2H, -CH2-CH=CH2), 3,36 (s, 2H,-CH2CO2Et), 4,17 (q, J=7Hz, 2H, -CO2CH2CH3-), 5,0-5,35 (m, 2H, -CH=CH2), 5,6-6,1 (m, 1H, - CH=CH2); EM(m/e): 143 (M+) e fragmentos principais 56, 70.

Preparação do N-alil-N-(cicloexilcarbonil)aminoetanoato de etila (4) À solução do amino éster 3 (0,45 g; 3,2 mmol) e trietilamina (0,4 ml; 0,32 g; 3,2 mmol) em DME (10 ml), adicionou-se, gota a gota, durante 15 minutos, solução do cloreto do ácido cicloexanocarboxílico39,40(0,4 ml; 0,47g; 3,2 mmol) em DME (5 ml), preparada previamente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente, durante a noite. Em seguida, foi filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em éter etílico (17 ml), lavado com solução de ácido clorídrico a 10% (1 x 5 ml), água (2 x 5 ml) e com solução saturada de cloreto de sódio (1 x 5 ml). A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto 4 (0,78 g; 95%) apresentou-se como um óleo viscoso e amarelo. Foi purificado por comatografia rápida (SiO2, n-hexano/éter etílico 7:3) e, posteriormente, por destilação molecular (120 oC/0,2 mmHg), fornecendo um óleo incolor e homogêneo por CCD (0,67 g; 2,6 mmol; 85%). IV (filme, cm-1): 1748 (- CO2Et), 1650 (-NCO-), 1000, 970 (H2C=CH-); RMN1H (CDCl3, d): 1,25 (t, J=7 Hz, 3H, -CO2CH2CH3), 1,43-2,1 (m, 10H, -C6H11), 2,1-2,7 (m, 1H, -C6H11), 4,0 (s,4H, -CH2CO2Et, -CH2-CH=CH2-), 4,13 (q, J=7 Hz, 2H, -CO2CH2CH3), 5,0-5,35 (m, 2H, - CH=CH2), 5,6-6,1 (m,1H,-CH=CH2); EM(m/e): 253 (M+) e fragmentos principais 55, 70, 83, 111, 142.

Preparação do N-(2-oxo-etil)-N-(cicloexilcarbonil) aminoetanoato de etila (5) Solução do N-alil éster 4 (0,12 g; 0,47 mmol) em diclorometano anidro (10ml), resfriada a 0 oC, foi submetida a excesso de ozônio. O ozonídeo resultante foi reduzido com excesso de dimetilsulfeto, sob agitação, durante a noite. O solvente e o reagente foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em éter etílico (20 ml), lavado com água (3 x 7 ml) e com solução saturada de cloreto de sódio (1 x 7 ml). A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto 5 (0,11 g; 91%) apresentou-se como um óleo amarelo claro e relativamente puro por CCD, podendo ser utilizado na próxima etapa sem posterior purificação. No entanto, uma amostra analítica foi preparada (0,08 g; 0,3 mmol; 72%) por cromatografia rápida (SiO2, n-hexano/acetato de etila 7:3). IV (filme, cm-1): 1741-1747 (- CO2Et e -CHO), 1632-1650 (-NCO-); RMN1H (CDCl3, d): 1,15-1,5 (2t sobrepostos, 3H, -CO2CH2CH3), 1,5-2,1 (m, 10H, -C6H11), 2,2-2,5 (m, 1H, -C6H11), 4,0-4,4 (sinais sobrepostos sobre q do -CO2CH2CH3, 6H,-CH2CHO, -CH2CO2Et), 9,33 e 9,77 (s cada, 1H, -CHO), mistura racêmica.

Condensação Pictet-Spengler41,43,46.

À solução do aldeido éster 5 (0,08 g; 0,3 mmol) em ácido acético glacial (3 ml) adicionou-se, gota a gota, a feniletilamina (4,1 ml; 3,95 g; 0,3 mmol). A mistura reacional foi refluxada, com agitação, durante 2 horas e 15 minutos, e o desenvolvimento da reação foi acompanhado por CCD. O solvente foi evaporado.

O resíduo obtido foi dissolvido em clorofórmio (15 ml), lavado com solução de ácido clorídrico a 10% (1 x 5 ml), água (1 x 5 ml), solução saturada de cloreto de sódio (1 x 5 ml), seco (Na2SO4) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto, um óleo marrom claro (0,09 g; 98%), foi purificado por cromatografia rápida (SiO2, n-hexano/acetato de etila 7:3), fornecendo 1 (0,012 g; 0,04mmol; 12%). Recristalização (n-hexano/acetato de etila) forneceu cristais, pf 132-134 oC, padrão pf 133-134 oC, pf misto: 129-131 oC, lit.31 pf 135-136 oC. I.V (filme, cm-1): 1650 (-CO); RMN1H (CDCl3, d): 0,9-2,25 (m, 10H, -C6H11), 2,3-3,46 (m, 5H, -C6H11, H-1, H-7, H-7' e H-6), 3,8-4,4 (m, 1H, H-3), 4,46-4,7 (m, 1H, H-3'), 4,7-5,1 (m, 2H, H-1'; H-11b), 5,13-5,5 (m, 1H, H-6'); 7,4 (s, 4H, -C6H4).

Os espectros de RMN1H e IV do produto sintetizado mostraram-se idênticos aos do padrão do praziquantel (racêmico).

CONCLUSÃO Neste trabalho foram descritas as sequências sintéticas utilizadas na preparação do anti-helmíntico praziquantel, fármaco de muitaimportância notratamento da esquistossomose e de outras parasitoses. Estas sínteses, em sua maioria, foram patenteadas por indústrias farmacêuticas, as quais descreveram as etapas sintéticas incompletas e com omissão dos rendimentos obtidos. A rota sintética proposta no presente trabalho, utilizando a glicina como matéria- prima, destaca-se pela simplicidade do método, embora careça de otimização do rendimento global. Como a esquistossomose é uma parasitose de grande importância socio-econômica por ser endêmica em países sub-desenvolvidos, torna-se desafio acadêmico o desenvolvimento de outros métodos sintéticos que sejam de execução simples e economicamente viáveis.