Peroxidase de gramínea de Cerrado como alternativa no tratamento
de efluentes agroindustriais
1. INTRODUÇÃO
Um dos grandes impactos ambientais no mundo é a destinação inadequada de efluentes
no meio ambiente. Efluentes não tratados promovem uma grave poluição hídrica, além de
transportarem diferentes tipos de vírus, bactérias e protozoários nocivos à saúde pública
(Mannarino et al., 2013). A partir dessa necessidade de tratamento, surgem diferentes
processos, sendo alguns mais eficientes, baratos e ambientalmente corretos para a degradação
de diversos compostos orgânicos.
As enzimas fazem parte desses processos e são reconhecidas como catalisadores
biológicos, apresentando características importantes, tais como a atuação em condições
amenas de reação, a alta especificidade, a biodegrabilidade e a alta eficiência catalítica.
Dentre as classes de enzimas, as oxidorredutases possuem um dos principais papeis na
degradação de compostos orgânicos, uma vez que catalisam reações de transferência de
elétrons e as peroxidases, subclasse de oxidorredutases, oxidam os diferentes compostos na
presença de peróxido de hidrogênio ou peróxidos orgânicos, gerando radicais livres (Chance e
Maehly, 1955).
Dentro do contexto de tratamento de efluentes, cabe às peroxidases um papel de
destaque, em função da sua capacidade em degradar substâncias tóxicas e persistentes.
Segundo Neves e Silva (2007), essas enzimas são amplamente encontradas em vegetais, e
estão ligadas à função fisiológica/bioquímica da planta. A maioria dos relatórios sobre a
desintoxicação de águas residuais contaminadas com fenóis, cresóis e fenóis clorados usou
peroxidase das raízes de Rábano Silvestre (Armoracia rusticana), na forma purificada com a
denominação de HRP (Horseradish Peroxidase). Recentemente, peroxidases de outras fontes,
como melão-de-são-caetano (Momordica charantia L.), nabo (Brassica rapa L.) e copaíba
(Copaifera langsdorffii Desf.) foram sugeridas como alternativas a HRP (Akhtar e Husain,
2006; Maciel et al., 2006). Características deste processo, tais como o efeito do pH,
concentração do substrato, tempo de reação e os efeitos de alguns aditivos tem sido estudados
para otimizar as condições de reação (Hamid e Khalil-Ur-Rehman, 2009).
Dentre a diversidade de espécies existentes e com potencial para extração enzimática,
temos a vegetação do Cerrado, o segundo maior bioma brasileiro, com mais de 6000 espécies
distribuídas em sua região principal de ocorrência, o Planalto Central brasileiro (Ratter et al.,
1997).
Estudos florísticos e fitossociológicos que analisaram o componente herbáceo do Cerrado
encontraram um predomínio da família Poaceae, principalmente dos gêneros Andropogon,
Axonopus, Paspalum, Echinolaena e Trachypogon. A espécie Echinolaena inflexa (Poir.)
Chase, é uma gramínea nativa, amplamente distribuída e com alta produção de biomassa
(Munhoz e Felfili, 2007). Embora essas espécies venham sendo utilizadas para vários fins,
tais como medicinal e alimentar, ainda há necessidade de maiores estudos viabilizando outras
formas de aproveitamento de seus espécimes.
No presente trabalho foram produzidos extratos de Echinolaena inflexa a fim de
encontrar atividade de peroxidase termoestável, uma vez que essas plantas ficam expostas a
longos períodos sob o sol. Avaliou-se a aplicação das enzimas obtidas nesses extratos, na
degradação de diferentes compostos fenólicos, como proposta no tratamento de efluentes
agroindustriais.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Extração e avaliação da atividade de peroxidase de E. inflexa
A gramínea E. inflexa foi coletada na trilha do Tatu, no Campus Dr. Henrique Santillo da
Universidade Estadual de Goiás, localizado no município de Anápolis, estado de Goiás-Brasil,
16º22'53,6'' de latitude Sul e 48º56’41,9”de longitude Oeste.
A parte selecionada para estudo foi composta dos frutos de Echinolaena inflexa, que
foram coletados e triturados em moinho tipo martelo (TE-330 Tecnal), resultando em uma
farinha que foi utilizada nos experimentos. A farinha foi embalada e estocada em recipientes
de polipropileno a -10°C.
A obtenção dos extratos brutos foi avaliada de acordo com um planejamento fatorial 23 .
Foram avaliados os parâmetros tempo de extração (30-90 min) e o pH de extração. Os
extratos foram obtidos utilizando diferentes tampões: pH 6,0 - 8,0 fosfato de sódio 0,1 mol L-1
e pH 9,0 borato de sódio 0,1 mol L-1 . Para o preparo dos extratos, 10 mL de tampão foram
misturados a 0,5 g de farinha (Echinolaena inflexa), agitados (tempo de extração) e depois
centrifugados (5000 rpm) por 15 min. Aquele tratamento, determinado pela combinação dos
dois parâmetros, que demonstrou melhor desempenho na extração das enzimas estudadas foi
selecionado para o preparo dos extratos utilizados ao longo deste trabalho.
Foram avaliados os parâmetros cinéticos pH e temperatura de reação, obedecendo a um
planejamento fatorial 24. O pH ótimo de reação foi avaliado pela incubação das amostras de
extrato com soluções com pH diferentes. Em pH 5,0 foi utilizado o tampão acetato de sódio
0,1 mol L-1; entre o pH 6,0 e 8,0 o tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1. A temperatura ótima
foi determinada pela variação da temperatura do ensaio de atividade enzimática, entre 30 e
60oC, em intervalos de 10ºC, em banho-maria.
O tempo de reação com os substratos foi testado pelo acompanhamento da formação de
produto por unidade de tempo, após a determinação dos parâmetros ótimos de extração e
reação. A atividade de peroxidase das amostras foi medida mediante a variação dos seguintes
intervalos de tempo: uma medida por minuto, entre 1 a 5 min; uma medida a cada 5 min, entre
5 e 20 min; uma medida a cada 10 min, entre 20 e 30 min e medidas a cada 30 min, entre 30 e
60min.
A análise do perfil enzimático foi realizada considerando-se a atividade de peroxidase.
Esse ensaios foram efetuados de acordo com a metodologia de Halpin et al. (1989) utilizando
pirogalol e peróxido de hidrogênio como substratos. Os resultados foram avaliados por
medida espectrofotométrica a 420 nm e a leitura da atividade foi feita após 1 min de reação. A
atividade enzimática foi medida em unidades de enzima g-1 de farinha (atividade
inespecífica). Uma unidade de enzima foi considerada como aquela capaz de produzir um
aumento equivalente a 0,100 na absorbância.
A concentração de proteínas totais (solúveis) foi determinada pela metodologia descrita
por Bradford (1976), por meio de leitura espectrofotométrica, a 595 nm. A quantidade de
proteína, expressa em mg g-1 de farinha, foi determinada por uma curva padrão de reagente
Bradford com solução de albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich, EUA), nas concentrações
de 0,05 a 0,5 µg µL-1. A partir dos dados de concentração proteica calculou-se a atividade de
específica de peroxidase, que foi expressa em unidade de enzima por mg de proteína.
A estabilidade da peroxidase foi verificada pela incubação do extrato sob temperatura de
ebulição (94°C) durante 5, 10, 15, 30, 60 e 120 min, seguida de resfriamento em banho de
gelo por 5 min, e leitura de atividade residual.
O efeito de substâncias inibidoras foi testado pela incubação a 37oC por 90 min. de ácido
cítrico e ácido ascórbico nas concentrações de 10 mmol L-1 e 50 mmol L-1, com extratos de E.
inflexa.
2.2. Uso potencial de peroxidase de E. inflexa para degradação de compostos fenólicos
Foram realizados testes com compostos fenólicos e efluentes agroindustriais após
estabelecimento dos parâmetros ótimos, baseados na metodologia de Akhtar e Husain (2006).
As amostras de efluentes foram coletadas na Estação de Tratamento de Efluentes (ETE) do
Distrito Agroindustrial de Anápolis (DAIA), localizada entre os paralelos 16°20’ e 16°30’S e
os meridianos 48º50’ e 49º00’W. Na área do DAIA tem-se o Córrego Abraão, que está
localizado em uma área de aproximadamente 29 ha. A carga orgânica atual contida no esgoto
bruto, segundo o Departamento de Meio Ambiente do DAIA em 2015, após coleta de 24 h é
de 3.750 kg DBO.dia-1. Em triplicata, 0,1 mL do extrato bruto foi incubado com 0,75 mL da
solução de três compostos fenólicos: pirogalol, catecol e resorcinol (1,0 mmol L-1), bem
como, com cada amostra de efluente: bruto, efluente tratado da Estação de Tratamento de
Efluentes (ETE) do DAIA e a montante e a jusante do lançamento da ETE no Córrego
Abraão, com adição de 0,15 mL (0,75 mmol L-1) de peróxido de hidrogênio. Em seguida, a
mistura foi agitada (vórtex) e incubada a 37oC por 90 min. Posteriormente, foram retiradas
alíquotas de 0,2 mL para a medida da concentração residual de fenóis pela metodologia de
Lowry et al. (1951). Os tubos controle foram utilizados com as soluções de fenóis e peróxido
de hidrogênio em substituição ao extrato enzimático e os tubos brancos foram constituídos de
água destilada em substituição ao volume de extrato. O experimento foi realizado em
triplicata, e a partir das médias e desvio padrão foram realizados gráficos de superfície usando
o programa SigmaPlot versão 12.0.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos experimentos realizados com Echinolaena inflexa foi encontrada uma concentração
de proteína solúvel de 5,33 mg g-1. A determinação da atividade enzimática dos extratos
brutos de Echinolaena inflexa para peroxidase, em diferentes valores de pH e tempo de
extração, permitiu encontrar as condições ótimas de extração destas enzimas. A relação entre
pH, tempo de extração e U g-1 é demonstrada na Figura 1.
De acordo com os resultados obtidos, a região entre o pH 7,5 e 8,5 foi a que apresentou
atividade enzimática superior às demais, e por esta razão o pH 8,0 foi considerado como o
ótimo para a extração das peroxidases da gramínea. A peroxidase de Echinolaena inflexa foi
melhor extraída quando o pH de extração foi combinado à variação do tempo de extração. Na
Figura 1 é também possível observar que a partir de 90 min obteve-se a maior quantidade de
enzima ativa extraída.
As condições ótimas de reação mostraram que o efeito da temperatura numa reação
enzimática pode ser observado inicialmente pelo aumento progressivo na atividade, devido ao
aumento da velocidade de formação do produto e consequentemente consumo do substrato
(Figura 2). Todavia, verifica-se que acima de 55oC começa a ocorrer perda gradativa da
atividade, possivelmente devido à desnaturação proteica pelo calor, como resultado da perda
da conformação nativa (Figura 2)
Figura 1. Efeito combinado entre o pH e o tempo de extração sobre a
atividade de peroxidase de Echinolaena inflexa (Ug-1).
Figura 2. Efeito combinado entre o pH e a temperatura de reação sobre a
atividade de peroxidase de Echinolaena inflexa (U g-1).
A região que demonstrou condições ótimas de reação correspondeu aos ensaios
realizados nas faixas de temperatura entre 45 a 55°C e de pH entre 7 e 8, faixa de pH
semelhante ao utilizado no processo de extração para a espécie. Sob estas condições, a
peroxidase de E. inflexa apresentou 6.250 U g-1 de farinha dos frutos.
Estes resultados são similares aos obtidos para as peroxidases de abacaxi e carambola,
espécies também adaptadas a clima tropical, que apresentaram temperatura ótima para
atividade na faixa de 50 a 55ºC (Brito et al., 2005).
É possível ainda observar que, mesmo que a temperatura ótima tenha sido encontrada
entre 45 a 55°C, em todo o intervalo testado (entre 30 e 60oC) há também atividade de
peroxidase (Figura 2). Este comportamento pode ser atribuído à adaptação das gramíneas ao
Cerrado. As plantas do bioma estão adaptadas a condições extremas, tais como alta insolação,
solos rasos, secos e nutricionalmente pobres, além das temperaturas que variam grandemente
ao longo do ano (Munhoz e Felfili, 2007).
Depois de estabelecidos esses parâmetros, o extrato da gramínea foi testado em função
do tempo de reação, a 55oC (Figura 3). A influência do tempo de contato entre enzima e
substrato foi significativa para os primeiros 10 min de reação, em que é possível observar
aumentos bruscos na resposta enzimática. Após 15 min de tempo de reação o aumento na
atividade passa a desacelerar, tendendo a estabilização.
Figura 3. Efeito do tempo de incubação com os substratos pirogalol
e peróxido de hidrogênio sobre a atividade de peroxidase em extrato
aquoso de frutos de Echinolaena inflexa.
As peroxidases são uma das enzimas de maior estabilidade térmica presentes em frutas e
vegetais (Berbicz e Clemente, 2001; Maciel et al., 2006). Este fato tem motivado grande
interesse dos pesquisadores quanto aos estudos de inativação, tornando-a principal referência
para se determinar quando o processamento térmico de frutas e vegetais foi ou não suficiente
para manutenção de sua qualidade como alimentos (Neves e Silva, 2007).
A atividade de peroxidase diminuiu com o tempo de incubação na temperatura testada,
no entanto manteve uma atividade de aproximadamente 11% após 5 min de tratamento. Com
o aumento do tempo as atividades continuaram diminuindo, porém de forma mais lenta. Este
resultado indica que a enzima é tolerante a temperaturas abaixo da ebulição.
Berbicz e Clemente (2001) obtiveram resultados semelhantes a Echinolaena inflexa nos
experimentos feitos com frutos de laranja. No tratamento térmico das enzimas de laranja a
80ºC, com 6 min a enzima manteve uma atividade entre 18 a 30% em relação ao inicio do
tratamento.
No tratamento térmico de peroxidases de carambola, goiaba e abacaxi aconteceu o
mesmo padrão. A atividade da peroxidase diminuiu com o tempo, observando-se uma perda
de aproximadamente 80% da atividade da enzima após tratamento térmico a uma temperatura
de 75 a 85°C (Brito et al., 2005).
Nos testes com inibidores foi observada a boa capacidade de inibição da peroxidase pela
ação do ácido ascórbico e menor inibição pelo ácido cítrico (Figura 4).
Figura 4. Efeito inibidor causado pelos ácidos na atividade de
peroxidases de Echinolaena inflexa após 30 min.
O ácido ascórbico tem sido usado há mais de 50 anos como inibidor de escurecimento
enzimático em alimentos de origem vegetal, muitas vezes combinado com ácidos orgânicos,
tais como o ácido cítrico (Neves e Silva, 2007). O escurecimento resulta da degradação da
antocianina pela ação de enzimas oxidativas, como polifenoloxidase (PPO), peroxidase
(POD) e ascorbato oxidase. Os testes realizados corroboram o fato da enzima aqui estudada
ser uma peroxidase clássica.
Neves e Silva (2007) também testaram o efeito do ácido ascórbico e do ácido cítrico no
escurecimento enzimático. Os testes foram feitos com peroxidases de Yaco, e para elas o
ácido ascórbico a 5 mmol L-1 apresentou os melhores resultados nos seus experimentos, com
uma redução de 27% de atividade em relação à amostra controle. O ácido cítrico se mostrou
eficiente apenas em concentrações acima de 10 mmol L-1 .
No caso deste trabalho o teste para avaliação de inibição de atividade nos extratos foi
realizado para se confirmar se a atividade em questão era devido a ação de peroxidases.
Assim como os testes com Yaco, os experimentos com Echinolaena inflexa tiveram grande
inibição com ácido ascórbico mesmo em baixas concentrações. O papel do ácido ascórbico
como inibidor se dá principalmente pela redução das quinonas em difenóis, evitando a
formação de melaninas e na sua atuação inibidora enzimática como acidulante (Neves e Silva,
2007). O ácido cítrico também é amplamente empregado como acidulante e composto
quelante.
A peroxidase de Echinolaena inflexa foi capaz de reagir com todos os compostos
fenólicos testados e com amostras de efluente (Tabela 1). Entretanto, a maior capacidade de
degradação de compostos fenólicos foi observada para o catecol, que foi de 87,5 . Os
resultados ainda demonstraram uma grande eficiência da enzima na degradação dos outros
fenóis, sendo que foi capaz de degradar 67,83% do pirogalol e 39,1% do resorcinol.
Nos testes com efluentes agroindustriais (Tabela 1), a amostra de efluente bruto foi
aquela em que a peroxidase de E. inflexa apresentou a maior capacidade de degradação de
compostos fenólicos (29,1%). Este resultado é interessante e promissor se levarmos em conta
que uma amostra real de efluente dista em muito das condições laboratoriais otimizadas para
os ensaios enzimáticos, em que há controle da concentração das espécies reagentes, da
presença de contaminantes, do pH e da temperatura do meio, entre outros (Abd-Allah, 1999).
Tabela 1. Degradação de compostos fenólicos em amostras dos quatro
pontos testados nos efluentes agroindustriais.
Amostras
Capacidade de degradação após 90 min (% média)
Desvio padrão
Córrego Abraão a montante do lançamento do efluente 7,3 12,7
Efluente bruto na entrada da ETE 29,1 5,2
Efluente tratado na saída da ETE 4,2 0,5
Córrego Abraão a jusante do lançamento do efluente 11,0 4,0
Klibanov (1983) realizou um dos primeiros trabalhos testando peroxidase em águas
contaminadas. O autor usou HRP purificada e os experimentos mostraram o bom potencial,
em alguns casos superior a 97%, de descontaminação de fenóis, anilinas e outros compostos
aromáticos de soluções aquosas.
Outros estudos recentes realizados com peroxidase livre e imobilizada tem-se mostrado
igualmente eficientes no tratamento de fenóis e clorofenóis. Estudos mecanísticos com
cloroperoxidases, peroxidase de rabanete, lignina peroxidase, manganês-peroxidase e lacase
também têm sido realizados (Kamida et al., 2005).
A peroxidase de Rábano (HRP) é uma das mais estudadas, esta enzima catalisa a
oxidação de vários substratos onde se incluem compostos aromáticos do tipo fenol, bifenol,
anilinas, benzidinas e compostos heteroaromáticos relacionados. A HRP pode remover fenóis
e aminas aromáticas diferentes da água, com eficiências de remoção para alguns poluentes
superiores a 99% (Akhtar e Husain, 2006). Outras fontes de peroxidase, como o
melão-de-São-Caetano também já apresentaram boa capacidade para degradação de compostos
fenólicos que ocorrem em efluentes de indústrias têxteis (Akhtar e Husain, 2006). O
tratamento foi notavelmente eficaz em misturas de fenóis, mas a peroxidase solúvel deixou de
funcionar depois de 3 h, enquanto a peroxidase imobilizada continuou ativa.
4. CONCLUSÃO
Este trabalho representa um primeiro esforço de se explorar novas alternativas ao
tratamento de águas residuais. A capacidade de degradação de compostos fenólicos pela
peroxidase de Echinolaena inflexa é comparável àquela estudada para outras fontes vegetais,
mas com o diferencial de que a enzima continua ativa numa amostra real de efluente
não-tratado.
O presente trabalho permitiu concluir que a gramínea Echinolaena inflexa apresentou um
teor elevado de atividade da peroxidase, o que a torna fonte alternativa para aplicação em
tecnologia enzimática. Os extratos de E. inflexa contendo peroxidase também foram capazes
de degradar compostos fenólicos em condições controladas de laboratório e em amostras reais
de efluente agroindustrial.
Entretanto, são importantes outros estudos para gerar reatores que possam tratar efluentes
com compostos fenólicos de maneira alternativa e eficaz. Além disso, há a necessidade da
realização de testes de caracterização de fenóis de cada efluente, para dessa forma entender a
ação da enzima em águas de diferentes origens. A exploração de plantas do Cerrado, se feita
de forma sustentável, pode resultar na descoberta e no desenvolvimento de ferramentas
tecnológicas de baixo custo e de alta eficiência para a recuperação de águas contaminadas.
