ENRAIZAMENTO EX VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DO PORTA-ENXERTO DE MACIEIRA M.9
ENRAIZAMENTO EX VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DO PORTA-ENXERTO DE MACIEIRA M.9
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INTRODUÇÃO
O Estado de Santa Catarina produziu 480 mil toneladas de maçãs na safra 99/00,
totalizando 60% da produção nacional (ICEPA, 2000). Os tratos culturais, o
sistema de condução e a alta qualidade genética e fitossanitária das mudas
utilizadas são fatores determinantes para o aumento da produtividade. Neste
contexto, a alta densidade de plantio dos pomares exige porta-enxertos
ananizantes e, conseqüentemente, grande quantidade de mudas por unidade de
área. O porta-enxerto M.9 é o mais utilizados no Estado em pomares de alta
densidade devido ao porte reduzido das plantas, o que facilita o manejo dos
pomares.
A micropropagação de macieira é uma técnica empregada para a obtenção e
produção massal de plantas livres de vírus. Entretanto, um dos pontos
limitantes desta técnica são o enraizamento e a aclimatização das plantas
micropropagadas (Sutter, 1988). Para Collet & Lê (1987) e Àlvarez et al.
(1989), a propagação clonal in vitro de espécies lenhosas é dificultada
principalmente porque muitas delas não produzem raízes. O genótipo da planta
determina diferentes respostas nos diferentes estágios da micropropagação
(Harbage e Stimart, 1996) e/ou no enraizamento (Marks, 1991; Haissig et al.,
1992). Essas respostas dependem da condição fisiológica dos explantes e das
condições ambientais utilizadas.
O enraizamento é uma etapa realizada classicamente in vitro (Álvares et al.,
1989; Harbage & Stimart, 1996; De Klerk et al., 1997), aumentando, contudo,
os custos de produção (Ferri et al., 1998). Além disto, as raízes produzidas in
vitro não sobrevivem após a transferência das plantas para o estágio de
aclimatização (McClelland et al.,1990). Para a maioria das espécies, ao
enraizamento, é necessária a presença de uma auxina no meio de cultura, na fase
de indução (De Klerk et al., 1995). A quantidade a ser adicionada no meio de
cultura depende das concentrações endógenas de auxinas do explante utilizado
(James e Thurnbon, 1981; Blakesley et al., 1991).
Já o enraizamento ex vitro reduz o custo de produção das mudas (Debergh e
Maene, 1981), podendo viabilizar, técnica e economicamente, o processo de
micropropagação.
Para a sobrevivência das mudas no estágio de aclimatização, é necessário que
estas produzam novas raízes em substratos porosos, com condições físicas e
nutricionais adequadas. Simultaneamente, a planta deverá desenvolver mecanismos
de controle de transpiração e condutância estomática (Díaz-Perez et al., 1995),
ativar os mecanismos de controle de perda de água pelas células (Sutter, 1988)
e aumentar a taxa fotossintética em condições de atmosfera mais rica em CO2
(Vantelgen et al., 1992). A baixa luminosidade e alta umidade relativa nos
frascos de cultura in vitro dificultam o estabelecimento de condições
autotróficas normais para algumas espécies, quando transferidas para as
condições ex vitro.
O objetivo deste trabalho foi quantificar as respostas ao enraizamento e a
aclimatização de miniestacas do porta-enxerto de macieira M.9, em diferentes
concentrações de ácido indolbutírico.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo in vitro
Os meristemas foram retirados de plantas matrizes do porta-enxerto M.9 mantidas
em casa de vegetação. Os meristemas foram introduzidos em meio MS (Murashige
& Skoog, 1962), e as brotações produzidas foram repicadas para o meio MS
com 1,1mM de 6-benzilaminopurina (6-BAP), 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30g.L-
1 de sacarose e 6g.L-1 de ágar. Para o estágio de micropropagação, foram
empregados 50 mL de meio de cultura em frascos com capacidade de 300 mL,
autoclavados durante 20 minutos a 121°C. Os frascos foram mantidos em câmara de
crescimento com temperatura de 27±2°C, fotoperíodo de 16 horas com intensidade
luminosa de 50 mmol.m-2.s-1.
Enraizamento e aclimatização
As miniestacas de 2,5 a 3 cm de comprimento, com dois pares de folhas, foram
preparadas a partir de plantas micropropagadas repicadas in vitro a cada 45
dias. A indução ao enraizamento foi efetuada submergindo 10 mm da base das
miniestacas durante 10 segundos, em diferentes concentrações de ácido
indolbutírico (0; 500; 1000 ou 1500 mg.L-1). Em seguida, as miniestacas foram
transferidas para bandejas de isoporcom células com capacidade de50 mL do
substrato, composto por casca de arroz carbonizada e vermiculita média 1:1 (v/
v.). As bandejas foram colocadas dentro de caixas plásticas com uma lâmina de
água de 5 mm, para manter elevada a umidade relativa do ar. As caixas foram
cobertas com uma lâmina de vidro, conforme metodologia descrita por Pedrotti
(1993). Durante 30 dias, essas caixas foram mantidas em câmara de aclimatização
com temperatura de 27±2°C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 75
mmol.m-2.s-1. Após esse período, as plantas foram avaliadas quanto ao
percentual de enraizamento, número e comprimento das raízes.
Crescimento das mudas após a aclimatização
Após a avaliação do enraizamento, as plantas foram transferidas para bandejas
de isopor alveoladas (Código 12-72) com células contendo 150 mL de substrato
comercial Plantmax® (Eucatex, São Paulo, BR). As bandejas foram mantidas por 45
dias em casa de vegetação com temperatura de 25±4°C. A irrigação foi realizada
por aspersão, sendo que a quantidade de água foi adicionada em função das
perdas provocadas por evapotranspiração, medida em minitanque Classe A.
Ao final desse período, as plantas foram avaliadas quanto ao percentual de
sobrevivência, número, comprimento (cm) e peso da matéria seca das raízes
(mg.planta-1), bem como a altura de plantas (cm), número de folhas e peso da
matéria seca da parte aérea (mg.planta-1).
Para os dois experimentos, o delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, com 4 repetições, com 11 miniestacas por repetição.
Os resultados foram submetidos à análise de variância e regressão polinomial,
sendo que os dados de percentagem foram transformados em arc.sen
, conforme Sokal e Rohlf (1995). Para a comparação de médias,
foi utilizado o teste de Duncan, a 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Enraizamento e aclimatização
As maiores percentagens de enraizamento (82 e 84%) foram observadas nas
miniestacas tratadas com 500 e 1000 mg.L-1 de AIB, respectivamente (Tabela_1).
O menor percentual de enraizamento (30%) foi obtido com 1500 mg.L-1de AIB. As
miniestacas que não receberam AIB, apresentaram enraizamento de 64%, porém
significativamente inferior aos observados com AIB 500 ou 1000 mg.L-1.As
miniestacas-controle produziram em média 3,5 raízes, valores esses inferiores
àqueles obtidos nas miniestacas que receberam AIB. Nos tratamentos com 500;
1000 e 1500 mg.L-1de AIB, o número de raízes emitidas variou de 6 a 8, não
diferindo estatisticamente entre si. O comprimento das raízes variou de 3,5 a
4,7 cm, sem haver, no entanto, diferenças significativas entre as concentrações
de AIB utilizadas.
As altas percentagens de enraizamento ex vitro, obtidas neste trabalho,
evidenciam que a concentração de AIB recomendada para o enraizamento deste
porta-enxerto está entre 500 e 1000 mg.L-1.Concentrações superiores a 1000
mg.L-1parecem inibir a percentagem de enraizamento, indicando um possível
efeito de fitotoxidez, como foi verificado por Nachtigal (1994). Os resultados
obtidos foram superiores aos de James e Thurnbon (1981), que obtiveram 45% de
enraizamento deste porta-enxerto, quando utilizaram fluroglucinol no meio de
cultura. Possivelmente, as condições de indução in vitro, utilizadas por estes
autores, dificultaram a absorção da auxina, como constatado por Harbage et al.
(1998). Além disto, a intensidade luminosa da câmara de crescimento pode ter
contribuído para inativar parte da auxina contida no meio gelatinoso utilizado
por James e Thurnbon (1981). A ausência de luz na base da miniestaca também
deve ter favorecido a indução e o crescimento das raízes, pois Khosh-khui e
Sink (1982) obtiveram aumento no enraizamento de roseiras quando submeteram a
base das estacas a ausência de luz. Da mesma forma, para pereira (Wang, 1991) e
macieira (Fortes e Leite, 1993; Zanol, 1996), foi evidenciado que a ausência de
luz favoreceu a indução de raízes na base das estacas. Além da ausência de luz
, a maior porosidade e aeração dos substratos utilizados podem ter favorecido a
indução, a diferenciação e o crescimento de raízes, como foi observado por Jay-
Allemand et al. (1992), trabalhando com indução ao enraizamento de miniestacas
de Juglans regia.
No presente trabalho, o AIB em 1000 mg.L-1 não aumentou a percentagem de
enraizamento em relação a 500 mg.L-1, enquanto, acima de 1000 mg.L-1, esta foi
reduzida a 30 % (Tabela_1). Estes resultados podem estar relacionados com os
teores endógenos de auxinas que foram produzidas por gemas e folhas jovens,
como sugerem Hartmann et al. (1997), pois mesmo sem aplicação de AIB na base
das miniestacas, as percentagens de enraizamento do 'M.9'foram de 64 %,
superiores aos obtidos por James e Thurnbon (1981). As condições experimentais
podem ter determinado o padrão de divisão celular e do crescimento das raízes
independentemente da concentração de AIB aplicada, pois as plantas não
apresentaram diferenças no comprimento das raízes 30 dias após a indução.
Concentrações de 1500 mg.L-1 de AIB podem ter determinado um efeito fitotóxico
no tecido da base das miniestacas, diminuindo drasticamente a percentagem de
enraizamento (Tabela_1) e aumentando a mortalidade das plantas (Tabela_2).
A exposição das miniestacas às concentrações de 500 e 1000 mg.L-1 de AIB por 10
segundos foi suficiente para a indução de primórdios radiculares e crescimento
das raízes sem a formação de calos na base das miniestacas. Estes resultados
sugerem que a desdiferenciação e a indução à divisão celular para a formação de
um maior número de primórdios radiculares são dependentes da aplicação exógena
desta auxina. Períodos maiores de exposição a concentrações elevadas de auxina
podem ocasionar aumento da oxidação (James e Thurbon, 1981) e da atividade da
peroxidase, reduzindo as concentrações endógenas de ácido indolilacético
(Harbage et al., 1998). Isso pode explicar, em parte, a redução no enraizamento
das miniestacas que receberam 1500 mg.L-1 de AIB. Os resultados obtidos com o
tempo de exposição ao AIB, por 10 segundos, parecem confirmar os resultados de
Jarvis et al. (1983) que observaram um aumento na síntese de RNA, no período de
20 horas após a aplicação de auxina exógena, o que corresponde às primeiras
divisões celulares. Desta forma, não são necessários longos períodos de
exposição ao AIB, como foi utilizado por James e Thurbon (1981), e Harbage et
al. (1998).
Os valores do comprimento das raízes formadas não diferiram estatisticamente
entre si em função das concentrações de AIB utilizadas, possivelmente porque a
auxina aplicada, atua mais sobre a indução ao enraizamento do que sobre o
crescimento das raízes. Possivelmente, o crescimento depende de condições
físicas e químicas do substrato utilizado e das substâncias de reserva que a
planta utiliza para a divisão e elongação celular das raízes.
Crescimento após a aclimatização
Após 45 dias da repicagem das plantas enraizadas e aclimatizadas para as
bandejas alveoladas contendo 150 ml de substrato Plantmax®, a sobrevivência das
plantas variou de 70 a 95% (Tabela_2). Os outros parâmetros não foram
influenciados pela concentração de AIB utilizada no enraizamento. Para este
período de crescimento em casa de vegetação, o comprimento das raízes variou de
11,3 a 12,5 cm, mostrando grande uniformidade apesar das diferentes
concentrações de auxina utilizadas na fase de indução. Este resultado pode
indicar que este é o padrão de crescimento das raízes do porta-enxerto M.9
enraizado e aclimatizado segundo a metodologia utilizada neste trabalho. A
mesma tendência foi observada na altura das plantas e no número de folhas
emitidas após 45 dias de crescimento em casa de vegetação. Para este período de
cultivo, não houve diferenças significativas em função das concentrações de AIB
utilizadas na fase de indução ao enraizamento.
Com relação à matéria seca produzida pelas raízes e parte aérea das plantas, as
curvas de regressão mostram um comportamento quadrático, atingindo os maiores
valores quando as miniestacas receberam concentrações entre 500 e 1000 mg.L-
1 de AIB (Figura_1). A maior produção de matéria seca coincidiu com os
tratamentos que apresentaram as maiores percentagens de enraizamento. No
entanto, considerando os melhores resultados de enraizamento (82%) e a maior
sobrevivência das plantas aos 45 dias após o transplante para a casa de
vegetação (95%), a concentração de 500 mg.L-1 foi a mais efetiva para este
porta-enxerto.
Os dados obtidos mostram que a indução ao enraizamento realizado ex vitro,
concomitante com a fase de aclimatização, pode ser favorável à produção do
porta-enxerto M.9. A principal vantagem deste processo é a superação das
limitações impostas pelo enraizamento in vitro, realizado por James e Thurbon
(1981), Harbage et al. (1998) e Ferri et al. (1998), pois as raízes produzidas
in vitro não são funcionais após sua transferência para casa de vegetação
(McClelland et al., 1990). Além disso, segundo Sutter (1988), quando
transferidas para a aclimatização, as plantas enraizadas in vitro são
submetidas a uma condição de alta transpiração que, associada à alta
condutividade hídrica, provoca baixa funcionalidade ou ausência de controle
sobre o fechamento dos estômatos. Esta condição provoca altas taxas de
mortalidade, o que não foi observado no presente trabalho. O sistema utilizado
neste trabalho permite um grande controle sobre as condições de umidade nos
recipientes de aclimatização, diminuindo as perdas de água por evaporação e
garantindo, com isto, altas percentagens de enraizamento, aclimatização e
sobrevivência deste porta-enxerto após sua transferência para a casa de
vegetação.
As plantas enraizadas e aclimatizadas simultaneamente apresentaram grande
número de raízes secundárias (Figura_2), o que aumenta a superfície radicular e
o volume de substrato explorado. Como conseqüência, aumenta a necessidade de
água e nutrientes para o rápido crescimento inicial das plantas, podendo
viabilizar o uso desta tecnologia para a produção de porta-enxertos de macieira
em escala comercial.
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Esta metodologia permite diminuir os custos de produção das mudas, visto que,
para a fase de enraizamento, não é necessário utilizar meios de cultura e salas
de crescimento assépticas, mão-de-obra especializada para repicagens em capela
de fluxo laminar, além de outros custos fixos de um laboratório de cultura de
tecidos. Com enraizamento ex vitro, é possível diminuir em, no mínimo, 50% os
custos finais de produção in vitro de uma planta deste porta-enxerto.
CONCLUSÕES
Nas condições em que os experimentos foram realizados, pode-se concluir que:
1 - As maiores percentagens de enraizamento ex vitro para o porta-enxerto de
macieira M.9 são obtidas com 500 e 1000 mg.L-1 de AIB.
2 - A concentração de 500 mg.L-1 de AIB é a mais efetiva para o enraizamento e
sobrevivência das plantas, aos 45 dias após o transplante em casa de vegetação.
