Embriogênese somática do caquizeiro
PROPAGAÇÃO
Embriogênese somática do caquizeiro1
Somatic embryogenesis of japanese persimmon
Dayse Cristina de CarvalhoI; Luiz Antonio BiasiII; Luciana Lopes Forets
RibasIII; Charles Allan TellesIV; Flávio ZanetteV
IEngª Agrª, MSc. Aluna do Programa de Pós-Graduação em Agronomia. ESALQ/USP. E-
mail: dayse@esalq.usp.br
IIProfessor Adjunto do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de
Ciências Agrárias. UFPR. Caixa Postal 19.061. CEP 81.531-990. Curitiba-PR.
Fone/Fax (41) 350-5601. E-mail: biasi@ufpr.br. Bolsista de Produtividade em
Pesquisa do CNPq
IIIProfessora Adjunta do Departamento de Botânica. Setor de Ciências
Biológicas. UFPR
IVAluno do Curso de Agronomia. UFPR. Bolsista de Iniciação Científica do CNPq
VProfessor Titular do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de
Ciências Agrárias. UFPR
INTRODUÇÃO
A propagação convencional de caquizeiros pela via sexuada é difícil, devido ao
seu longo período juvenil, elevado porte das plantas e heterozigoze. Além
disso, o cruzamento é prejudicado pelo limitado número de cultivares, que
carregam flores masculinas e/ou hermafroditas (Choi et al., 2001). A propagação
vegetativa via enxertia é também dificultada pelo fato de os porta-enxertos
serem provenientes de sementes, o que causa grande desuniformidade quanto ao
porte e vigor das plantas, além de ser um processo demorado, oneroso e com
baixas taxas de pegamento (Biasi et al., 2002).
A solução para este problema passa pelo desenvolvimento de uma tecnologia de
propagação vegetativa para a formação direta das mudas ou de porta-enxertos, o
que representará um significativo avanço na cultura do caquizeiro (Martins
& Pereira, 1989).
Barros (1999) ressalta que dentre os processos de micropropagação, a
embriogênese somática é, teoricamente, a melhor opção para a propagação in
vitro de fruteiras por apresentar algumas vantagens, tais como: a alta taxa de
multiplicação comparada a qualquer outro processo de propagação; o
escalonamento da produção pela manutenção da cultura em meio líquido; o plantio
direto da muda obtida via embriogênese somática sem necessidade de enxertia,
com menor custo de produção, além de a planta ser geneticamente igual à planta-
mãe, sem as influências do porta-enxerto, como acontece com as plantas obtidas
por métodos de propagação vegetativa convencionais.
O trabalho pioneiro com a indução da embriogênese somática a partir de tecidos
de caquizeiro foi realizado por Hirokazu et al. (1998), no Japão, trabalhando
com segmentos foliares provenientes de plantas obtidas de ápices meristemáticos
cultivados in vitro, em meio MS½NO3 suplementado com BAP e ANA, em diferentes
concentrações. Posteriormente, não se encontraram trabalhos semelhantes
publicados, ainda que se saiba que a técnica de indução da embriogênese
somática seja uma ferramenta com grande potencial para a propagação massal do
caquizeiro. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um
protocolo para a embriogênese somática do caquizeiro a partir de embriões
zigóticos. Esse protocolo poderá servir de embasamento para futuros estudos com
tecidos somáticos, já que os tecidos de origem zigótica apresentam
variabilidade natural decorrente do cruzamento.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Micropropagação de Plantas
do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo do Setor de Ciências Agrárias
da Universidade Federal do Paraná. Como explantes, foram utilizados embriões
zigóticos em diversos estádios de desenvolvimento, retirados de frutos
coletados de plantas adultas de caquizeiro do tipo 'Café', a partir de quatro
semanas após o pleno florescimento até 22 semanas. A assepsia foi realizada nos
frutos inteiros quando possuíam até 3,5 cm de diâmetro e posteriormente nas
sementes, com etanol 70% por um minuto, imersão em solução de hipoclorito de
sódio 2,5% por trinta minutos e quatro lavagens em água esterilizada.
Efeito do estádio de desenvolvimento do embrião zigótico na indução de culturas
embriogênicas.
Foi avaliado o melhor estádio de desenvolvimento do embrião zigótico para
induzir a formação de massas embriogênicas, sendo testados seis estádios, a
partir de quatro semanas após o florescimento, até a maturação com 22 semanas.
Em cada coleta, foram isolados 40 embriões em dois meios de cultura, um livre
de reguladores e outro contendo 20 µM de 2,4-D e 2 µM de cinetina. O meio de
cultura utilizado foi o MS½NO3 solidificado com 5,5 g.L-1 de ágar. Os frascos
foram mantidos no escuro e avaliados após 90 dias pela porcentagem de explantes
com calo. Os 40 calos obtidos no primeiro isolamento foram repicados para dois
meios de cultura, um com 10 µM e outro com 20 µM de 2,4-D, ambos acrescidos com
2 µM de cinetina. Os explantes foram mantidos no escuro e avaliados após 60
dias do isolamento, pela porcentagem de calos com massas pró-embriogênicas.
Efeito de reguladores de crescimento na manutenção e multiplicação das culturas
embriogênicas
As culturas pró-embriogênicas obtidas no experimento anterior foram
identificadas e utilizadas neste experimento. O meio de cultura utilizado foi o
MS½NO3 com 2 µM de cinetina e as concentrações de 2,5; 5 e 10 µM de 2,4-D. O
delineamento foi em blocos ao acaso, com cinco repetições e dez calos por
parcela. Os explantes permaneceram no escuro e foram avaliados após 90 dias
pela porcentagem de calos com culturas embriogênicas e número de embriões
globulares por calo.
Efeito de reguladores de crescimento na maturação dos embriões somáticos
As culturas embriogênicas desenvolvidas no experimento anterior foram
identificadas e utilizadas neste experimento. O meio de cultura utilizado foi o
MS½NO3 com 0,5 µM de AIB e as concentrações de 5; 10 e 20 µM de 2-iP. O
delineamento foi em blocos ao acaso, com cinco repetições e dez calos por
parcela. Os explantes foram mantidos no escuro e avaliados após 60 dias pela
porcentagem de calos com massas embriogênicas, número de embriões globulares,
cordiformes, torpedos e cotiledonares por calo.
Efeito de reguladores de crescimento na conversão de embriões somáticos em
plantas
Os primeiros cinqüenta embriões formados foram individualizados e cultivados em
meio de cultura MS½NO3 com 5 µM de 2-iP, 5 µM de AG3 e 0,5 µM de AIB para a sua
conversão em plantas. As culturas foram mantidas na luz, e a avaliação foi
realizada após 30 dias pela porcentagem de embriões convertidos em plantas,
comprimento médio da raiz e da parte aérea e número de folhas por planta.
Depois foi instalado um experimento de conversão, testando diferentes
concentrações de BAP. O meio de cultura foi o MS½NO3 suplementado com 0,5 µM de
AG3 e 0; 0,25; 0,5 e 1,0µM de BAP. O delineamento foi em blocos ao acaso, com 3
repetições e 10 embriões por parcela. Os embriões foram mantidos na luz, e a
avaliação foi realizada após 30 dias pela porcentagem de embriões convertidos
em plantas, porcentagem de embriões oxidados, comprimento da parte aérea e da
raiz, e número de folhas por planta.
A sala de crescimento possuía iluminação com lâmpadas fluorescentes do tipo
branca fria, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 40 µmol.m-2.s-1.
A análise estatística foi realizada com o programa computacional MSTAT, sendo
que, inicialmente, os dados foram analisados pelo teste de Bartllet para testar
a homogeneidade das variâncias dos tratamentos e aqueles não-homogêneos foram
transformados para a análise. Depois foi realizada a análise de variância e o
teste de Tukey, a 5% de probabilidade de erro, quando o efeito dos tratamentos
foi significativo pelo teste F.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito do estádio de desenvolvimento do embrião zigótico na indução de culturas
embriogênicas
Quanto às fontes de explantes testadas no presente trabalho, apenas os embriões
zigóticos maduros (frutos com 22 semanas de formação) permitiram a indução e o
desenvolvimento dos embriões somáticos no meio suplementado com reguladores de
crescimento. Os explantes isolados em meio de cultura sem reguladores de
crescimento não formaram calos. A formação de calos escuros ocorreu em 86,7%
dos quarenta explantes isolados de frutos a partir de 18 semanas de
desenvolvimento, em meio suplementado com 20 µM de 2,4-D mais 2 µM de cinetina,
indicando que embriões com idade inferior apresentam fatores intrínsecos à sua
maturidade fisiológica que bloquearam uma resposta aos reguladores de
crescimento nas concentrações testadas e ao desencadeamento do processo de
embriogênese somática.
Aos 150 dias de cultivo dos explantes, foi possível verificar a formação de
complexos ou massas celulares pró-embriogênicas em 52% dos calos cultivados em
meio suplementado com 10 µM de 2,4-D mais 2 µM de cinetina (TABELA_1). Estes
complexos caracterizam-se por serem regiões friáveis, normalmente branco-
translúcidas e mucilaginosas quando comparados com calos não-embriogênicos que
foram esverdeados e duros. Os embriões maduros apresentaram o padrão indireto
de embriogênese, induzindo inicialmente uma massa celular embriogênica, com
embriões somáticos desenvolvendo-se em sua superfície (FIGURA_1).
Efeito de reguladores de crescimento na manutenção e multiplicação das culturas
embriogênicas
Houve uma evolução dos pró-embriões para o estádio globular, mais
pronunciadamente no tratamento com 5 µM de 2,4-D, apesar de não diferir
significativamente das demais concentrações (TABELA_2). A transferência das
culturas embriogênicas para um meio sem reguladores de crescimento ou com a
concentração de 2,4-D reduzida é normalmente necessária para a produção de
embriões somáticos (Sharp et al., 1980). Nesta etapa, a estratégia consiste em
determinar as condições adequadas para o estabelecimento de ciclos repetitivos
de divisão celular e o controle restrito dos processos de diferenciação, de tal
maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou
embriões somáticos em estádios iniciais de desenvolvimento (Guerra et al.,
1999). Observou-se, na superfície das massas celulares de caquizeiro, a
formação de embriões somáticos globulares (FIGURA_2), e a manutenção destas
culturas em meio basal, acrescido de 2,4-D, nas três concentrações testadas,
induziu a formação de pró-embriões e embriões somáticos globulares num processo
contínuo.
[/img/revistas/rbf/v26n2/21825f2.jpg]
Efeito de reguladores de crescimento na maturação dos embriões somáticos
As culturas constituídas de embriões somáticos globulares, que foram
transferidas para meios de cultura suplementados com citocininas, apresentaram
avanço para outros estádios ontogenéticos, como cordiforme, torpedo e
cotiledonar, desenvolvendo-se de forma assincrônica, não havendo diferença
estatística entre as concentrações de 2-iP (TABELA_3). Nesta fase da
embriogênese somática, compreende a progressão das fases iniciais para as fases
tardias. A estratégia a ser empregada consiste em interromper os ciclos
repetitivos de divisão celular e fornecer estímulos fisiológicos, bioquímicos e
ambientais para a diferenciação celular, para que os ciclos de desenvolvimento
e de maturação originem um grande número de embriões somáticos maduros, de alta
qualidade e aptos a se converterem em plantas (Guerra et al., 1999). Segundo
Gray (1992), os embriões somáticos que se formam a partir de complexos pró-
embrionários tendem a se desenvolver de forma assincrônica, sendo que, em
determinado tempo, vários estádios ontogenéticos são observados nas culturas
(FIGURA_3). Da mesma forma, Guerra & Handro (1998), trabalhando com
culturas embriogênicas de Euterpe edulis repicados para meio de cultura
contendo 2-iP e ANA, obtiveram a progressão dos embriões somáticos ao mesmo
tempo que a cultura-matriz mantinha a sua competência embriogênica.
[/img/revistas/rbf/v26n2/21825f3.jpg]
Efeito de reguladores de crescimento na conversão de embriões somáticos em
plantas
No teste preliminar de conversão, obteve-se, a partir de cinqüenta embriões no
estádio torpedo, a conversão em plantas de 75,5% destes, com uma média de 0,85
cm de comprimento de raiz, 1,25 cm de parte aérea e 1,31 folha por plântula
quando cultivados em meio suplementado com 5 µM de 2-iP, 5 µM de AG3 e 0,5 µM
de AIB.
Num segundo experimento, investigou-se a conversão dos embriões em plantas pela
utilização da citocinina BAP em diferentes concentrações e os melhores
resultados quanto ao comprimento das raízes e número de folhas por planta foram
obtidos no tratamento de 1 µM, como pode ser observado na TABELA_4. O fenótipo
das plantas em meio suplementado com BAP deu-se de forma normal, sem alterações
morfológicas visualmente perceptíveis. Contudo, a conformação morfológica das
plântulas mostrou-se alterada, sendo o fato representado por folhas
encarquilhadas, fusionadas e coriáceas (FIGURA_4). Segundo Redenbaugh et al.
(1988), para que ocorra conversão, os embriões somáticos têm de realizar uma
série de eventos: germinação (emissão da radícula), crescimento e
desenvolvimento do sistema radicular, produção de, no mínimo, duas folhas
verdadeiras, conexão direta da raiz com a parte aérea e produção de uma planta
verde com fenótipo normal. Guerra et al. (1999) citam que o efeito das auxinas
como indutoras da embriogênese somática pode também acarretar a formação de
embriões anômalos quando estes passam por prolongados períodos em meios
suplementados com estas substâncias. Para Raemakers et al. (1995), o
desenvolvimento de embriões somáticos malformados e/ou a formação de folhas
carnosas com caules fasciados é conseqüência de maturação insuficiente. Esse
fenômeno tem sido observado para muitas espécies e é denominado de germinação
precoce, que se refere ao embrião em desenvolvimento que tende a desviar-se dos
estádios normais de embriogênese somática e adquirem características de uma
plântula malformada.
[/img/revistas/rbf/v26n2/21825f4.jpg]
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram o estabelecimento do
seguinte protocolo para a embriogênese somática do caquizeiro a partir de
embriões zigóticos: utilizar como explantes embriões zigóticos maduros,
retirados de frutos com 22 semanas de formação; cultivá-los em meio de cultura
MS½NO3 suplementado com 10µM de 2,4-D e 2 µM de cinetina para o desenvolvimento
de pró-embriões; transferir as culturas embriogênicas para meio basal com 5 µM
de 2,4-D e 2 µM de cinetina para a evolução do estádio globular; transferir as
culturas embriogênicas para meio basal com 0,5 µM de AIB e 2i-P em
concentrações de 5 a 20 µM para a promoção dos embriões globulares a estádios
mais avançados da ontogenia, como cordiforme, torpedo e cotiledonar; e
transferir os embriões para meio basal com 1 µM de BAP e 0,5 µM de AG3 para a
conversão em plantas.
