Ligadura de ducto biliar como modelo de estudo da síndrome hepatopulmonar e
estresse oxidativo
GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGYINTRODUÇÃO
A cirrose hepática é uma doença crônica e progressiva, que apresenta um estágio
de disfunção hepática lento e irreversível, caracterizando-se pela formação de
nódulos hepáticos em conseqüência da fibrose. Estas alterações estruturais
constituem as principais respostas do tecido hepático às inúmeras agressões de
natureza inflamatória, tóxica, metabólica ou congestiva(22).
Os cirróticos podem apresentar doenças pulmonares comuns, como a bronquite
crônica (BC), com relativa freqüência, especialmente em alcoolistas e
tabagistas com episódios recurrentes de infecção pulmonar e eventual
interferência na função pulmonar(8). A ascite e o derrame pleural podem
diminuir a ventilação pulmonar e prejudicar as trocas gasosas.
Nas cirroses, conforme a causa, podem ocorrer situações específicas em que há
comprometimento pulmonar e disfunção respiratória, como a alveolite fibrosante
e o enfisema pulmonar(3).
A doença hepática crônica pode alterar a vasculatura pulmonar, possibilitando a
ocorrência de hipertensão pulmonar, shunts intrapulmonares e a síndrome
hepatopulmonar(3).
A síndrome hepatopulmonar (SHP) caracteriza-se por uma tríade clínica que
inclui doença hepática, anormalidades em trocas gasosas e a presença de
dilatações vasculares pulmonares(9).
A obstrução prolongada do ducto biliar é um modelo experimental de cirrose
biliar secundária muito utilizado que provoca marcada proliferação ductal, com
edema e reações inflamatórias agudas, podendo, ainda, ocasionar alterações
sistêmicas(24).
CHANG e O´HARA(5), demonstraram que animais submetidos a ligadura de ducto
biliar apresentavam desenvolvimento progressivo de anormalidades nas trocas
gasosas, similares àquelas encontradas em humanos com SHP. Observou-se que
esses animais cirróticos apresentavam um gradiente alvéolo-arterial de oxigênio
superior à 100%, associado à hipoxemia moderada (valores inferiores à 85 mm
Hg). Estes achados estavam associados à vasodilatação intrapulmonar, atribuída
aos elevados valores de oxído nitrico sintase endotelial (eNOS) encontrados no
homogeneizado pulmonar(10).
Diversos autores têm demonstrado, que animais com cirrose induzida
experimentalmente, por tetracloreto de carbono (CCl4) ou ligadura de ducto
biliar, apresentam aumento do estresse oxidativo em tecido hepático(17, 19,
20), mas a interrelação das alterações hepáticas e pulmonares ainda não está
bem esclarecida.
O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o estresse oxidativo e seu potencial
antioxidante no tecido pulmonar de ratos com SHP induzida por ligadura de ducto
biliar, bem como as alterações gasométricas e a relação pneumossomática.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados 12 ratos machos Wistar, com peso entre 200 e 300 g, divididos
em dois grupos de 6 animais: um grupo cirrótico (Ci) e um controle (Co). A
cirrose hepática foi produzida pela ligadura do ducto biliar e o grupo controle
foi submetido a laparotomia e a manipulação do ducto biliar. Este modelo
experimental seguiu o padrão descrito por KONTOURAS et al.(15).
Os animais foram sacrificados após 28 dias do início do experimento.
Os procedimentos com os animais foram os preconizados pela Comissão de Pesquisa
e Ética em Saúde do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre, RS.(13).
Para verificação da integridade hepática foram utilizadas as dosagens
sangüíneas das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanino
aminotranferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA).
No homogeneizado de tecido pulmonar, realizou-se a avaliação do estresse
oxidativo através dos métodos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBA-RS) e quimiluminescência (QL). O TBA-RS é uma técnica em que se verifica a
presença de malondialdeído e de outras substâncias, provenientes da peroxidação
lipídica no material biológico, com resultados expressos em nanomol por
miligrama de proteína (µmol/mg prot)(4). A QL se baseia em reação iniciada por
hidroperóxido de tert-butila, onde se avalia a emissão de elétrons livres
produzidos por amostra, com resultados expressos em contagens por segundo por
miligrama de proteína (cps/mg prot)(14). A avaliação da atividade antioxidante
da enzima superóxido dismutase (SOD), que cataliza a dismutação do radical
superóxido para formar peróxido de hidrogênio e oxigênio, foi verificada pelo
sistema de detecção adrenalinaadrenocromo, e os resultados foram expressos em
unidades de SOD por miligrama de proteína do homogeneizado do tecido em estudo
(18). Os testes de avaliação da integridade hepática foram realizados a partir
da coleta de sangue do seio orbital dos ratos e as análises dos gases arteriais
(PaO2 , pressão parcial de oxigênio arterial; PaCO2 , pressão parcial de 2 2
dióxido de carbono arterial; SaO2 /Hb, saturação de oxigênio da hemoglobina)
foram realizadas através da coleta de sangue da aorta abdominal.
Os testes laboratoriais foram realizados no Laboratório Central da Irmandade
Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, RS, e os demais procedimentos foram
realizados no Laboratório de Fisiologia Digestiva e Estresse Oxidativo do
Instituto de Ciências Básicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, RS..
Análise estatística realizada entre os grupos foi ANOVA, seguida de teste t de
Student. Todos resultados foram expressos como média ± erro padrão. A diferença
estatisticamente significativa foi definida quando P <0,05.
RESULTADOS
Os resultados estão apresentados em tabelas e gráficos nos diferentes grupos
experimentais.
A Tabela_1 apresenta os valores das aminotransferases hepáticas e da FA, nas
quais observou-se aumento significativo, bem como alterações significativas na
gasometria arterial, na diferença artério-alveolar de oxigênio e na relação
pneumossomática dos animais Co em relação aos animais Ci.
Lipoperoxidação no pulmão
Na Figura_1 estão expressos os valores da lipoperoxidação no tecido pulmonar
dos animais do grupo Co e Ci. Nota-se que os animais cirróticos apresentam
aumento significativo tanto nos níveis de lipoperoxidação (LPO) avaliadas por
TBA-RS e QL, quanto na atividade da SOD em relação ao grupo controle (P <0,05).
Enzima antioxidante no pulmão
Houve aumento significativo da atividade da enzima antioxidante superóxido
dismutase no tecido pulmonar dos animais cirróticos em relação aos animais
controle (P <0,05) (Figura_2).
DISCUSSÃO
A ligadura de ducto biliar é um dos modelos experimentais utilizados por
diferentes grupos de investigação para produzir cirrose biliar secundária em
animais. Este modelo de cirrose apresenta semelhanças em muitas das
características observadas na cirrose em humanos e nas induzidas por CCL , tais
como a retenção de sódio, circulação hiperdinâmica, 4 redução da resistência
vascular periférica e aumento do débito cardíaco(12).
Segundo estudos realizados por KONTOURAS et al.(15), 15 dias após a ligadura de
ducto biliar (LDB) as alterações metabólicas e bioquímicas não se estabeleceram
completamente. Desta maneira, no presente experimento, os animais foram
sacrificados após 28 dias da LDB, onde em trabalhos de diversos pesquisadores
já estão estebelecidas as condições de cirrose neste modelo.
Nas observações de PERES(20) e MILTERSTAINER et al. (17) ficaram bem
estabelecidas as condições de cirrose em 28 dias de LDB, razão pela qual neste
dia foram sacrificados os animais.
O aumento da FA, após a indução da colestase, dá-se pela elevação da síntese da
enzima pelos hepatócitos. Os valores séricos encontrados após este período
originam-se predominantemente do epitélio biliar(23).
Houve uma elevação das aminotransferases (ALT e AST), que pode ser atribuída à
lesão ou destruição dos tecidos ricos em aminotransferases ou ainda a
alterações da permeabilidade da membrana celular, que permitem sua liberação na
corrente sanguínea(23).
Neste estudo, os animais Ci tiveram os níveis séricos de AST, ALT e FA
aumentados em relação ao grupo Co, comprovando a lesão de parênquima e da via
biliar (Tabela_1).
Doenças crônicas do fígado, especialmente a cirrose, podem ser associadas com
hipoxemia arterial, que resulta da combinação de alteração na relação
ventilação-perfusão e shunt pela dilatação vascular intrapulmonar(1, 7).
Trabalhos experimentais têm demonstrado, no grupo Co, valores médios de PaO2 de
92,79 mm Hg e de PaCO2 em torno de 40,01 mm Hg; em animais com 5 semanas de
cirrose por LDB, os valores médios de PaO2 foram de 84,21 mm Hg e de 34,94 mm
Hg para a PaCO2 (11).
Observou-se na presente série, que a PaO2 e a SatO2/Hb dos animais Ci tiveram
diminuição significativa em relação ao grupo Co de, respectivamente 42% e 23%,
e que a PaCO2 apresentou aumento significativo em relação aos mesmos de 36%,
que pode ser devido às alterações que ocorrem nas trocas gasosas entre o tecido
pulmonar e o sistema sanguíneo arterial (Tabela_1).
Em relação à diferença alvéolo-arterial, observou-se nesta casuística,
diferença do grupo Ci em relação ao grupo Co superior à 100%, o que também foi
observado em estudo desenvolvido por LUO et al.(16), onde os animais
desenvolveram além de extensa diferença alvéolo-arterial, progressiva
hiperventilação e hipoxemia. Estes resultados são similares aos encontrados em
humanos.
BERTHELOT et al.(2), encontraram aumento no diâmetro das arteríolas do tecido
pulmonar em animais submetidos a LDB.
No presente estudo, fez-se a relação do peso do pulmão com o peso corporal
total (relação pneumossomática) (Tabela_1) e observou-se aumento do peso
pulmonar no grupo Ci em relação ao grupo Co, sendo que essas alterações podem
ser devidas ao shunt e à dilatação vascular intrapulmonar. Possivelmente, essas
alterações podem ter sido influenciadas pela congestão capilar intrapulmonar,
fator este não avaliado neste estudo.
A vasodilatação intrapulmonar presente nesses casos, pode estar associada à
translocação bacteriana, que ocorre devido à ausência ou diminuição de bile no
intestino delgado, leva à perda do efeito emulsificante e antiendotóxico dos
sais biliares, provocando níveis elevados de endotoxinas no intestino grosso,
que serão absorvidas através da circulação portal, favorecendo a translocação
bacteriana(6). Esta tem sido encontrada em 45%-75% dos animais com cirrose
experimental por LDB(21).
A lesão hepatocelular impede a adequada filtração do sangue portal, promovendo
o desenvolvimento de shunts portossistêmicos e dramática diminuição da
capacidade fagocitária do fígado, permitindo a entrada de bactérias e
endotoxinas na circulação pulmonar. Nessa situação, o pulmão filtra o sangue,
compensando o decréscimo da função fagocitária do fígado(21).
O aumento na atividade fagocitária pulmonar gera o acúmulo de macrófagos no
endotélio pulmonar. Durante a fagocitose, a ativação numerosa de macrófagos
secreta produtos para o meio extracelular, incluindo citocinas e óxido nítrico
(NO).
O NO age como um sinalizador molecular mediando a vasodilatação, quando
produzido em baixas concentrações pela óxido nítrico sintase (NOS) em células
vasculares endoteliais, e como fonte altamente tóxica oxidante, quando
produzido em altas concentrações pela NOS em macrófagos no processo patológico
(25).
As células fagocitárias têm bem caracterizada a geração de ânion superóxido
(O2), que é capaz de oxidar a membrana plasmática, produzindo grande quantidade
de espécies reativas do oxigênio (ERO)(25).
No presente estudo, a avaliação da LPO no homogeneizado de pulmão de ratos Co e
Ci pós-LDB demonstrou, pelas técnicas de TBA-RS e QL, aumento significativo da
peroxidação lipídica, possivelmente devido à ação de células fagocitárias no
combate ao processo de translocação bacteriana (Figura_1).
A migração de macrófagos para o pulmão leva à produção de radicais superóxido,
o que requer aumento da atividade enzimática antioxidante, vista no presente
trabalho, através do aumento significativo da atividade da SOD no homogeneizado
de tecido pulmonar no grupo cirrótico na tentativa de proteger o órgão da
agressão dos radicais livres aí formados (Figura_2).
Parece que o modelo de cirrose induzida por LDB contribui para o estudo da SHP,
visto que se observaram alterações da gasometria arterial, aumento da
lipoperoxidação e das defesas antioxidantes aqui representadas pela enzima SOD.
CONCLUSÕES
Os dados obtidos sugerem que o modelo experimental da LDB apresentou as
principais características da SHP e sugere-se que o mesmo possa ser utilizado
para futuros estudos envolvendo estresse oxidativo nas alterações hepáticas e a
sua relação com o sistema respiratório.
