Influência do método de extração do cinamono para controle da antracnose da
videira
INTRODUÇÃO
A antracnose da videira afeta todos os órgãos verdes da planta, desde folhas,
gavinhas, ramos, inflorescência até os frutos. Os sintomas iniciais se
manifestam por manchas foliares circulares, com margens marrons a negras e
bordos redondos ou irregulares. Nas bagas aparecem manchas circulares de cor
cinza no centro e preta nas bordas, comumente denominadas de olho-de-
passarinho (Grigoletti Jr e Sônego, 1993).
Para o controle dessa doença, deve-se aliar a escolha do local adequado de
plantio, com o uso de cultivares resistentes, material de propagação sadio,
adubação equilibrada, manejo correto da cultura, eliminação de plantas ou
partes vegetais doentes e o uso de fungicidas. Entretanto, o uso exclusivo de
produtos químicos para o controle da antracnose tem gerado aumento dos custos
de produção, dos riscos de intoxicação dos trabalhadores, da contaminação do
ambiente e da seleção de patógenos resistentes (Naves et al., 2006).
Considerando a necessidade da redução ou a eliminação do uso de substâncias
sintéticas que preconizam os sistemas sustentáveis de produção de frutas, a
busca de novas alternativas para o controle de doenças é imprescindível. Nesse
sentido, produtos naturais como extratos de plantas que apresentem substâncias
antifúngicas, podem oferecer alternativas aos fungicidas sintéticos. De acordo
com Hassanein et al. (2008) várias pesquisas com o cinamomo (Melia azedarach
L.), árvore da família Meliaceae, têm sido realizadas devido às suas
propriedades antifúngicas, bactericidas e inseticidas.
Abou-Jawdah et al. (2002) verificaram inibição da germinação de esporos de
Verticillium dahliae, Fusarium oxysporium f. sp. melonis, Cladosporium spp.,
Botrytis cinerea, Alternaria solani e Penicillium sp. em 100, 95, 87, 84, 75 e
53%, respetivamente, ao utilizarem o extrato de cinamomo obtido com solvente de
éter de petróleo. Posteriormente, Carpinella et al.(2003), verificaram por
testes de crescimento micelial que extratos hexânico e etanólico de frutos,
sementes e folhas de cinamomo demonstraram atividade fungistática contra
Diaphorte phaseolorum var. meridionales, Fusarium oxysporum, F. solani, F.
verticillioides e Sclerotinia sclerotiorum. In vivo, através de teste de
sanidade de sementes, o extrato aquoso de cinamomo apresentou toxicidade
máxima, resultando em uma supressão completa do crescimento micelial dos fungos
Aspergillus fumigatus e Penicillium spp. quando sementes de milho foram
desinfestadas durante 20 minutos com o extrato (Shafique et al., 2005).
Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar, in vitro, o efeito de
extrato de cinamomo, obtido por meio de diferentes metodologias, no crescimento
micelial e esporulação de Elsinoe ampelina (de Bary) Shear e o efeito do
extrato de cinamomo obtido por infusão no controle da antracnose da videira em
condições de campo.
MATERIAL E MÉTODOS
Frutos maduros de cinamomo com suas sementes foram coletados nos meses de abril
e maio de 2010, no Campus Cedeteg da Universidade Estadual do Centro-Oeste
(UNICENTRO), em Guarapuava/PR, e secos em estufa de ventilação forçada a 40 ºC,
por 48 horas. Em seguida, foram triturados em moinho de facas e armazenados em
sacos plásticos transparentes, durante quatro meses e em temperatura ambiente
de 22 a 25 °C.
Experimentos in vitro
Os experimentos in vitro seguiram o delineamento inteiramente casualizado em
esquema fatorial [(6 x 6) + 2], com cinco repetições e parcela experimental
constituída por uma placa de Petri. O fator principal constituiu-se das
metodologias de preparo do extrato de cinamomo e o fator secundário das
concentrações desses extratos, além de dois tratamentos padrões com calda
bordalesa e mancozebe.
O fator primário constituiu-se das seguintes metodologias de preparo do
cinamomo: 1) Pó em meio BDA: adição de frutos e sementes secos e moídos ao meio
de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) e posterior autoclavagem por 20 minutos a
120 °C e pressão de 1 atm; 2) Extrato aquoso em meio BDA: mistura de frutos com
sementes secos e moídos à água destilada (1:10 m/v), seguido de manutenção da
suspensão em repouso por 48 horas em recipiente fechado na presença de luz e
filtragem com tecido fino (Bogorni, 2003), com posterior adição ao meio BDA
antes da autoclavagem; 3) Extrato aquoso autoclavado: preparo semelhante à
metodologia 2, com esterilização do extrato em autoclave separadamente, antes
da adição ao meio BDA; 4) Extrato aquoso microfiltrado: o extrato aquoso de
cinamomo foi esterilizado através da filtragem em membrana Millipore® 0,22 µm;
5) Extrato aquoso ' geladeira: preparo semelhante à metodologia 2, com
suspensão em repouso por 24 horas no escuro e dentro da geladeira, seguido da
filtragem com tecido fino (Seffrin et al., 2008); 6) Infusão: adição de frutos
e sementes secos e moídos à água destilada fervente (1:10 m/v) em recipiente
fechado por 15 minutos e filtragem (Rosal et al., 2009).
Alíquotas dos extratos da terceira, quarta, quinta e sexta metodologias foram
adicionadas ao meio BDA fundente (Bastos e Albuquerque, 2004), enquanto as
outras foram esterilizadas junto ao meio BDA, em autoclave.
O isolado de E. ampelina foi obtido a partir de folhas com lesões provenientes
de vinhedos da região de Guarapuava-PR, o qual foi mantido em meio de cultura
BDA. Após dez dias de crescimento das colônias do isolado do patógeno, discos
de 5 mm de diâmetro foram retirados e colocados no centro de placas de Petri
com meio BDA com os diferentes tratamentos, e incubadas em câmara de
crescimento BOD a 25 ± 1 ºC, por oito dias, no escuro.
Para cada metodologia foram utilizados os seguintes tratamentos: 0, 10, 20, 30,
40 e 50 mL.L-1 de extrato de cinamomo, preparados a partir da solução padrão na
proporção 1:10 (1g de pó de cinamomo em 9 mL de água destilada) para os
extratos dois ao seis e, adicionados (pó de cinamomo) conforme os tratamentos
citados, diretamente ao meio BDA antes da autoclavagem para o extrato um, além
de 80% de calda bordalesa na proporção 1:1:100 (sulfato de cobre:cal virgem:
água) e mancozebe 2,5 g p.c..L-1 (Manzate® 800, fabricado por Du Pont do Brasil
S.A.). As avaliações foram 48, 96 e 144 horas após a repicagem, por meio de
duas medidas opostas do diâmetro do micélio com paquímetro digital.
Para a quantificação dos esporos, foram adicionados 10 mL de água destilada
autoclavada, por placa de Petri, utilizando-se alça de Drigalski para
espalhamento. Em seguida, raspou-se a superfície da colônia para a liberação
dos esporos, obtendo-se a suspensão. Uma alíquota de 20 µL da suspensão foi
colocada em câmara de Neubauer para determinar a concentração de esporos, ao
microscópio ótico, estabelecendo-se uma média de quatro leituras (Carnaúba et
al., 2007).
Os resultados foram submetidos à análise de variância e regressão polinomial ao
nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico SISVAR
(Ferreira, 2008).
Experimento em campo
O experimento foi conduzido em Guarapuava, Paraná, de setembro a dezembro de
2010, em vinhedo comercial da cultivar Isabel enxertada sobre porta-enxerto
'Paulsen 1103', conduzido em sistema de espaldeira em espaçamento 2,5 x 2,0 m,
com três anos de idade e manejado seguindo o sistema orgânico, onde utilizaram-
se para o controle de doenças, nos três anos anteriores, quitosana, extratos
aquosos de alho e cinamomo.
Para esse experimento optou-se pelo extrato aquoso de cinamomo obtido por
infusão devido a sua eficiência no controle do míldio da videira (Plasmopara
viticola (Berk. & M.A. Curtis) Berl & De Toni), conforme resultado de
trabalhos preliminares, além de sua facilidade de obtenção pelo produtor.
Os tratamentos consistiram das diferentes concentrações do extrato de cinamomo
(0, 10, 20, 30, 40 e 50 mL.L-1), com a adição de óleo mineral a 2,5 mL.L-1
(Natur' L Óleo®, Empresa Stoller do Brasil LTDA) como adjuvante, além da calda
bordalesa e da testemunha absoluta somente com água. Por se tratar de um
vinhedo orgânico, não foi possível utilizar o fungicida convencional mancozebe
como padrão.
As pulverizações foram realizadas semanalmente, com pulverizador manual (P-1500
Brudden®, bico cone regulável), até o ponto de escorrimento, a partir do
início da brotação em 21/09/2010, totalizando 15 aplicações. Com o início dos
primeiros sintomas, em 26/10/2010, a severidade da antracnose foi avaliada em
três folhas do ápice de quatro ramos por planta, previamente identificadas,
utilizando-se a escala diagramática descrita por Azevedo (1997).
Com os dados da severidade foi determinada a área abaixo da curva de progresso
da doença (AACPD), segundo Shaner e Finney (1977). No total foram realizadas
oito avaliações no período de 26/10/2010 a 14/12/2010, com intervalos de sete
dias. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso contendo oito
tratamentos e cinco repetições, com parcela experimental constituída por uma
planta.
Os resultados foram submetidos à análise de variância e quando significativo
realizou-se a comparação de médias pelo teste de Tukey e análise de regressão
polinomial ao nível de 5% probabilidade, através do programa estatístico SISVAR
(Ferreira, 2008).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimentos in vitro
Para as variáveis, crescimento micelial e esporulação, houve interação
significativa entre tipos e concentrações de extratos, constatando-se que os
efeitos dos fatores são dependentes. Sendo que, no extrato aquoso
microfiltrado, o crescimento micelial e a esporulação foram menores.
Em relação à inibição do crescimento micelial de E. ampelina, observou-se que
houve efeito linear negativo das concentrações de cinamomo para todas as
metodologias testadas (Figura_1).
Ao comparar as metodologias utilizadas, a maior inibição do crescimento
micelial foi verificada para o extrato aquoso microfiltrado, enquanto que o
pior desempenho foi observado para o extrato com pó em meio BDA. Os outros
extratos apresentaram desempenho intermediário sobre a redução do crescimento
micelial do fitopatógeno.
Chagas e Vieira (2007) explicaram que, às vezes, há problemas em alcançar uma
correlação linear entre a concentração e eficácia porque, em um extrato, as
substâncias bioativas podem não ser distribuídas homogeneamente no interior do
material, ou pode ser afetado por meio da técnica ou processo usado para
produzir o extrato, o que possivelmente justificaria a baixa eficiência dos
extratos com pó em meio BDA, por infusão, aquoso em meio BDA, aquoso
autoclavado e aquoso - geladeira.
Porém, apesar da baixa inibição do crescimento micelial do patógeno gerada por
alguns dos extratos de cinamomo utilizados neste trabalho, Carpinella et al.
(2005) afirmaram que o cinamomo possui atividade antifúngica, que se dá pela
presença dos compostos escopoletina hidroxicumarina, vanilina, 4-hidroxi-3-
metoxicinamaldeido e (±) pinoresinol, isolados de frutos maduros com sementes.
Adicionalmente, Jabeen et al. (2008) encontrou os seguintes compostos em
extrato de folhas de cinamomo: β-amirina, ácido ursólico, ácido benzóico e 3,5-
ácido benzóico dimetoxi.
Posteriormente, Yang et al. (2011) descreveram 79 compostos voláteis presentes
em M. azedarach. Entre os 79 descobertos neste estudo, 64 compostos foram
relatados pela primeira vez, e desses, muitos apresentam várias funções, como o
ácido octanóico que é utilizado no tratamento de candidíase e infeções
bacterianas.
Anteriormente, Carpinella et al. (1999) já haviam demonstrado atividade
fungistática e fungicida de extrato etanólico de frutos de cinamomo sobre
Aspergillus flavus e Fusarium moniliforme, e Jabeen et al. (2008) relataram que
o extrato de folhas de cinamomo suprimiu o crescimento in vitrode Ascochyta
rabiei.
Em relação aos efeitos dos extratos testados, as melhores concentrações foram
40 e 50 mL.L-1, apresentando maiores reduções e diferindo-se da concentração de
10 mL.L-1 que se apresentou semelhante à testemunha (0 mL.L-1). Para a maior
concentração testada (50 mL.L-1), o efeito do extrato aquoso microfiltrado não
diferiu do efeito da calda bordalesa, ambos reduzindo o crescimento micelial do
fitopatógeno em 99,27 e 99,23% quando comparados aos extratos com pó em meio
BDA e por infusão, respetivamente, que apresentaram menor inibição (Figura_2A).
Resultados semelhantes em relação ao baixo desempenho, também foram obtidos por
Zafar et al. (2002), que verificaram que o extrato aquoso de cinamomo foi
desprovido de qualquer atividade antifúngica sobre vários microrganismos, assim
como os extratos com pó em meio BDA e por infusão analisados neste trabalho. O
mesmo ocorreu com Milanesi et al. (2009) que, ao analisarem o extrato de
cinamomo incorporado ao meio BDA sobre o crescimento micelial de Colletotrichum
gloeosporioides, verificaram que o mesmo não se mostrou efetivo no controle.
Quando a variável tempo foi considerada, observou-se que a partir de 72 h de
exposição ao extrato, houve estímulo no crescimento micelial do fitopatógeno.
Em relação à variável concentração (5, 10, 15, 20, 25 e 30%), todas as
utilizadas estimularam o crescimento do fungo.
Do mesmo modo, o extrato hexânico de cinamomo demonstrou ação semelhante,
apresentando propriedades antifúngicas fracas contra os microrganismos
testados. Mesmo assim, o extrato hexânico ainda apresentou um efeito inibitório
sobre Hyloflora ramosa (6,30 ± 0,84 mm), Aspergillus niger (5,28 ± 0,40 mm) e
Fusarium chlamdosporum (5,28 ± 0,74 mm). Além disso, o extrato com clorofórmio
de M. azedarach apresentou propriedade antifúngica apenas contra F.
chlamdosporum (6,60 ± 1,02 mm), e o extrato etanólico foi ativo apenas sobre H.
ramosa com uma zona de inibição de apenas 3,96 ± 0,53 mm, em comparação com o
padrão de referência, em que a zona de inibição foi de 18,05 ± 1,72 mm (Zafar
et al., 2002).
As concentrações de 30, 40 e 50 mL.L-1 de extrato aquoso microfiltrado
reduziram o crescimento micelial em 82,2, 92,9 e 99,4%, respectivamente, as
quais se igualaram a calda bordalesa e diferiram da testemunha. De acordo com
Milanesi et al. (2006), resultados semelhantes foram verificados ao utilizar o
extrato aquoso de cinamomo microfiltrado sobre o crescimento micelial de
Fusarium solani, isolado da cultura da soja, em que as concentrações 3, 5, 7,
10, 15, 20 e 30% proporcionaram inibição do crescimento micelial entre 61 e
80%, sendo que a maior inibição foi verificada após 48 h de incubação.
Sobre a inibição da esporulação de E. ampelina, houve efeito quadrático das
concentrações do extrato de cinamomo para todas as metodologias (Figura_3). As
maiores reduções foram verificadas para o extrato aquoso microfiltrado, seguido
do extrato aquoso autoclavado, provavelmente devido à maior extração dos
compostos antifúngicos presentes nos frutos de cinamomo por meio da técnica ou
processo usado para produzir esses extratos, como sugerido por Chagas e Vieira
(2007).
Apesar das metodologias, extrato aquoso autoclavado, aquoso em meio BDA e
infusão se igualarem quanto à redução do crescimento micelial do fitopatógeno.
O mesmo não foi observado em relação à esporulação, pois, apesar da baixa
inibição de crescimento micelial, o extrato aquoso autoclavado reduziu em uma
proporção muito maior a esporulação, se aproximando do melhor extrato (aquoso
microfiltrado) e diferindo-se dos extratos que apresentaram um desempenho
inferior, inclusive dos que se assemelharam quanto à inibição do crescimento
micelial. Ou seja, apesar do extrato aquoso autoclavado não impedir o
crescimento micelial do patógeno, reduziu significativamente a esporulação,
atuando na disseminação e propagação do fungo em condições de campo, sugerindo-
se uma boa alternativa de controle associada a outros métodos.
Além disso, neste trabalho, os efeitos de todas as concentrações do extrato
aquoso microfiltrado não diferiram dos efeitos da calda bordalesa e do
mancozebe, diferindo-se apenas do tratamento testemunha (0 mL.L-1). As reduções
sobre a esporulação de E. ampelina com o extrato aquoso microfiltrado variaram
de 77,6 a 100% desde a menor concentração (10 mL.L-1 ) até 50 mL.L-1 de
extrato.
Sobre o extrato aquoso autoclavado, as concentrações de 20, 30, 40 e 50 mL.L-
1 não diferiram dos tratamentos padrões e reduziram em 43, 53, 59 e 51%,
respectivamente. A concentração de 10 mL.L-1 se assemelhou ao tratamento com
mancozebe e reduziu a esporulação do fitopatógeno em 40%. Todavia, apesar dos
tratamentos 10, 20, 30 e 50 mL.L-1 de extrato não diferirem dos tratamentos
padrões, também se assemelharam do tratamento testemunha.
Resultados inferiores foram verificados para o pó em meio BDA, infusão e
extrato aquoso em meio BDA, que exibiram aumento de esporulação (Figura_2B),
apesar do último não diferir do extrato aquoso autoclavado. Provavelmente, o
baixo desempenho desses extratos sobre a esporulação do fungo é devido à rápida
degradação das substâncias inibitórias do cinamomo, resultando na redução da
atividade antifúngica do mesmo sobre os esporos de E. ampelina (Bavaresco,
2007).
Em conjunto, estes resultados mostram a variação da atividade antimicrobiana in
vitropara diferentes extratos de cinamomo, isto é, devido a diferentes métodos
de extração ou separação dos ingredientes ativos.
Experimento em campo
Para os resultados de AACPD as concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50 mL.L-1 de
extrato obtido por infusão apresentaram decréscimo de 51,0, 43,1, 57,6, 53,1 e
56,3%, respetivamente, em que todas as concentrações não diferiram
estatisticamente dos tratamentos com calda bordalesa e óleo mineral (0 mL.L-
1 de extrato) - Figura_4.
Nesse caso, não se observou efeito aditivo do óleo vegetal ao extrato aquoso de
cinamomo, como verificado por Leite (2010) quando utilizado como adjuvante ao
extrato de alho sobre a severidade de doenças foliares em videira. Leite (2010)
reduziu em 52% a AACPD do míldio da videira em relação à testemunha absoluta ao
utilizar óleo vegetal a 2,5 mL.L-1, potencializando o extrato de alho.
Provavelmente, de acordo com os resultados obtidos neste trabalho, o óleo
vegetal mascarou os efeitos do extrato de cinamomo, além de ser efetivo no
controle da doença, quando aplicado separadamente. Outro fator sugere que a
baixa ação do extrato pode ter ocorrido pelo uso de frutos maduros de cinamomo
para o seu preparo pois, conforme Brunherotto e Vendramim (2001) sugerem, o
extrato de frutos maduros de cinamomo apresenta efeito inferior ao de frutos
verdes ou de folhas, devido à menor quantidade de ingredientes ativos, o que é
coerente do ponto de vista de sobrevivência vegetal, uma vez que, nos frutos
maduros, as sementes já estão completando a sua maturidade fisiológica e, por
isso, têm menor necessidade de defesa química contra herbívoros.
Porém, estudos de Xuan et al. (2005) apresentaram reduções das infeções
causadas pelos patógenos Pyricularia grisea e Thanatephorus cucumeris em campos
de arroz ao se aplicar extratos de cinamomo. Assim como Cogo et al. (2011), que
ao pulverizarem extrato aquoso de folhas de cinamomo a 10% em plantas de café
inoculadas com o fitopatógeno Cercospora caffeicola, obtiveram reduções na
incidência da cercosporiose.
Cavoski et al. (2012), ao analisarem tratamentos com extrato aquoso de cinamomo
nas proporções 1:5 e 1:10 (m/v) em plantas de pepino sobre o controle de
nematoide Meloidogyne incognita, observaram reduções na atividade das enzimas
antioxidantes catalase e peroxidase, além de desencadear a defesa do
hospedeiro, sugerindo uma potencial indução de resistência gerada pelo extrato
de cinamomo. Pereira (2006) explica que normalmente os indutores de resistência
não atuam sobre o patógeno, contudo, em alguns casos, como provavelmente
ocorreu no trabalho de Cavoski et al. (2012), os indutores podem atuar
induzindo resistência e ao mesmo tempo afetar o patógeno diretamente,
dependendo das dosagens utilizadas.
CONCLUSÕES
A metodologia que obteve controle do crescimento micelial de Elsinoe ampelina
foi o extrato aquoso de cinamomo microfiltrado, enquanto que para a esporulação
tanto o extrato aquoso de cinamomo microfiltrado quanto o extrato aquoso
autoclavado apresentaram reduções. As concentrações de 30, 40 e 50 mL.L-1 de
extrato aquoso de cinamomo microfiltrado reduziram o crescimento micelial de E.
ampelina. A partir de 20 mL.L-1 de extrato aquoso de cinamomo microfiltrado
houve inibição total da esporulação de E. ampelina. O óleo vegetal a 0,25%
controlou a severidade da antracnose da videira em condições de campo,
independentemente da adição de extrato de cinamomo, mascarando o seu efeito.
