Síntese de análogo de brassinoesteróide a partir de vespertilina
INTRODUÇÃO
A partir de 1970, diversos grupos de trabalhos divulgaram que extratos
lipossolúveis de muitas fontes vegetais, continham substâncias que promoviam
alongação e divisão celular de plantas1-3. A descoberta e determinação
estrutural de um novo tetra-hidróxi-esteróide, isolado do pólen da planta
Brassica napusL., denominado brassinolídeo, marcou o início de um novo período
de investigações de sistemas hormonais reguladores do crescimento de organismos
vegetais4-6.A característica estrutural deste novo composto, determinada
através de cristalografia de raio-X, consiste na presença de um grupo metila no
carbono, C-24, de configuração S, uma lactona 6-ceto-7-oxa no anel B e
hidroxilas vicinais, 2a,3a no anel A e nos carbonos, C-22 e C-23, de
configuração R7-8.
A partir de diversas fontes vegetais foram isolados vários compostos que
possuem similaridades estruturais e funcionais ao brassinolídeo. Estes
compostos, que receberam o nome genérico de Brassinoesteróides (BS), constituem
uma nova classe de fito-hormônios, responsáveis por promover o crescimento de
plantas9-13. Todos os BS de ocorrência natural são derivados de 5a-colestanos e
estão inseridos em grupos de esteróides contendo de 27 a 29 átomos de carbono,
como fitoesteróides típicos. Os BS estão ainda agrupados, de acordo com os
estágios de oxidação do anel B, em 7-oxa-lactônicos, 6-cetônicos, e os não
oxidados (Fig._1)14,15.
Entre as principais características apresentadas pelos BS podemos citar a
habilidade de atuar com um potente efeito biológico sobre a balança hormonal em
concentrações muito baixas (5 x 10-4- 5 x 10-3mg/mL), ativar os processos
metabólico e de crescimento, aumentar a produtividade total da planta e
melhorar sua resistência a condições climáticas adversas. A este conjunto de
propriedades deu-se o nome de atividade brassínica.
O interesse pela síntese de BS foi despertado por uma série de fatores, entre
os quais citamos a baixa concentração nas fontes naturais (10-5 - 10-12 %),
tornando difícil e de alto custo o seu isolamento e os efeitos notáveis
apresentados sobre os organismos vegetais em concentrações muito baixas16.
Já é possível encontrar na literatura estudos que estabelecem algumas relações
estrutura/atividade para se obter uma alta atividade brassínica17,18.Sabe-se
que é necessário a existência de dois grupos hidroxila nas posições 22R, 23R da
cadeia lateral, bem como a presença de um grupo metila ou etila 24S e de um
grupo hidroxila 3a. Verificou-se ainda que os compostos 7-oxa-lactônicos são
mais ativos que os compostos 6-cetônicos, bem como os compostos com um grupo
lactona 6-ceto-7-oxa (lactona normal) são mais ativos que os compostos que
possuem a lactona 7-ceto-6-oxa (lactona isomérica). O decréscimo de atividade
para os dióis segue a ordem: 2a,3a > 2a,3b > 2b,3a > 2b,3b.
Apesar de importantes, estas características gerais não são rígidas, uma vez
que vários exemplos citados na literatura apresentam estruturas que possuem
atividade brassínica e não apresentam todas as funções citadas19.
O isolamento do alcalóide esteroidal solasodina, a partir de espécies de
Solanumdo DF, vem sendo efetuado em nosso laboratório desde 1993, com o
objetivo de sua transformação em 16-desidropregnenolona, matéria prima de
fármacos esteroidais. Nosso interesse na química de brassinoesteróides surgiu
da possibilidade de sintetizar análogos de BS a partir da vespertilina,
baseados nas atividades mostradas por alguns análogos de BS para culturas de
arroz e feijão. Estes análogos de BS foram sintetizados a partir da diosgenina
e derivados pregnanos e androstanos19,20.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho, apresentamos os resultados obtidos a partir das modificações
nos anéis A e B da estrutura da vespertilina, para obtenção de um análogo de
BS, com as características funcionais, 2a,3a-di-hidróxi-6-ceto, típica da
castasterona, brassinoesteróide de ocorrência natural.
Iniciamos nosso trabalho sintetizando, a partir do alcalóide esteroidal
solasodina21, a lactona 22,16 do ácido 3b,16b-di-hidróxi-5-bisnorcolênico
(vespertilina), utilizando as etapas sintéticas publicadas por Sato e
colaboradores22,23. Os rendimentos e a pureza dos intermediários e do produto
final estão de acordo com os dados da literatura utilizada.
A primeira etapa na preparação do análogo de BS consistiu em transformar o
grupo 3b-OH em um bom grupo abandonador por tosilação.
Seguindo a rota planejada (esquema 3), preparamos o derivado 3,5-ciclo-6-
hidróxi-vespertilina (V2), por solvólise do tosilato de vespertilina. O
mecanismo do rearranjo à 3,5-ciclo-esteróides a partir solvólise de tosilatos
está demonstrado no esquema 124.
Introduzimos algumas modificações no procedimento de elaboração desta reação
descrita no trabalho de Steele e Mossetig,25 com as quais diminuímos o tempo
elaboração de 24 a 48 horas para 1 hora. A oxidação de V2, foi efetuada com o
reagente de Jones, onde obtivemos V3 com rendimento de 98% muito superior ao da
literatura
A etapa seguinte consistiu na clivagem do anel ciclopropano e formação da dupla
2,3 no anel A. Para esta reação utilizamos o procedimento descrito por Mori e
colaboradores26.
Uma proposta mecanística da clivagem do anel ciclopropano e formação da dupla
D2 pode ser representada como mostrado no esquema 2.
A oxidação da dupla D2, visando a obtenção do análogo de BS 2a,3a-di-hidróxi-6-
ceto-vespertilina (V5), foi realizada com tetróxido de ósmio.
Os resultados da rota sintética desenvolvida para obtenção do análogo de BS a
partir de vespertilina estão resumidos no esquema 3.
PARTE EXPERIMENTAL
Os reagentes e solventes P.A. (Merck, Aldrich, Fluka, Vetec) foram utilizados
sem purificação prévia, exceto quando a reação exigia condições anidras.
O controle das reações foi realizado através de cromatografia em placa de
camada delgada (CCD), empregando silicagel 60F254 suportada em alumínio
(Merck), utilizando como reveladores: a) vapores de iodo, b) solução 5% de
ácido fosfomolíbdico em etanol e c) solução de vanilina em ácido sulfúrico (d =
1,25 g mL-1) / etanol.
Os espectros no infravermelho (IV) foram registrados no espectrômetro Nicolet
5ZDX-FT e no Bomem Hartmann & Brawn MB-Series.
Os pontos de fusão foram determinados no bloco de Köfler e estão registrados
sem correção.
O material de partida, vespertilina, foi obtido por degradação do alcalóide
esteroidal solasodina, isolado de frutos de espécies de Solanum coletadas no
Distrito Federal. A vespertilina apresentou p.f. 225-226oC, alta pureza por CCD
e dados de Infravermelho e RMN 1H e 13C idênticos aos descritos na literatura.
IV (KBr) nmáx cm-1: 3440 (nOH), 2947-2845 (nCH-sp3), 1668 (nC=C), 1770 (nCO-
éster), 1452-1343 (dCH2 + CH3)
RMN 1H (CDCl3 200 MHz) d: 5,35 (m, H-6), 4,93 (m, H-16) 3,50 (m, H-3), 1,30 (d,
3H-21), 1,02 (s, 3H-19) 0,75 (s, 3H-18).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 181,4 (C-22), 140,8 (C-5), 120,8 (CH-6), 82,7 (CH-
16), 71,4 (CH-3), 58,7 (CH-17), 54,6 (CH-14), 49,9 (CH-9), 42,0 (CH2-4), 41,3
(C-13), 38,0 (CH2-12), 37,1 (CH2-1), 36,4 (C-10), 35,9 (CH-20) 32,9 (CH2-15),
31,7 (CH2-7), 31,3 (CH2-2), 31,1 (CH-8) 20,2 (CH2-11), 19,2 (CH3-19), 16,4
(CH3-18), 13,6 (CH3-21).
Tosilato de vespertilina (V1)
Em um balão (150 mL), foram adicionados vespertilina (2,0 g, 5,80 mmol),
piridina (60 mL, tratada com KOH e recém destilada) e cloreto de tosila (4,0 g,
21 mmol). A mistura foi mantida sob agitação por 24 h à temperatura ambiente.
Ao final desse tempo, a mistura foi transferida para um béquer (1000 mL). À
mistura, sob agitação magnética, foram adicionadas lentamente pequenas porções
de água até obtençãode um precipitado, que foi coletado por filtração a vácuo,
lavado com água em abundância (~1000 mL) e seco em dessecador a vácuo, rendendo
um sólido branco (2,66 g, 92%), p.f. 164-165oC.
IV (KBr) nmáx cm-1: 2947-2845 (nCH-sp3), 1668 (nC=C), 1754 (nCO-éster), 1599-
1495 (aromático), 1452-1343 (dCH2 + CH3), 1335-1171 (SO2), 1034 (nC-O-C).
RMN 1H (CDCl3 200 MHz) d: 7,87 (d, 2H-tosila-O), 7,37 (d, 2H-tosila-O), 5,33
(m, H-6), 4,94 (m, H-16) 4,34 (m, H-3), 2,47 (s, 3H-tosila-O), 1,30 (d, 3H-21),
0,99 (s, 3H-19) 0,74 (s, 3H-18).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 181,3 (C-22), 144,4 (C-1-Ts), 134,4 (C-4-Ts), 138,5
(C-5) 129,7 (CH-3-Ts), 127,4 (CH-2-Ts), 122,7 (CH-6), 82,5 (CH-16), 81,9 (CH-
3), 58,7 (CH-17), 54,5 (CH-14), 49,6 (CH-9), 41,3 (C-13), 38,6 (CH2-12), 37,8
(CH2-4) 36,7 (CH2-1), 36,2 (C-10), 35,9 (CH-20), 32,9 (CH2-15), 31,6 (CH2-7),
30,9 (CH-8), 28,4 (CH2-2), 21,5 (CH3-Ts), 20,1 (CH2-11), 19,0 (CH3-19), 17,9
(CH3-18), 13,5 (CH3-21).
3,5-ciclo-6-hidróxi-vespertilina (V2)
A uma solução de tosilato de vespertilina (2,5 g, 5,01 mmol) em acetona (50 mL)
foi adicionada uma solução de acetato de sódio (2,5 g, 24,40 mmol) em água
(12,5 mL). A mistura foi deixada em refluxo sob agitação magnética por 6 h.
Após resfriamento, evaporou-se aproximadamente metade do solvente e a mistura
foi extraída com acetato de etila (3 x 30 mL). A fase orgânica foi lavada com
água (2 x 30 mL), solução saturada de bicarbonato de sódio (30 mL) e solução
saturada de cloreto de sódio (30 mL). Após secagem com sulfato de sódio e
evaporação do solvente a pressão reduzida, foi obtido um sólido branco (1,71 g,
99%), p.f. 153-156oC.
IV (KBr) nmáx cm-1: 3530 (nOH), 3020 (nCH-sp2) 2951-2868 (nCH-sp3), 1754 (nCO-
éster), 1453-1343 (dCH2 + CH3), 1049 (nC-O-C).
RMN 1H (CDCl3 200 MHz) d: 4,98 (m, H-16), 3,28 (m, H-6), 1,34 (d, 3H-21), 1,08
(s, 3H-19) 0,82(s, 3H-18), 0,49-0,30 (m, 2H-4).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 181,3 (C-22) 82,7 (CH-16), 73,1 (CH-6), 58,6 (CH-17),
54,8 (CH-14), 47,6 (CH-9), 42,8 (C-10), 41,7 (C-13), 38,6 (C-5), 38,4 (CH2-12),
37,0 (CH2-7), 35,9 (CH-20), 33,0 (CH2-1), 32,8 (CH2-15), 29,2 (CH-8), 24,8
(CH2-2), 24,0 (CH-3), 21,8 (CH2-11), 19,3 (CH3-19), 17,9 (CH3-18), 13,7 (CH3-
21), 11,5 (CH2-4).
3,5-ciclo-6-ceto-vespertilina (V3)
Em um balão (250 mL) foram adicionados 3,5-ciclo-6-hidróxi-vespertilina (1 g,
2,90 mmol) e acetona (80 mL). A solução foi resfriada com uma mistura água/gelo
até 15oC, sob agitação magnética. À mistura reacional foi adicionado o reagente
de Jones (2 x 0,66 mL), em intervalo de 5 minutos. Após 5 minutos da segunda
adição do oxidante, adicionou-se etanol (12 mL), permanecendo sob agitação por
mais 10 minutos. Em seguida, adicionou-se tolueno (2 x 130 mL) e a mistura foi
mantida sob agitação vigorosa por 30 minutos e filtrada em um funil
sinterizado. As porções de tolueno foram reunidas e lavadas com solução
saturada de cloreto de sódio (3 x 50 mL), bicarbonato de sódio 5% (50 mL) e
solução saturada de cloreto de sódio (50 mL). Após secagem com sulfato de
sódio, a solução foi filtrada para um balão (500 mL), seguida da adição de
silicagel 60 (5 g, 0,05-0,20 mm), permanecendo sob agitação por 1 h. A mistura
foi filtrada e após evaporação do solvente a pressão reduzida, foi obtido um
sólido branco (980 mg, 98%), p.f. 242-244oC.
IV (KBr) nmáx cm-1: 3020 (nCH-sp2)2949-2868 (nCH-sp3), 1773 (nCO-éster), 1679
(nCO), 1455-1378 (dCH2 + CH3).
RMN 1H (CDCl3 200 MHz) d: 5,01 (H-16), 1,33 (d, 3H-21) 1,03 (s, 3H-19), 0,81
(s, 3H-18), 0,71 (m, 2H-4).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 208,6 (CO-6), 180,9 (C-22), 82,9 (CH-16), 58,6 (CH-
17), 54,8 (CH-14), 46,5 (C-10), 46,1 (C-5), 45,9 (CH-9), 44,5 (CH2-7), 41,7 (C-
13), 37,9 (CH2-12), 35,9 (CH-20), 35,4 (CH-8), 33,9 (CH-3), 33,2 (CH2-1), 32,7
(CH2-15), 25,7 (CH2-2), 22,0 (CH2-11), 19,6 (CH3-19), 17,8 (CH3-18), 13,7 (CH3-
21), 11,7 (CH2-4).
2,3-en-6-ceto-vespertilina (V4)
Uma mistura de 3,5-ciclo-6-ceto-vespertilina (744 mg, 2,17 mmol), ácido p-
toluenossulfônico (99 mg, 0,57 mmol), brometo de sódio (134 mg, 1,30 mmol) em
dimetilformamida (11 mL, recém destilada) foi refluxada por 4 horas. Em
seguida, a mistura foi extraída com acetato de etila (2 x 30 mL), lavada com
água (3 x 20 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (30 mL). Após secagem
com sulfato de sódio e evaporação do solvente a pressão reduzida, obteve-se um
resíduo, que foi solubilizado em diclorometano (50 mL). À solução foi
adicionada silicagel 60 (2,5 g, 0,05-0,20 mm) permanecendo a mistura sob
agitação por 1 h. A mistura foi filtrada em um funil sinterizado e o solvente
evaporado a pressão reduzida. O resíduo foi cromatografado em coluna de sílica
(10 g), tendo como eluente hexano: acetato de etila 1:1. Após evaporação do
solvente a pressão reduzida foi obtido um sólido branco (605 mg, 81%), p.f.
185-187oC.
IV (KBr) nmáx cm-1: 3027 (nCH-sp2), 2949-2868 (nCH-sp3), 1770 (nCO-éster), 1706
(nCO), 1455-1342 (dCH2 + CH3).
RMN 1H (CDCl3 200 MHz) d: 5,78 (m, 2H-2,3), 5,00 (m, H-16), 1,35 (d, 3H-21),
0,82 (s, 3H-18), 0,73 (s, 3H-19).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 210,7 (CO-6), 180,9 (C-22), 124,8 (CH-3), 124,2 (CH-
2), 82,1 (CH-16), 58,7 (CH-17), 54,6 (CH-14), 53,6 (CH-5), 53,1 (CH-9), 46,9
(CH2-7), 41,8 (C-13), 39,7 (C-10), 39,1 (CH2-12), 37,5 (CH2-1), 36,7 (CH-8),
35,9 (CH-20) 32,6 (CH2-15), 21,5 (CH2-4), 20,3 (CH2-11), 17,8 (CH3-18), 13,6
(CH3-21), 13,4 (CH3-19).
2a,3a-di-hidróxi-6-ceto-vespertilina (V5)
Em um balão (100 mL), foram adicionados 2,3-en-6-ceto-vespertilina (420 mg,
1,22mmol), N-metilmorfolina-N-óxido (444 mg, 1,22 mmol) e uma mistura de
solventes t-butanol/THF/água 10:8:1 (38 mL). Em seguida, uma solução de OsO4
(57 mg, 0,22 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada e a mistura foi mantida sob
agitação por 24 h à temperatura ambiente. À mistura reacional foi adicionada
uma solução de NaHSO3 32% (10 mL) permanecendo sob agitação por 1 h. Em
seguida, a mistura foi extraída com acetato de etila (2 x 30 mL) e lavada com
solução saturada de cloreto de sódio (3 x 20 mL). Após secagem com sulfato de
sódio e evaporação do solvente a pressão reduzida, foi obtido um sólido branco
impuro por CCD. Cromatografia em alumina neutra eluída com clorofórmio-acetona
13:1 forneceu o composto desejado. (434mg, 94%). p.f. 255oC.
IV (KBr) nmáx cm-1: 3484 (nOH) 2952-2872 (nCH-sp3), 1748 (nCO-éster), 1700
(nCO-cetona), 1438-1368 (dCH2 + CH3), 1250-1041 (nC-O-C).
RMN 1H (CDCl3 90 MHz) d: 5,01 (m, H-16), 3,98 (m, H-2a), 3,70 (m, H-3a), 2,68
(m, H-5), 1,34 (d, 3H-21), 0,78 (s, 6H-18,19).
RMN 13C (CDCl3 50 MHz) d: 211,1 (CO-6), 181,0 (C-22), 82,4 (CH-16), 68,8 (CH-
2), 68,3 (CH-3), 58,7 (CH-17), 54,4 (CH-14), 53,7 (CH-5), 51,3 (CH-9), 46,6
(CH2-7), 42,0 (C-13), 41,0 (CH-8), 37,6 (CH2-1), 36,7 (CH2-12), 36,2 (CH-20)
32,8 (CH2-15), 27,8 (CH2-4), 20,7 (CH2-11), 17,8 (CH3-18), 13,6 (CH3-21), 13,4
(CH3-19).
CONCLUSÃO
De acordo com a nossa proposta de síntese do análogo de brassinoesteróide a
partir de vespertilina, conseguimos obter os intermediários necessários (V1 -
V4) em excelentes rendimentos, bem como o composto desejado 2a,3a-di-hidróxi-6-
ceto-vespertilina. Além de apresentar as características estruturais dos anéis
A e B idênticas a uma série de brassinoesteróides possuidores de atividade
brassínica, este novo análogo apresenta ainda uma função oxigenada (lactona) no
anel E. Vários ensaios da atividade biológica sugerem que a presença de funções
oxigenadas, em C-22 e C-23 da cadeia lateral, assim como ésteres de sistemas
pregnanos em C-20 e androstanos em C-17, aumentam a atividade brassínica destes
fito-hormônios.
