Uso de marcadores moleculares na análise da variabilidade genética em acerola
(Malpighia emarginata D.C.)
USO DE MARCADORES MOLECULARES NA ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM ACEROLA
(Malpighia emarginataD.C.)1
INTRODUÇÃO
A acerola (Malpighia emarginata) é uma planta típica de países de clima
tropical, com seu centro de origem na região do Mar das Antilhas, Norte da
América do Sul e América Central. A classificação botânica da acerola tem sido
controvertida e, apesar da adoção do nome Malpighia emarginata D.C. pelo
Conselho Internacional de Recursos Genéticos Vegetais em 1986, essa denominação
ainda é pouco utilizada (Alves & Menezes, 1995). No Brasil, a acerola é
conhecida há mais de 50 anos. Porém, somente no início dos anos 80, a cultura
mostrou uma expansão considerável da área de cultivo, devido ao interesse
comercial pelos seus frutos que concentram alto teor de ácido ascórbico (Neto
et al., 1995).
A inexistência de variedades definidas de acerola no Brasil é um dos principais
fatores que, aliados ao plantio de mudas obtidas por sementes, leva à grande
desuniformidade na produção anual de frutos por planta. Este fato tem causado
sérias dificuldades para os produtores, gerando perdas na produtividade e na
qualidade dos frutos. Em razão disso, a preservação da variabilidade genética
da acerola, mediante a constituição de bancos de germoplasma, tem grande
importância tanto do ponto de vista da conservação biológica como da aplicação
no melhoramento genético.
As pesquisas genéticas com acerola baseiam-se em caracteres agronômicos e
marcadores morfológicos (Carpentieri-Pípolo et al., 2000 a, b; Gomes et
al.,2000). No entanto, estes marcadores existem em número limitado, e sua
expressão gênica pode estar sujeita às variações do ambiente. Marcadores
moleculares têm sido usados com sucesso na análise genética de plantas e na
caracterização da variabilidade contida em bancos de germoplasma.
Caracterização de clones de acerola foi realizada por Freitas et al. (1995) com
os sistemas isoenzimáticos peroxidase-esterase. Os resultados demonstraram que
é possível, por esta metodologia, diferenciar os clones e identificá-los entre
si. Porém, quando a investigação requer uma cobertura mais ampla do genoma, o
uso de marcadores isoenzimáticos é limitado, uma vez que poucos sistemas
isoenzimáticos polimórficos, geralmente entre 10 e 20, podem ser vizualizados
em cada espécie (Ferreira e Grattapaglia, 1995).
Nos últimos dez anos, técnicas que permitem fazer distinção diretamente a nível
de DNA têm permitido acessar a variabilidade genética dentro do pool gênico de
espécies cultivadas, assim como identificar a diversidade disponível em bancos
de germoplasma. Os marcadores de DNA apresentam vantagens em relação aos
marcadores isoenzimáticos, uma vez que podem ser obtidos em grande número e não
sofrem influência de fatores ambientais (Borém, 1998). Wesh e McClelland (1990)
e Williams et al. (1990) introduziram uma técnica que se baseia na detecção de
polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD), usando oligonucleotídios de
dez bases. Esta técnica tem se mostrado eficiente na identificação da
variabilidade genética em diversos grupos de plantas e pode ser usada como uma
ferramenta auxiliar em programas de melhoramento, encontrando também aplicação
na obtenção de mapas genéticos (Williams et al., 1990; Reiter et al., 1992;
Philipp et al., 1994; Paillard et al., 1996) e identificação de marcadores
moleculares úteis na seleção assistida (Michelmore et al., 1991; Ohmore et al.,
1995; Tartarini, 1996) entre outras. Marcadores RAPD foram usados para acessar
a variabilidade genética contida em coleções de milho (Welsh et al., 1991),
rosa (Gallego & Martinez, 1996), centeio (Huff, 1997), sorgo (Menkir et
al., 1997) e arroz (Fuentes et al., 1999). Poucos exemplos do uso de RAPD têm
sido mostrados na literatura em frutíferas. Usando marcadores RAPD, foi
possível distinguir entre populações de cacau (Theobroma cacao L.) (Russell et
al., 1993) e entre cultivares de castanha (Galderisi et al., 1998). Dunemann et
al.(1994), aplicando marcadores RAPD no gênero Malus (maçã), para avaliar as
relações genéticas entre 18 espécies e 27 cultivares de maçã, consideraram que
a técnica tem potencial para complementar estudos taxonômicos clássicos no
gênero.
Técnicas que fazem uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), têm acelerado o
desenvolvimento de novos sistemas para obtenção de marcadores de DNA, tal como
microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats). Estes marcadores consistem
de seqüências curtas de nucleotídeos repetidas na mesma ordem, cujo nível de
polimorfismo produzido é devido à variação no número de unidades de repetição
em um determinado lócus (Morgante e Olivieri, 1993). Marcadores SSRs são
obtidos com o uso de primers que flanqueiam regiões contendo os
microssatélites. Os primers para SSR são desenhados a partir do seqüenciamento
de fragmentos de DNA, obtidos de bibliotecas genômicas, onde os microssatélites
foram previamente localizados. Estes procedimentos são laboriosos e de alto
custo, de modo que o uso de SSRs é ainda limitado. No entanto, SSRs têm sido
mapeados e usados para análise genética em plantas como milho (Smith et al.,
1997), batata (Provan et al., 1996 e Kawchuk et al., 1996) e cítrus (Kijas et
al., 1997). A variabilidade genética contida em coleções de Solanum tuberosum
(McGregor, 2000), Malus(Gianfranceschi et al., 1998; Hokanson et al., 2001)foi
analisada, usando SSRs. Dados de microssatélites, obtidos para o gênero Musa
(banana), mostram uma aplicação imediata para análise genética e sugerem que
SSRs podem servir de âncora para a construção de um mapa genético básico em
banana (Kaemmer et al., 1997). Marcadores SSRs podem também ser obtidos, usando
oligonucleotídeos de seqüências simples repetidas como primers na amplificação
de DNA por PCR ou, ainda, como sondas em experimentos de hibridação envolvendo
DNA genômico, para a detecção de polimorfismo em famílias de DNA repetitivo
(Weising et al., 1995). Esta abordagem foi usada para a análise genética em
Helianthus (Dehmer, 1998) e Solanum tuberosum(McGregor et al., 2000).
O presente estudo teve por finalidade utilizar marcadores moleculares obtidos
por amplificação de DNA via PCR com iniciadores (primers) de RAPD e com primers
de seqüências simples repetidas (SSR), para acessar a variabilidade genética
contida em 24 genótipos de acerola (M. emarginata).
MATERIAL E MÉTODOS
Vinte e quatro acessos de acerola (Tabela_1) foram obtidos da coleção formada a
partir da seleção de genótipos em pomares comerciais da região Norte do Paraná,
mantida no Banco de Germoplasma da Fazenda-Escola da Universidade Estadual de
Londrina.
Aproximadamente 50 mg de folhas frescas de até cinco plantas de cada um dos 24
acessos de acerola foram utilizadas para análise de DNA. O procedimento adotado
foi adaptado a partir do método de CTAB (Cethyltrimethylammonium Bromide,
Sigma), descrita por Doyle & Doyle (1987), onde o CTAB foi substituído por
MATAB (Mixed Alyltrimethylammonium Bromide, Sigma) no tampão de extração. As
amostras foram purificadas pela adição de cloreto de sódio (NaCl) 5M à solução
de DNA seguida da precipitação com isopropanol. A quantificação foi realizada
em um fluorômetro DyNA Quant 20 (Hoefer-Pharmacia), conforme as especificações
do fabricante. Após diluição do DNA para uma concentração de 15 ng/mL, volumes
iguais de amostras individuais foram reunidos em um único bulk por acesso.
As reações de amplificação realizadas com uso de iniciadores (primers) de RAPD
foram feitas em um volume final de 15 mL, contendo 7,92 mL de água estéril; 1,5
mL de tampão de amplificação (KCl 50 mM, MgCl215 mM, Tris-Cl 100mM, pH 9,0);
1,5 mL de dNTPs (0,1 mM de cada dGTP, dATP, dCTP, dTTP); 2 mL de primer (4 mM)
da Operon Technologies; 1U de Taq DNA polimerase (Pharmacia) e 30 ng de DNA.
Para as reações com os primers de seqüências simples repetidas (SSR), o volume
final foi ajustado a 25 mL, contendo 9,70 mL de água estéril; 1,5 mL de
glicerol (40%); 2,5 mL de tampão de amplificação (KCl 50 mM, MgCl215 mM, Tris-
Cl 100 mM, pH 9,0); 2,5 ml de dNTPs (0,1 mM de cada dGTP, dATP, dCTP, dTTP);
2,5 mL de primer (4 mM) da Operon Technologies; 1,8 U de Taq DNA polimerase
(Pharmacia) e 3 mL (45 ng) de DNA.As reações de amplificação foram conduzidas
em um ciclador térmico PTC-100, sistema Peltier (MJ Research) para 60 tubos. O
programa de amplificação para as reações com os primers de RAPD consistiu de
uma denaturação inicial do DNA a 94oCpor 4 min, seguido de 48 ciclos que inclui
60 seg a 94oC(denaturação), 1 min e 45 s. a 38o C (anelamento), 2 min a 72o C
(polimerização) seguido de uma extensão final de 7 min a 72oC. Nas reações
utilizando primers de SSR, o programa utilizado inclui uma denaturação inicial
do DNA a 94oCpor 4 min, seguido de 40 ciclos de 15s. a 94o C (denaturação), 45
s. a 50o C (anelamento), 1 s. a 72o C e uma extensão final de 7 min a 72oC. Os
produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose
(Metaphor), corado com brometo de etídio e visualizado sob luz UV.
Os marcadores obtidos foram analisados com o software NTSYS-PC (Numerical
Taxonomy and Multivariate Analysis System for personal computers, Version 2.1,
Applied Biostatistics, Inc.). A partir dos dados, foi construída uma matriz de
similaridade genética, utilizando o coeficiente de Jaccard (J), calculado de
acordo com a fórmula: J = N/P, onde N é o número de concordâncias positivas e P
é o número total de variáveis, menos as concordâncias positivas. Para a
construção dos dendrogramas, foi utilizado o método de agrupamento UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Marcadores de RAPD
Inicialmente, foram utilizadas amostras de DNA de três acessos com o objetivo
de selecionar os primers mais informativos. De 94 primers testados, 37
forneceram produtos nítidos de amplificação e boa repetibilidade. Um total de
164 marcadores foram amplificados, com uma média de 4 bandas por primer. Os
produtos de amplificação foram utilizados para o cálculo do grau de
similaridade genética entre os acessos (Tabela_1). O padrão eletroforético
obtido com primers de RAPD é ilustrado na Figura_1. O número de bandas
polimórficas foi 149 (90,8%) e variou de uma, com os primers OPAF-20, OPAE-03 e
OPAX-07, a sete, com os primers OPO-08 e OPAR-19.
Análise genética dos marcadores RAPD
O alto grau de polimorfismo detectado com os marcadores de RAPD está de acordo
com a variabilidade observada com base em caracteres morfológicos e agronômicos
em acerola (Carpentieri-Pípolo, 2000 a, b; Gomes et al.,2000). Além disso, a
variabilidade detectada com marcadores de DNA concorda igualmente com as
informações existentes sobre a origem dos genótipos de acerola cultivados no
Brasil. Considera-se que estes genótipos derivam de poucas sementes trazidas de
Porto Rico e multiplicadas por via sexuada (Couceiro, 1985). No entanto, apesar
de ter uma base genética estreita, uma elevada segregação genética pode ainda
ser observada em pomares onde sementes são intensamente utilizadas na produção
de mudas (Carvalho, 1998).
A análise da matriz de similaridade genética e do dendrograma (Tabela_3, Figura
2) permitiu identificar cinco grupos distintos entre os 24 acessos de acerola.
Alguns grupos reuniram acessos que compartilham características químicas e
morfológicas. O grupo 1 associa oito acessos com coeficientes de similaridade
que variam de 65% a 87%. Entre estes, encontram-se associados os acessos UEL-
9 e UEL-28, que apresentam a mesma taxa de germinação (49 %) e os acessos UEL-
26 e Iapar-1, os quais apresentam como principal característica, concentrações
similares de vitamina C, isto é, 859 mg e 669 mg, por 100 g de polpa,
respectivamente (Carpentieri-Pípolo, 2000b). Os acessos UEL-6 e UEL- 10 (grupo
4) associam-se com 79% de similaridade e mostram, em média, uma concentração de
vitamina C de 1470 mg por 100 g de polpa (Carpentieri-Pípolo, 2000b). O maior e
o menor grau de similaridade genética foram observados entre os acessos UEL-08
e UEL-33 (95%) e entre Iapar-12 e UEL-06 (57%), respectivamente. Iapar-12 e
UEL-06 foram introduzidos na coleção de acerola a partir de coletas realizadas
em pomares implantados em diferentes regiões do Norte do Paraná. Iapar 12 foi
mais distinto entre todos os acessos analisados, mostrando uma similaridade
média de 67% com os 23 genótipos restantes. Baixa similaridade genética foi
igualmente observada entre alguns acessos procedentes da mesma região. Por
exemplo, UEL-32 e UEL-27 foram obtidos de pomares da região de Astorga-PR, e
mostram apenas 66% de similaridade. Da mesma forma, Iapar-06 e Iapar-03, ambos
procedentes de Bandeirantes-PR, apresentam somente 76% de similaridade. Estes
resultados sugerem que genótipos distintos têm sido utilizados na implantação
dos pomares de acerola. Yee et al. (1999), analisando acessos de Vigna
angularia, observaram igualmente ausência de correlação entre grau de
similaridade genética obtida com base em marcadores de DNA e procedência dos
acessos. Neste caso, os autores apontam para a possibilidade de que a origem
dos acessos difere do local de coleta.
As cultivares UEL-03 Dominga, UEL-04 Lígia e UEL-05 Natália, lançadas como
variedades comerciais no Brasil (Carpentieri-Pipolo et al., 2000a), foram
incluídas neste estudo. Essas variedades compartilham características de
interesse agronômico tais como, alta concentração de vitamina C em seus frutos,
pilosidade em ramos e folhas, ramificação intermediária e boa produtividade. No
entanto, a similaridade genética média observada com os marcadores RAPD entre
as três cultivares foi baixa (76%). A diferença genética observada entre
acessos que possuem várias características em comum, pode ser explicada
considerando que, na reação de RAPD, a mudança de um único nucleotídeo pode
levar a uma variação no padrão de bandas obtidos sem que isto altere
características morfológicas e químicas. Além disso, de acordo com Irwin et al.
(1998), os marcadores de RAPD tendem a se localizar em regiões genômicas não
codificantes, mais suscetíveis a mutações e, conseqüentemente, mais
polimórficas.
Os acessos UEL-3 Dominga e Iapar-6 aparecem no grupo 3, associando-se com 80%
de similaridade. Este resultado está de acordo com os dados obtidos por
Carpentieri-Pípolo et al. (2000a), onde os acessos UEL-3 Dominga, Iapar-6 e
UEL-10 foram avaliados quanto a nove caracteres agronômicos por meio da análise
multivariada, e incluídos em um mesmo grupo. No entanto, os marcadores RAPD
separam UEL-10 de UEL-3 Dominga e Iapar-6 com os quais mostra uma relação de
similaridade de 78% e 72%, respectivamente. Em geral, a variabilidade genética
detectada a partir dos marcadores RAPD entre os acessos de acerola pode ser
atribuída à intensa utilização de sementes na produção de mudas (Carvalho,
1998), o que leva a uma elevada segregação genética. Além disso, a presença em
acerola de um sistema genético de auto-incompatibilidade, favorece a
polinização cruzada (Neto et al., 1995) e, conseqüentemente, o fluxo gênico
entre genótipos distintos, justificando, portanto, o alto polimorfismo
encontrado.
Marcadores de SSR
O uso de primers SSR em reações de PCR possibilita a amplificação de fragmentos
de DNA, contidos entre regiões de DNA repetitivo, representadas por seqüências
simples repetidas (SSRs) ou microssatélites. Entre os 30 primers SSR testados,
16 (Tabela_2) produziram bandas nítidas e de boa repetibilidade. Um exemplo do
padrão eletroforético obtido com primers SSR é apresentado na Figura_1.
Combinações entre diferentes primers SSR foram utilizadas na mesma reação,
resultando em produtos de amplificação diferentes daqueles obtidos com cada
primer usado isoladamente. Um total de 73 marcadores foram analisados, sendo 49
(68%) polimórficos. Estes marcadores foram utilizados para gerar uma matriz de
similaridade genética (Tabela_4) calculada a partir do coeficiente de
similaridade de Jaccard.
Análise genética dos marcadores SSR
O agrupamento gerado a partir dos marcadores obtidos com os primers SSR mostram
a formação de quatro grupos distintos (Figura_3) e um nível de polimorfismo
inferior àquele detectado com marcadores RAPD.
A análise comparativa dos dois dendrogramas revelou algumas associações
diferentes entre os acessos. Uma similaridade genética de 95% e 79% entre os
genótipos UEL-26 e UEL-28 e de 91% e 79% entre os acessos UEL-06 e UEL-10 foi
observada com marcadores SSR e RAPD, respectivamente. Estes resultados
discordam daqueles mostrados para o gênero Microseris (Van Heusden &
Bachmann, 1996), onde os resultados de RAPD foram similares aos obtidos com
primers repetitivos e com isoenzimas. A eficiência na identificação da
similaridade genética entre as cultivares UEL-03 Dominga, UEL-04 Lígia e UEL-05
Natália foi também maior (91%) com os marcadores obtidos com os primers SSR do
que com RAPD (76%), concordando, portanto, com os caracteres morfológicos
compartilhados por estas cultivares. Primers SSR foram mais eficientes, em
relação aos de RAPD, para a análise genética em trigo (Nagaoka & Ogihara,
1997), produzindo bandas mais nítidas e maior repetibilidade. Por outro lado,
Van de Vem & McNicol (1996) mostraram que primers de RAPD identificaram com
maior precisão acessos de Picea sitchensis.
Em alguns casos, as associações encontradas no dendrograma gerado com os dados
obtidos com primers SSR foram semelhantes às observadas com RAPD. Por exemplo,
os acessos UEL-33 e UEL-08 mostraram elevada similaridade genética tanto com
primers de RAPD (95%) quanto com primers SSR (98%). O acesso Iapar-12 foi
novamente o mais divergente, mostrando uma similaridade que variou de 65%
(RAPD), com o acesso UEL-27, a 80% (SSR), com o acesso UEL-32.
CONCLUSÕES
Em geral, o polimorfismo gerado com os marcadores de DNA mostrou que, apesar da
base genética estreita, que caracteriza as coleções de acerola encontradas no
Brasil, a variabilidade é relativamente alta. Enquanto os marcadores RAPD
permitiram detectar maior nível de polimorfismo, a similaridade identificada
por marcadores gerados com primers SSR sugere uma maior correlação com
associações obtidas a partir de caracteres morfológicos. Em alguns casos, a
variação observada foi de difícil interpretação, devido à ausência de uma
caracterização morfológica detalhada de muitos dos acessos incluídos neste
estudo. Os resultados obtidos a partir de marcadores de DNA podem auxiliar na
definição de estratégias mais eficientes a serem utilizadas nos programas de
melhoramento de acerola.
