IgG Anti-CCP no Diagnóstico de uma Poliartrite
INTRODUÇÃO
A Artrite Reumatóide (AR) é uma das mais graves e
potencialmente incapacitantes formas de artrite. É uma
doença poliarticular inflamatória crónica, em que o
envolvimento extra-articular ou sistémico não é
negligenciável. O atingimento compressivo do nervo
mediano no túnel do carpo, a nodulose reumatóide, a
poliserosite, a fibrose pulmonar, o envolvimento vasculítico
dos nervos perifèricos e a amiloidose AA secundária
fazem parte do espectro das complicações da doença.
Algumas delas podem contribuir para uma diminuição
franca da esperança de vida.
A prevalência de AR em caucasianos da América do
Norte e Europa foi estimada em 1% para indivíduos com
mais de 15 anos de idade, sendo 2 a 4 vezes maior nas
mulheres (1). Em Portugal, dados de 2000, referem que
haverá cerca de 100 000 casos, atingindo os dois sexos
mas sendo mais frequente nas mulheres, sobretudo a
partir dos 35-40 anos, não obstante poder manifestar-se
em todas as idades (2) .
Embora a causa da AR seja desconhecida, há vários
dados que sugerem que os eventos patogénicos na AR
são muito complexos e multifactoriais. Há evidência de
que a susceptibilidade genética (associada aos alelos
HLA-DR4 e DR1), a resposta imunológica e uma série de
mecanismos inflamatórios capazes de destruir os tecidos,
associados a uma resposta de reparação, contribuem
para a evolução clínica da doença (1,3). A acumulação
de células inflamatórias na membrana sinovial e a indução
de erosões articulares são as principais características
patológicas da doença, levando a perda funcional por
danos estruturais graves.
O diagnóstico serológico da AR tem sido feito utilizando
a detecção de diferentes auto-anticorpos circulantes, tais
como os factores reumatóides (auto-anticorpos anti-IgG),
anticorpos anti-queratina (AKA) ou anti-filagrina e, mais
recentemente, auto-anticorpos que reconhecem epítopos
citrulinados, como são exemplo os IgG para o Péptido
Citrulinado Cíclico (4). Estes auto-anticorpos têm revelado
interesse no diagnóstico precoce de uma poliartrite,
altura em que uma percentagem menor de doentes que
evoluirão para Artrite Reumatóide apresenta factores
reumatóides e em que a indefinição do quadro clínico
dificulta efectivamente o diagnóstico . Segundo a literatura
a positividade da IgG para o Péptido Citrulinado Cíclico
é de 77% na AR , entre 8 a 12% das doenças difusas do
tecido conjuntivo e em menos de 2% em controlos
saudáveis (5,6).
O objectivo deste trabalho foi avaliar comparativamente
as características de um método de pesquisa e quantificação dos anticorpos IgG anti-CCP no soro de doentes
com diagnóstico de AR, usando um método imunoenzimático. Para isso estudou-se a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo do teste, comparando-o com
outros testes úteis na avaliação laboratorial das doenças
reumáticas.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram estudados doentes de ambos os sexos, seguidos na consulta de Reumatologia do Hospital S. João do
Porto. A amostra foi constituída por 57 doentes seleccionados por ordem de chegada à consulta durante os primeiros
seis meses do ano de 2004, posteriormente agregados
pelo diagnóstico clínico à data da entrada da amostra no
laboratório, em dois grupos:
Grupo I - 24 doentes com diagnóstico de DDTC, que
não AR - Lúpus Eritematoso Sistémico (n=10), Síndrome
de Sjögren (n=3), Esclerose sistémica (n=6) e Artrite
indiferenciada (n=5);
Grupo II - 33 doentes com o diagnóstico de AR.
Estes doentes apresentavam quadros clínicos bem
definidos e diagnóstico feito com base nos critérios de
classificação de AR do American College of Rheumatology (ACR) - pelo menos quatro de sete. Critérios: 1)
Artrite de três ou mais articulações vistas por médico e
com envolvimento simultâneo, com duração mínima de 6
semanas; 2) Artrite de articulações das mãos, incluindo
punhos, com duração mínima de 6 se-manas; 3) Artrite
simétrica (para interfalângicas e meta-carpofalângicas
não necessariamente do mesmo dedo) com duração
mínima de 6 semanas; 4) Rigidez matinal de 1 hora com
duração mínima de 6 semanas; 5) Presença de factor
reumatóide; 6) Nódulos reumatóides; 7) Alterações
radiológicas sugestivas de AR.
Grupo III- Estudou-se também um grupo de controlo
(indivíduos saudáveis), constituído por 30 soros existentes
na seroteca do Serviço, provenientes de dadores de
sangue de ambos os sexos, com idades compreendidas
entre os 19 e os 47 anos.
As determinações foram realizadas em cada amostra
de soro sem conhecimento do grupo clínico a que
pertenciam.
Determinação da proteína C reactiva (PCR) e do
factor reumatóide (FR)
A determinação quantitativa da PCR e do FR IgM foi
realizada por imunonefelometria de partículas reforçadas,
usando os sistemas BNII(TM) (hsCRP e N Latex RF,
Dade Behring Inc.). O princípio deste método consiste na
aglutinação de partículas de poliestireno (N Latex FR)
revestidas com um imunocomplexo composto por IgG
humana / IgG anti-humana (de ovelha) quando misturadas
com as amostras que contêm FR. No caso da PCR, as
partículas de poliestireno revestidas com um anticorpo
monoclonal contra a PCR humana, quando misturadas
com amostras que contêm PCR, formam também
aglutinados. Em ambos os casos, a dispersão da luz é
direccionada para um fotodetector e convertida em sinais
eléctricos, a partir dos quais é determinada a concentração, pela utilização de uma curva de calibração.
(Valores de referência, do fabricante: PCR: 0,0 - 0,5 mg/
dl; FR: <30,0 UI/ml).
Pesquisa de anticorpos anti-queratina (AKA)
Para a pesquisa dos anticorpos anti-queratina foi
utilizado um teste de imunofluorescência indirecta em
esófago de rato (RA - Specific Keratin, EUROIMMUN® Medizinische Labordiagnostika AG). Resumidamente,
as amostras de soro diluídas 1/10 em tampão salino de
fosfato (PBS) , são incubados sobre os cortes de esófago
de rato durante 30'. Ao fim desse tempo faz-se uma
lavagem com PBS e, numa segunda fase, os anticorpos
potencialmente ligados ao substrato são identificados
por anticorpos anti-IgG humana marcados com isotiocianato de fluoresceína (conjugado), tornando-se visíveis
ao microscópio de epifluorescência (NIKON EFD - 3®).
A amostra é considerada positiva se houver uma
fluorescência característica das microfibrilas tal como a
observada no controlo positivo usado em cada sessão.
Doseamento de anticorpos IgG anti-CCP
Para a detecção de anticorpos IgG anti-CCP, utilizou-se o teste comercial QUANTA Lite(TM) CCP IgG ELISA,
que é um ensaio imunoenzimático quantitativo de 2ª
geração (INOVA Diagnostics, Inc.).
Este método utiliza como antigénio um péptido
sintético cíclico e citrulinado que está ligado à superfície
de uma placa de micropoços. Adicionam-se aos diferentes
poços os calibradores, os controlos pré-diluídos e o soro
diluído dos doentes. Os anticorpos IgG anti-CCP
presentes irão ligar-se ao antigénio imobilizado. A amostra
não ligada é removida por lavagem e adiciona-se um
conjugado anti-IgG humana marcado com uma enzima,
a cada poço. Uma segunda incubação permite ao
conjugado enzimático ligar-se aos anticorpos que tenham
ficado ligados aos micropoços. Depois da segunda
lavagem para retirar o excesso de conjugado, a actividade
enzimática é medida adicionando um substrato
cromogénico (TMB) que permite desenvolver uma cor
que vai ser directamente proporcional à concentração
dos anticorpos. Posteriormente o ensaio é avaliado por
espectrofotometria, através de uma curva de calibração
Absorvância vs Concentração e são calculados os valores
da concentração dos anticorpos em cada amostra (Valores
de referência, do fabricante: IgG anti-CCP <20 Unidades).
O equipamento automático usado foi o MAGO PLUS
(DIAMEDIX®). Todas as amostras foram testadas em
duplicado.
Cálculo estatístico
Para verificar se as populações de onde foram retirados
os grupos estudados seguiam uma distribuição normal,
usou-se o Teste de Normalidade Kolmogorov-Smirnov
com Correção de Lilliefors. Para comparar amostras
independentes foi utilizado o teste não paramétrico de
Mann-Whitney e para avaliar a independência entre
variáveis foi utilizado o Teste do Qui-Quadrado χ2. A
correlação entre variáveis foi estudada através do
Coeficiente de Correlação de Spearman (rho). Foi utilizado
sempre um nível de significância de 5%. Os resultados
foram analisados utilizando a versão 12.0 do SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences).
Calculámos também o valor predictivo positivo (VPP)
dos diferentes auto-anticorpos para o diagnóstico de AR
(VPP= nº de verdadeiros positivos a dividir pelo nº de
testes positivos no total de amostras analisadas), bem
como a sensibilidade (capacidade de identificar os casos
de doença) e especificidade (capacidade de excluir as
pessoas sem doença) para o diagnóstico de AR quando
comparada com os controlos saudáveis e o grupo das
outras doenças reumáticas.
RESULTADOS
Na totalidade foram estudadas 67 mulheres e 20
homens. Nos diferentes grupos predominou o sexo
feminino (Tabela 1). No grupo de controlos saudáveis, a
média das idades foi de 29 anos (±8,8), a do grupo I foi de
38 anos (±8,4) e a do grupo com AR foi de 42 anos (±7,6).
A mediana dos resultados obtidos para a PCR no
grupo de controlos saudáveis, foi de 0,185mg/dl (0,020,68). No grupo I, a mediana foi de 0,410mg/dl (0,0215,9). No grupo com AR, a mediana foi de 0,690mg/dl
(0,02-9,07). A PCR foi significativamente diferente entre
o grupo de controlos saudáveis e o grupo I (p=0,014) e
entre o crupo de controlos saudáveis e o grupo com AR
(p<0,001) não diferindo entre os dois grupos de doentes
(p=0,196).
A mediana dos resultados obtidos para o FR no grupo
de controlo, foi de 10,3UI/ml (10,3-181,0). No grupo I, a
mediana foi de 10,3UI/ml (10,3-1160,0). No grupo com
AR, a mediana foi de 173,0UI/ml (10,3-1280,0). Os dois
grupos de doentes diferiram significativamente entre si
(p=0,001) e do grupo controlo.
A pesquisa de anticorpos anti-queratina foi negativa
em todas as amostras do grupo de controlos saudáveis.
No grupo I foi positiva em 38% (9/24) das amostras
estudadas e no grupo com AR foi positiva em 48% (16/
33). A distribuição de resultados positivos entre estes
dois grupos de doentes não diferiu significativamente
χ2= 0,681; p=0,409).
A mediana dos resultados obtidos para a IgG antiCCP no grupo de controlos saudáveis, foi de 1,35U
(0,1-14,4). No grupo I, a mediana foi de 0,30U
(0,1-250,0). No grupo com AR, a mediana foi de 188,7U
(0,1-250,0). O grupo com AR diferiu significativamente
quer do grupo I (p<0,001) quer do grupo de controlos
saudáveis (p<0,001), enquanto que estes dois últimos
não diferiram entre si (p=0,573). A distribuição de
resultados positivos ( >20U) foi significativamente diferente
nos dois grupos de doentes χ2=19,4; p<0,001) e muito
superior na AR (Figura 1).
Para o grupo de auto-anticorpos que se associam à
AR, foi calculada a sua sensibilidade e especificidade em
relação ao grupo de controlos saudáveis (Tabela 2A) e
em relação ao grupo I (Tabela 2B), com os intervalos de
confiança a 95%.
Neste estudo, verificou-se que a percentagem de
doentes com AR que apresentavam IgG anti-CCP foi
igual à do FR (75,8%), embora dois doentes sem FR
detectável tinham IgG anti-CCP positiva. Nos doentes do
grupo I a percentagem com IgG anti-CCP (16,7%) foi
inferior à do FR (29,2%).
No total de amostras estudadas, verificou-se uma
correlação significativa entre o FR e a IgG anti-CCP
(rho=0,698; n=87; p<0,001) que se mantém no grupo
com AR (rho=0,671; n=33; p<0,001).
O valor preditivo positivo para o diagnóstico de AR foi
de 0,86 (25/25+4) para a IgG anti-CCP, de 0,78 (25/25+7)
para o FR e de 0,64 (16/16+9) para os AKA.
DISCUSSÃO
Nos grupos incluídos neste trabalho, verificou-se que
os controlos saudáveis apresentavam uma média de
idades inferior à dos doentes, e nestes, uma percentagem
mais elevada de mulheres, o que está de acordo com as
características epidemiológicas da patologia estudada
(Tabela 1) . De facto, quer as DDTC quer a AR predominam
no sexo feminino. No entanto, os dois grupos de doentes
que estudamos não diferiram na idade (p=0,07) nem na
distribuição por sexo χ2=0,60; p=0,69).
Embora a imagiologia, incluindo a ecografia de alta
resolução, constitua actualmente um importante meio
complementar de diagnóstico na AR, os testes
laboratoriais são sem dúvida mais simples e reprodutíveis,
independentes do operador, fornecendo informação útil
quer para o diagnóstico quer para a monitorização da
actividade da doença (7).
No nosso estudo, verificou-se uma grande dispersão
de resultados de cada variável (amplitudes muito grandes)
em cada um dos grupos, o que é em parte devido a um
intervalo analítico elevado tanto da PCR (0,02 a
15,9mg/dl), como do FR (10,30 a 1280,0UI/ml), assim
como da IgG anti-CCP (0,1U a 250U).
A PCR é um marcador sérico de actividade nas
doenças inflamatórias (8) e na AR correlaciona-se melhor
com a actividade da doença do que a velocidade de
sedimentação eritrocitária. Normalmente nas
espondilartropatias, no lúpus eritematoso sistémico (LES),
na esclerose sistémica e na dermatomiosite, a PCR está
apenas ligeiramente aumentada ou até normal, sendo
menos utilizada para monitorizar a actividade da doença
nestes contextos clínicos (9).
Na nossa casuística, ela foi negativa em 14 dos 33
doentes estudados com diagnóstico de AR (42%), que se
encontravam em remissão clínica. Já os níveis da sua
positividade e concentração não permitiram distinguir,
neste estudo, o grupo com AR das outras doenças reumáticas (58 versus 46%, mediana 0,69 versus
0,41mg/dl). A inclusão da PCR nalguns dos índices de
actividade da AR é ainda hoje questionável, não sendo
consensual a sua utilização na avaliação da actividade
da doença (10).
O diagnóstico serológico da AR tem sido feito,
tradicionalmente, utilizando a detecção de auto-anticorpos
anti-IgG, como são os factores reumatóides IgM. O FR,
como é habitualmente conhecido, pode ser detectado
vários anos antes de surgirem os primeiros sintomas
clínicos da AR, podendo contribuir para o seu diagnóstico
precoce embora, numa fase inicial da doença, haja
significativamente menos doentes com FR detectáveis
no soro. No entanto, não é um marcador específico, pois
pode ser encontrado também noutras doenças autoimunes como no Lúpus Eritematoso Disseminado, na
Síndrome de Sjögren, entre outras, apesar de aí apresentar valores habitualmente mais baixos. O FR pode
também associar-se a doenças hematológicas (11) e a
infecções crónicas, onde poderá ter um papel benéfico
na remoção de imunocomplexos (12). Adicionalmente,
cerca de 1/3 das artrites reumatóides inaugurais são
factor reumatóide negativas, podendo este positivar ao
longo dos primeiros três anos de evolução.
Na análise de resultados do grupo de controlo verificouse reactividade para o FR em 3,3% dos casos, o que está
de acordo com o descrito (7) em indivíduos saudáveis.
No grupo I a positividade foi de 29,2% o que se aproxima
do habitualmente encontrado neste grupo de doenças, à
excepção do S. de Sjögren. Já na AR a positividade foi de
75,8%, com níveis significativamente mais elevados do
que no das outras doenças reumáticas, embora a
especificidade diagnóstica deste auto-anticorpo para AR,
face a um doente com sintomas inflamatórios do aparelho
locomotor ronde, no nosso estudo, os 70% (Tabela 2B).
Outras determinações de auto-anticorpos têm sido
propostas, algumas delas apresentando melhor
especificidade para a AR, como é o caso da pesquisa dos
anticorpos anti-queratina (AKA) ou anti-filagrina (13,14,15)
que foram progressivamente introduzidos na rotina do
nosso laboratório. A pesquisa de anticorpos anti-queratina
apenas se revelou positiva em 48% dos doentes com
diagnóstico de AR, mas negativa em todos os controlos
saudáveis, estando estes resultados de acordo com a
boa especificidade e menor sensibilidade referidas na
literatura (16). Outros estudos têm demonstrado que a
positividade destes anticorpos numa fase precoce da
doença constitui um marcador de progressão clínica
(17). No nosso estudo verificou-se, no entanto, que 38%
das outras doenças reumáticas tinham também AKA
positivos (o que diminui a sua especificidade diagnóstica
em doentes), não havendo diferença de distribuição
entre os dois grupos de doentes. Por este facto, de todos
os auto-anticorpos estudados, este foi o que revelou
menor valor predictivo positivo para a AR.
Deve salientar-se que investigações posteriores à
sua descrição mostraram que os auto-anticorpos
específicos para a queratina (AKA), detectáveis por
imunofluorescência indirecta em esófago de rato, são
dirigidos contra um alvo humano: o antigénio filagrina da
pele. As proteínas filagrínicas têm uma participação
funcional na agregação dos filamentos da citoqueratina,
que vão formar as macrofíbrilas presentes na matriz
celular da camada córnea da epiderme (7). Durante o
processo natural de destruição do estrato córneo a filagrina
básica é enzimáticamente citrulinada, tornando-se neutra
e com menor afinidade para a citoqueratina. Em 1993, a
filagrina citrulinada (neutra) foi identificada como o
antigénio alvo dos anticorpos anti-queratina (18) e, mais
recentemente, proteínas citrulinadas intracelulares têm
sido descritas na sinóvia de doentes com AR (5) e não
noutras doenças articulares (19).
Para determinar a especificidade anti-citrulina, têm
sido desenvolvidos mais recentemente diversos
substratos citrulinados (4,19), que podem ser
incorporados, por exemplo, em péptidos circulares. É o
caso do péptido citrulinado cíclico-CCP.
Um estudo efectuado em 2005, analisando 133
amostras com FR IgM positivo, demonstrou que o
doseamento de anticorpos anti-CCP, apresenta relevância
clínica pois, quando elevados, aumentam a probabilidade
da ocorrência de AR em doentes com FR IgM> 20 IU/ml
(20). A detecção dos anticorpos anti-CCP poderá também
contribuir para modificar o prognóstico desta patologia,
dado que poderá permitir um diagnóstico e uma
intervenção terapêutica mais precoces (21) uma vez que
apesar do FR IgM ser um óptimo marcador preditivo
independente da ocorrência de progressão radiológica a
longo prazo, sabe-se que numa percentagem significativa
dos doentes, pode positivar apenas ao fim de três anos
de evolução de doença (22).
Neste estudo os níveis séricos de IgG anti-CCP foram
significativamente mais elevados no grupo com AR, não
diferindo significativamente entre o grupo das outras
doenças reumáticas e dos controlos, apresentando o
melhor valor predictivo positivo para o diagnóstico de AR
(86%) entre as três especificidades de auto-anticorpos
estudadas. Os valores da sensibilidade e da especificidade
(Tabelas 1 e 2) obtidos com este método são comparáveis
com outros estudos recentes (23).
Uma das limitações do nosso estudo prende-se com
o diagnóstico presuntivo de alguns dos doentes incluídos
no grupo I. Na análise dos resultados obtidos, verificámos
que três dos doentes neste grupo de outras doenças
reumáticas (incluídos pelo seu diagnóstico à data da
entrada da amostra no laboratório) apresentaram
reactividade elevada para o FR e IgG anti-CCP. Este
facto verificou-se para dois casos da Síndrome de
Sobreposição LES / AR (RUPUS) e um terceiro doente
com Síndrome de Sjögren secundário, associado a AR.
Verificámos, também, quer no total das amostras
estudadas quer no grupo com o diagnóstico de AR, uma
correlação significativa entre a positividade para o FR e
para os anticorpos IgG anti-CCP, o que está de acordo
com outras publicações (24).
Em conclusão, os resultados obtidos na pesquisa de
anticorpos IgG anti-CCP por ELISA em doentes com
patologia reumática apontam para um teste de elevada
sensibilidade, tal como o factor reumatóide, mas de
melhor especificidade para o diagnóstico da AR.
