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BrBRCEEx0100-40421999000100008

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National varietyBr
Year1999
SourceScielo

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Identificação de componentes de óleos voláteis: Análise espectroscópica de misturas de sesquiterpenos

1. INTRODUÇÃO A grande maioria dos trabalhos com óleos voláteis existentes na literatura descreve a identificação de seus constituintes através da técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas e/ou associada ao cálculo do índice de Kovatz. o uso desta técnica requer bancos de dados que contenham os valores dos tempos de retenção e/ou os espectros de massas para serem confrontados com os dados experimentais obtidos. Tais dados nem sempre estão disponíveis e muitas vezes sequer existem. No caso de sesquiterpenos, as análises por CG/EM não têm se mostrado eficientes uma vez que tais substâncias rearranjam-se facilmente formando fragmentos com m/z iguais, o que origina espectros que diferem apenas quanto às intensidades relativas dos picos1. Além disso, existe muita variação entre espectros obtidos em instrumentos diferentes.

A RMN de 13C parece ser a técnica espectroscópica mais indicada para a identificação dessas substâncias, uma vez que os sesquiterpenos constituem uma classe de substâncias naturais com uma gama muito grande de possibilidades estruturais. Um fator limitante para o uso de tal técnica é a existência de poucos dados de RMN de 13C disponíveis na literatura, os quais possam ser empregados como modelos, especialmente quando se tratam de sesquiterpenos sem oxigenação ou mono-oxigenados, ou seja, aqueles que comumente fazem parte dos óleos voláteis. Apesar desta dificuldade, a utilização da metodologia aqui descrita tem proporcionado a identificação de vários sesquiterpenos, inclusive alguns inéditos.

2. METODOLOGIA 2.1. Separação dos constituintes Primeiramente deve-se analisar o cromatograma obtido por CG do óleo volátil bruto*. Os valores dos tempos de retenção, obtidos em condições cromatográficas preestabelecidas, indicarão se os constituintes são predominantemente hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sesquiterpenos mono-oxigenados, di-oxigenados e eventualmente diterpenos2,3. O espectro de RMN de 1H deverá confirmar a predominância da natureza terpênica do óleo que aril-propanóides também são componentes frequentes de óleos voláteis.

A seguir o óleo volátil deve ser submetido a uma cromatografia rápida em coluna de sílica gel, utilizando-se para tal um sistema sob pressão. Os solventes utilizados como eluentes devem ser de baixo ponto de ebulição, como pentano e CH2Cl2. Misturas de CH2Cl2 e MeOH podem ser utilizadas ao final do processo, desde que o álcool esteja presente em pequena proporção. As frações obtidas desse primeiro fracionamento cromatográfico serão reagrupadas após a análise dos cromatogramas de cada uma delas, obtidos por CG. Para a reunião deve-se considerar a proporção de cada um dos constituintes das diversas frações, a fim de que sejam obtidas misturas com diferentes proporções dos mesmos constituintes. Isso favorece a análise dos espectros de RMN de 13C, uma vez que facilita a identificação dos sinais pertencentes a cada um dos sesquiterpenos presentes nas misturas. Através desse procedimento é possível identificar diversos componentes, mesmo aqueles presentes em pequenas concentrações, sem necessidade de purificá-los.

As frações de menor polaridade devem ser reunidas e submetidas a uma cromatografia em coluna de sílica gel impregnada com AgNO34, que essas são normalmente constituídas por sesquiterpenos com uma ou mais ligações duplas. A maior ou menor disponibilidade dos elétrons dessas ligações fará com que os terpenos sejam diferencialmente retidos pelo AgNO3 e logo eluídos separadamente. Aqueles com maior número de ligações duplas serão eluídos por último. Os eluentes utilizados também devem ter baixo ponto de ebulição, sendo que os mais indicados são pentano, CH2Cl2 e acetona. As frações mais polares que contenham terpenos com grupamentos hidroxílico, cetônico ou anel epóxido, por serem um pouco menos voláteis, podem ser submetidas as técnicas cromatográficas usuais. Em qualquer um dos casos deve-se monitorar o fracionamento por cromatografia a gás.

* Análises cromatográficas As condições utilizadas nos trabalhos do grupo para as análises cromatográficas foram: Cromatógrafo HP-5890 Series II. Coluna capilar HP-5 (5% de fenil em 95% de metil silicone, 30 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno, 0,25 mm de espessura do filme). Condições: injetor automático HP 7673 (razão de divisão 1: 50): 180oC; detector por ionização de chama: 260oC; gás carreador: H2, vazão: 6 mL/min (30oC); temperaturas programadas: 100oC (2 min) - 100 -240oC (5oC/min) - 240oC (5 min).

2.2. Identificação dos sesquiterpenos Para a análise dos espectros de RMN de 13C das misturas sesquiterpênicas seguiu-se a metodologia descrita para misturas de triterpenos 5,6. Esse método sugere que sinais de intensidades semelhantes, relativos a átomos de carbono ligados ao mesmo número de hidrogênios, devam pertencer à mesma substância.

Desta forma é possível agrupar os sinais de cada constituinte da mistura desde que eles não estejam presentes na mesma proporção. A porcentagem relativa de cada um dos constituintes é dada pelo cromatograma da mistura obtido por CG.

A determinação do tipo de esqueleto carbônico da molécula é um passo importante no processo de elucidação estrutural. Sesquiterpenos possuem uma gama muito grande de possibilidades estruturais e, por serem moléculas pequenas, qualquer alteração na estrutura ocasiona variações consideráveis nos valores de deslocamentos químicos de vários átomos de carbono da molécula, o que torna difícil a associação desses valores a um tipo único de esqueleto carbônico.

A fórmula molecular do composto, assim como o número de deficiência de hidrogênios da estrutura de cada sesquiterpeno, são deduzidos a partir do espectro de massas associado ao tempo de retenção e ao espectro de RMN de 13C.

Embora o pico correspondente ao íon-molecular possa, no caso, ser suficiente para a determinação da fórmula molecular, ele nem sempre está presente nos espectros de massas dos sesquiterpenos hidroxilados, devido a perda de água.

Nesses casos, o valor do tempo de retenção é usado para definir a presença de oxigênio na molécula2. O espectro de RMN de 13C revela o número de ligações duplas da molécula, através dos sinais relativos a átomos de carbono sp2, sendo então possível determinar o número de anéis da estrutura, uma vez que a fórmula molecular esteja estabelecida. Este dado, juntamente com o número de grupos metílicos, metilênicos, metínicos e de átomos de carbono quaternários, também obtidos pelos espectros de RMN de 13C (PND e DEPT), indica as possibilidades estruturais do esqueleto sesquiterpênico. Um levantamento bibliográfico mostrará quais tipos de esqueletos carbônicos possuem as características apontadas por essa análise7.

A seguir os espectros de RMN de 13C e de 1H bem como o espectro de massas devem ser avaliados mais detalhadamente. Assim, a presença de anéis ciclopropânicos, grupos isopropílicos, grupos metílicos ligados a grupo CH, a átomos de carbono sp2 ou quaternários, além de outras funções, podem ser detectadas na estrutura molecular. Estes dados também são relevantes para se concluir qual o tipo de esqueleto dos sesquiterpenos analisados. Deve-se então comparar os dados de RMN de 13C obtidos com os fornecidos pela literatura. Quando esses não são encontrados, torna-se necessária a utilização de diversas estruturas como modelos para que uma atribuição correta dos valores de deslocamentos químicos de 13C seja feita. Mesmo assim, nem sempre existem modelos adequados, principalmente para os sesquiterpenos sem oxigenação7.

3. APLICAÇÃO Utilizando-se a metodologia descrita, dez sesquiterpenos foram identificados no óleo volátil da casca do tronco de Guarea guidonia(L.) Sleumer (Meliaceae):b-1 (10)-epóxi-b-cariofil-4(15)-eno (1), a-1(10)-epóxi-b-cariofil-4(15)-eno (2), 1 (10)-epóxi-humula-4,7-dieno (3), cariofila-1(10),4(15)-dieno (4), germacra-1 (10),4(15),5-trieno (germacreno D, 5), cis-cadina-4,10(14)-dieno (g- muuroleno,6), trans-cadina-4,10(14)-dieno (7), cadina-1(10),4-dieno (d- cadineno, 8), elema-1,3,11-trieno (b-elemeno, 9), humula-1(10),4,7-trieno (a- humuleno, 10)8. A Tabela_1 mostra o reagrupamento das frações provenientes do fracionamento do óleo volátil bruto, em colunade sílica gel impregnada com AgNO3, assim como os constituintes de cada uma delas com os seus respectivos temposde retenção. As Figuras_1 e 2 mostram, respectivamente, os cromatogramas e os espectros de RMN de 13C para os Grupos IV e V.

Os óleos voláteis das espécies descritas abaixo também foram analisados através desta metodologia, tendo sido identificados os seguintes sesquiterpenos: G. guidonia, folhas: 14b,15b-eudesma-5,7-dieno (11); 7b,14b-eudesma-4,11-dieno (12); 7b,14b-eudesma-4(15);11-dieno (13); 5a,6a-epóxi-14b,15b-eudesm-7-eno (14); 14b-eudesm-6-en-4a-ol (15); 14b,15b-eudesma-5,7-dien-2a-ol (16); 5a,6a- epóxi-14b,15b-eudesm-7-en-9-ol (17); 5a,6a,7a,8a-diepóxi-14b,15b-eudesmane (18) e guaia-6-en-10b-ol (19)3.

Xylopia emarginata Mart (Annonaceae), folhas: cariofileno (4); epóxicariofileno (1), espatulenol (20) e alismol (21)9.

X. emarginata, frutos: germacreno D (5), espatulenol (20) e alismol (21)9.

Porcelia macrocarpa (warm.) R.E. Fries (Annonaceae), folhas: espatulenol (20), germacreno D (5) e biciclogermacreno (22)10.

4. CONCLUSÕES Pode-se observar que, através desta metodologia, foi possível detectar substâncias com diferenças estruturais muito sutis, como por exemplo os sesquiterpenos 1 e 2. Vale a pena ressaltar que 2 não tinha sido, até então, detectado como produto natural, mas como produto de oxidação do b- cariofileno 11.


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