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Alongamento in vitro de rebentos de Eucalyptus dunnii em função de diferentes genótipos e concentrações de ácido 1-naftil-acético (ANA)

Introdução As características florestais apresentadas por Eucalyptus dunnii Maiden oferecem perspectivas promissoras para o cultivo de eucaliptos no Rio Grande do Sul, Brasil. Entre essas características, merecem destaque a tolerância a geadas intensas e severas, além do baixo potencial invasivo de E. dunnii, que produz poucas sementes, dificultando sua propagação aleatória (Billard e Lallana, 2005). Por outro lado, a reduzida produção de sementes dificulta, em muito, a produção de mudas via seminal. Alternativamente, devem ser pesquisados métodos de propagação assexuada. A fixação de genótipos superiores aumentaria os ganhos genéticos obtidos com a espécie, colocando no mercado mudas de melhor qualidade e homogeneidade, características obtidas com a propagação vegetativa.

Atualmente, a clonagem do género Eucalyptus é realizada, principalmente, por miniestaquia, porém muitas empresas florestais utilizam a micropropagação para produção massal de genótipos selecionados através de sucessivas gerações (Brondani et al., 2009).

A micropropagação tem sido utilizada na área florestal para preservação de germoplasma, produção de indivíduos livres de patógenos, rápida multiplicação em espaço reduzido, rejuvenescimento e produção de mudas selecionadas (Erig e Schuch, 2005). Uma série de fatores influencia o sucesso da micropropagação, como o genótipo, o estado fisiológico da planta-matriz, a colheita e o tipo de explante, a assepsia utilizada, o meio de cultura (nutrientes, vitaminas, açúcares, dentre outros), as concentrações e tipos de reguladores de crescimento, as condições de incubação (fotoperíodo, irradiância e temperatura) e a habilidade do operador (George e Debergh, 2008).

Os resultados obtidos durante todo o processo de micropropagação são diretamente influenciados pelo genótipo, sendo este um dos fatores limitantes no sucesso da propagação in vitro. Isto se deve a especificidade das espécies e clones, quanto ao meio de cultura, reguladores de crescimento e condições ambientais, controlados por fatores genéticos (Gahan e George, 2008). Desta forma, ao se trabalhar com novos genótipos é necessário avaliar a resposta desses materiais ao cultivo in vitro e posteriormente fazer ajustes necessários para otimizar o processo de micropropagação (Borges et al., 2012).

Normalmente, na propagação in vitro os reguladores de crescimento constituem-se numa primeira etapa a ser abordada, em que o modo de interação entre auxinas e citocininas é frequentemente dependente da espécie, da planta e do tipo de tecido utilizado na cultura (Perez e Kerbauy, 2005). A maneira complexa com que os reguladores de crescimento e as células interagem indica que, se o tecido não está em um estádio responsivo, não irá responder adequadamente aos reguladores de crescimento exógenos, não importando em quais concentrações e combinações estes reguladores são utilizados.

Os rebentos multiplicados que apresentam pequeno comprimento poderão apresentar baixo percentual de enraizamento se forem diretamente cultivados em meios de enraizamento, ou dar origem a mudas de baixa qualidade para a fase de aclimatização (Silva et al., 2003). Desta forma a etapa de alongamento tem sido considerada necessária para o sucesso do cultivo in vitro na maioria das espécies de Eucalyptus (Joshi et al., 2003).

Um dos fatores que afetam o alongamento de rebentos está relacionado ao efeito residual do BAP utilizado durante a fase de multiplicação de gomos em subculturas sucessivas (Silva et al., 2003). Uma das formas de estimular o crescimento dos rebentos é por meio da adição do ácido giberélico (Diniz et al., 2003), induzir um balanço favorável de reguladores de crescimento (Grattapaglia e Machado, 1990) e manter os rebentos no escuro (Ramos e Carneiro, 2007).

E. dunnii apresenta limitações na micropropagação, assim como outras espécies de mesmo género. Isso está de acordo com o registro de que a maioria das espécies resistentes ao frio apresentam recalcitrância ao processo de clonagem (Brondani et al., 2009). Alguns trabalhos recentes com a espécie mostram a potencialidade do uso da micropropagação em Eucalyptus dunnii ou hibridos utilizando a espécie, destacando-se os estudos de Brondani et al. (2010), Brondani et al. (2011), Navroski et al. (2013) e Navroski et al. (2014) desenvolvidos no Brasil e outros estudos a nível mundial: Yang (2006), Lin e Xie (2007) e Xiuhong et al. (2011).

Objetivou-se com o presente trabalho avaliar o alongamento in vitro de rebentos de diferentes genótipos de E. dunnii provenientes da fase de multiplicação sob diferentes concentrações de Ácido Alfa-Naftaleno Acético (ANA) associado à concentração fixa de 6-Benzilaminopurina (BAP).

Material e Métodos Colheita e preparação do material genético O material genético utilizado no presente estudo foi colhido em povoamento comercial de E. dunniicom cerca de três anos de idade, localizado no município de Alegrete - RS. O povoamento era originário do plantio de mudas produzidas via seminal.

Foram escolhidas 10 árvores, cada uma correspondendo a um genótipo, com características morfológicas (diâmetro e altura) acima da média da população, bom desenvolvimento de copas, desprovidas de sintomas de deficiência nutricional ou hídrica e de ataques de pragas e doenças. As árvores selecionadas foram abatidas deixando-se a cepa com cerca de 45 cm de altura. Na sequência, após o início dos abrolhamentos, foram realizados tratamentos sanitários preventivos com a aplicação intercalada, semanalmente, dos fungicidas Dicarboximida, a 2,4 g.L-1, e Benzimidazol, a 1,0 g.L-1.

Decorridos 60 dias após o inicio do tratamento com fungicidas, foram colhidos os rebentos das árvores selecionadas, no qual foram obtidas do 3° e o 4° segmento nodal com o par de folhas, do ápice do abrolhamento em direção à base, posição geralmente utilizada para formar microestacas de Eucalyptus sp.

(Alfenas et al., 2009). Os rebentos foram colhidos nas primeiras horas da manhã sendo cortados em aproximadamente 10 cm para facilitar o transporte. Após foram acondicionadas em frascos de vidro contendo água destilada e autoclavada acrescida de ácido ascórbico a 1% (p/v) para minimizar o efeito da oxidação fenólica. Os frascos contendo os rebentos foram colocados em caixa de isopor contendo gelo e transportados até o laboratório onde se desenvolveu a pesquisa.

O tempo de transporte até o laboratório foi de aproximadamente 3 horas.

As estacas foram lavadas em água corrente, por cerca de 30 minutos, para promover-se a lixiviação de substâncias fenólicas e a redução de contaminantes superficiais. Após essa limpeza inicial, os ramos foram submersos em detergente neutro comercial (1 mL L-1), por 1-2 min, e, a seguir, enxaguados três vezes com água esterilizada. Após esta etapa, segmentos nodais com 1,0-1,5 cm de comprimento e que continham um par de gomos axilares foram excisados e cuidadosamente lavados com água esterilizada.

A desinfestação foi efetuada em câmara de fluxo laminar, sendo os segmentos nodais imersos em solução de etanol a 70% (v/v), por 30 seg, enxaguados com água esterilizada e, em seguida, imersos em solução de hipoclorito de sódio - NaOCl (1,5% v/v), durante 10 min. Após, os segmentos nodais foram lavados três vezes com água esterilizada e, imediatamente inoculados, na posição vertical, em frascos com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio nutritivo MS (Murashige e Skoog, 1962).

Ao meio nutritivo MS foram adicionados 6 g L-1 de ágar (Sigma®), 30 g L-1 de sacarose e o pH foi ajustado para 5,8. Na sequência, os frascos contendo os meios nutritivos foram autoclavados à temperatura de 121ºC (1,5 kgf cm-2) durante 20 minutos. O meio nutritivo foi suplementado com 0,1 mg L-1 de 6- benzilaminopurina (BAP) e 0,01 mg L-1 de Ácido alfa-Naftaleno Acético (ANA), conforme recomendado por Alfenas et al. (2009). Adicionaram-se, ainda, 100 mg L-1 de mio-inositol e 250 mg L-1 de polivinilpirrolidona (PVP), com a finalidade de controlar a oxidação fenólica.

Após 30 dias de estabelecimento dos explantes, os rebentos dos segmentos nodais contendo 2 gomos axilares dos seis genótipos que obtiveram estabelecimento satisfatório (>30%) foram transferidos para a fase de multiplicação. Os explantes foram excisados e inoculados, sob condições assépticas, em frascos com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio nutritivo MS reduzido à metade da concentração de sais (1/2 MS), suplementado com 0,50 mg L-1 de BAP e 0,01 mg L-1 de ANA conforme estudo de Navroski et al. (2014). Os explantes permaneceram na sala de cultivo por mais 30 dias.

Alongamento dos rebentos in vitro Para a iniciação da fase de alongamento, os rebentos multiplicados in vitro foram preparados e inoculados, sob condições assépticas, em frascos com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio MS reduzido à metade da concentração de sais (1/2 MS).

Ao meio nutritivo MS foram adicionados 6 g L-1 de ágar, 30 g L-1 de sacarose, 50 mg L-1de mio-inositol, 0,1 mg L-1 de BAP e concentrações crescentes de ANA (0; 0,25; 0,5; 0,75; e 1 mg L-1). O meio de cultura foi preparado utilizando-se água desionizada e o pH foi ajustado para 5,8 com NaOH 0,1 M ou HCl 0,1 M, antes da autoclavagem e da adição do ágar. Na sequência, os frascos foram vedados com papel alumínio e autoclavados a 121°C (1,5 kgf cm-2) por 20 minutos.

Os frascos contendo os explantes inoculados foram mantidos em sala de cultivo com temperatura de 25ºC ±2 ºC, fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 20 µmol m-2 s-1 fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas frias tipo luz do dia durante todo o ensaio.

O ensaio foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em esquema bifatorial 6 x 5, em que os níveis do fator A referiram-se aos diferentes genótipos (identificados como 2, 3, 4, 6, 7 e 10) e os níveis do fator B, às concentrações crescentes de ANA (0; 0,25; 0,5; 0,75; e 1 mg L-1). O ensaio foi realizado com cinco repetições, cada uma composta por um frasco contendo três explantes, totalizando 150 unidades experimentais e 450 rebentos submetidos aos tratamentos.

Trinta dias após a inoculação dos explantes, foram avaliadas as seguintes variáveis: número de rebentos alongados ' NB (rebentos que apresentaram alongamento superior a 10% do tamanho inicial), comprimento dos lançamentos ' CMB, em mm (comprimento em relação ao tamanho inicial dos rebentos) e a percentagem de explantes apresentando hiperhidricidade. A hiperhidricidade foi determinada mediante avaliação visual, sendo considerados hiperhídricos aqueles explantes que apresentaram aspecto vítreo.

Análise de dados Após avaliar a normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov e a homogeneidade de variâncias por meio do teste de Bartlett, os dados foram transformados pela função e submetidos à análise de variância. Quando o valor de F foi significativo, as médias de tratamentos qualitativos foram submetidos à comparação de médias por meio do teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade de erro. Médias de tratamentos quantitativos foram submetidas à análise de regressão polinomial. Os resultados apresentados são as médias originais obtidas. O programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2011) foi utilizado para a análise estatística dos dados. A precisão dos ensaios foi medida através da acurácia seletiva (AS%) calculada por .

Resultados e discussão Conforme a análise de variância não ocorreu interação (p>0,05) entre os genótipos e as concentrações de ANA para nenhuma das variáveis avaliadas.

Contudo, verificou-se efeito significativo (p<0,05) para os fatores principais para todas as variáveis estudadas. A acurácia seletiva (AS) foi alta (>0,90) para todas as variáveis, conforme classificação de Resende e Duarte (2007). Com isso é alta a confiança que se pode ter na avaliação e nos valores genotípicos preditos para fins de seleção.

Os genótipos 6, 3 e 7 apresentaram o maior número de rebentos alongados por explante (Figura_1A), diferenciando-se dos demais genótipos (Quadro_1). A diferença entre o genótipo que apresentou maior alongamento de rebentos (genótipo 6) foi praticamente o dobro que o genótipo que exibiu a menor média (genótipo 10). Essas diferenças genotípicas no desenvolvimento in vitro são relatadas em diferentes espécies do género Eucalyptus: E. grandis (Sobrosa e Corder, 2003; Santos et al., 2005), E. globulus (Borges et al., 2011), E.

dunnii (Navroski et al., 2013) e também em diversos híbridos: E. benthamii x E.

dunnii (Brondani et al. (2009), E. grandis x E. nitens e E. grandis x urophylla (Watt, 2014; Nakhooda et al., 2012).

Resultado semelhante foi alcançado em relação ao comprimento médio dos rebentos (Quadro_1), no qual, o genótipo 6 apresentou a maior média, diferindo dos demais, e o menor comprimento foi obtido pelos genótipos 10 e 4. O genótipo 6 apresentou rebentos de praticamente 9,0 mm superiores ao pior genótipo (10).

Esses resultados mostraram variações genéticas entre os clones em relação à capacidade de alongamento de rebentos, destacando diferenças no potencial genético do material em relação à característica. Reforça-se a importância da escolha de genótipos produtivos a campo, mas que apresentem também capacidade de propagação vegetativa, neste caso, em relação ao alongamento de rebentos in vitro.

Considerando-se que os seis genótipos estão sob condições edafoclimáticas e experimentais semelhantes (mesmo sítio), pode-se supor que as variações no alongamento dos rebentos advenham de diferenças genéticas entre as matrizes ou balanço hormonal específico de cada indivíduo (Sobrosa e Corder, 2003). Assim, as diferenças observadas podem advir do controle genético ou, mesmo, das diferenças entre ritmos endógenos da planta relacionados a fatores fisiológicos e morfológicos, pois flutuações são capazes de ocorrer mesmo entre genótipos estreitamente aparentados, de acordo com o determinismo endógeno (Mankessi et al., 2009).

O genótipo 10 além de exibir o menor número e tamanho dos rebentos, apresentou à maior frequência de hiperhidricidade, superior a 20% dos explantes (Figura 1B). Já os demais genótipos formaram um reduzido percentual, ou não formaram, e, em geral, apresentaram um maior crescimento da parte aérea.

Pode-se verificar recalcitrância do genótipo 4 e, principalmente, do genótipo 10 quanto ao alongamento in vitro. Ambos os genótipos apresentaram reduzido número de rebentos alongados e, também, médias de comprimento inferiores aos demais genótipos. A permanência desses genótipos no cultivo in vitro, especialmente do genótipo 10, foi, além disso, afetada pelo elevado número de rebentos com hiperhidricidade. Observou-se uma relação inversa com o alongamento; os genótipos que mais alongaram foram aqueles com menor aparecimento de hiperhidricidade (Quadro_1).

A hiperhidricidade é frequentemente relatada na micropropagação de espécies lenhosas, podendo reduzir o crescimento dos rebentos, e consequentemente afetar a qualidade, pode também, se muito intensa, levar a necrose dos tecidos (Whitehouse et al., 2002).

Em relação ao número de lançamentos por explante, em função de concentrações crescentes de ANA, a curva obtida ajustou-se a uma função quadrática (Figura 2), constatando-se uma elevação na formação de lançamentos à medida que aumentou a concentração de ANA até 0,54 mg L-1 (MET). A partir desse ponto, houve uma diminuição no número de lançamentos com o aumento na concentração da auxina.

Resposta semelhante foi encontrada em estudo com E. benthamiixE. dunnii, no qual o maior número de rebentos alongadas (3,8) foi obtido com concentrações entre 0,25 e 0,75 mg L-1 de ANA e 0,05 mg L-1 de BAP (Brondani et al., 2009). O balanço entre auxinas e citocininas foi recomendado em estudos recentes com Eucalyptus: Watt (2014) em E. grandis × nitens e E. grandis × urophylla; Nakhooda et al. (2012) em E. grandis × nitens e E. grandis e Nakhooda et al.

(2011) em E. grandis.

O ajuste correto na concentração entre auxina e citocinina é extremamente importante na fase de alongamento de materiais recalcitrantes in vitro, como é o caso do E. dunnii. Tomando-se como base o ponto de MET, uma variação de ±0,25 mg L-1 de ANA foi responsável por uma diferença de 1,10 lançamentos alongados.

Esse resultado, extrapolado para grande escala, representa uma grande quantidade de material apto ao enraizamento.

Além de auxiliar no alongamento, a adição de auxina e citocinina é importante para a próxima fase, o enraizamento. Segundo Nakhooda et al. (2011) a retirada da auxina no alongamento reduziu de 68% para 31% o enraizamento de miniestacas de E. grandis. Negishi et al. (2014) indicam que a adição exógena de citocinina, durante o desenvolvimento de lançamentos (multiplicação e alongamento) é eficaz na formação de raízes adventícias de E. globulus.

O comprimento dos lançamentos por microestaca teve resposta semelhante ao número de rebentos alongadas (Figura_3). Em geral, quanto maior o número de abrolhamentos, maior também foi o seu comprimento. A concentração 0,48 mg L- 1 de ANA (estimada pela equação) apresentou o maior comprimento médio por rebento (11,6 mm), diminuindo conforme o aumento da concentração de ANA no meio nutritivo.

Efeitos semelhantes foram constatados por Brondani et al. (2009), que obtiveram a melhor resposta quanto ao número de rebentos alongados de E. benthamii x E.

dunnii em meio de cultura suplementado com concentrações entre 0,25 e 0,75 mg L-1 de ANA e 0,05 mg L-1 de BAP, sendo estimada a concentração de 0,49 mg L- 1 de ANA para obtenção do maior número de rebentos alongados com comprimento médio de 2,4 cm, aos 60 dias após a inoculação.

Trabalhando com E. tereticornis x E. calmadulensis, Bisht et al. (1999) observaram multiplicação seguida de alongamento após um período de 120 dias de cultivo em meio MS suplementado com BAP e ANA. No geral, os lançamentos atingiram, em média, 20 a 35 mm de comprimento, resultado superior ao encontrado no presente estudo. Para os autores, a multiplicação e o alongamento ocorreram sem a necessidade de uma fase específica de alongamento dos rebentos multiplicados.

Joshi et al. (2003) obtiveram rebentos de E. tereticornis x E. grandis alongadas quando cultivadas em meio de cultura sem adição de reguladores de crescimento. Segundo os autores esse resultado representa economia no processo de produção in vitrodo híbrido. Entretanto, deve-se considerar a especificidade de cada espécie/clone de eucalipto, sendo que algumas espécies necessitam de diferentes condições em cada fase específica do cultivo in vitro (Borges et al., 2012).

Em estudos com E. urophylla, Santos et al. (2004) observaram que a combinação de 0,1 mg L-1 de AIB e 0,1 mg L-1 de BAP resultou nos melhores efeitos para o alongamento dos rebentos. De maneira semelhante, Oliveira (2011) obteve os melhores resultados para o alongamento in vitro de híbridos de E. globulus utilizando 0,25 a 1,00 mg L-1 de AIB e 0,05 mg L-1 de BAP. Já, para Sotelo e Monza (2007), o E. globulus sub. Maidenii, em tratamento com 0,1 mg L-1 de BAP e 0,5 mg L-1 de AIB foi o que melhor promoveu o alongamento dos rebentos.

A formação de hiperhidricidade ajustou-se a uma função quadrática positiva com o aumento na concentração da auxina, alcançando quase 25% de explantes com estruturas calogênicas na presença de 1,0 mg L-1 de ANA (Figura_4). Além da alta formação de estruturas hiperhídricas a utilização de 1,0 mg L-1 de ANA também promoveu o aparecimento de estruturas calogênicas (dados não apresentados).

A hiperhidricidade, antigamente conhecida como vitrificação, ocasiona desordens morfológicas e fisiológicas na planta decorrentes do elevado teor de água no interior das células e tecidos (Ziv, 1991), podendo em alguns casos, atingir até 60% dos lançamentos micropropagados (Park et al., 2004). Plantas hiperhídricas caracterizam-se morfologicamente por apresentarem aspecto translúcido, caules largos e engrossados em diâmetro e com entrenós mais curtos que os de plantas normais (Figura_1B), órgãos menos verdes e facilmente quebráveis, menor alongamento celular e também menor potencial de enraizamento das miniestacas (Kevers et al., 2004; Bertoni et al., 2006).

Entre os principais fatores que causam hiperhidricidade estão as condições de estresse (Ziv, 1991), devidas, por exemplo, aos estados físico e químico do meio de cultura e da atmosfera dos frascos. Além disso, outros fatores podem ocasionar a hiperhidricidade, destacando-se a presença de reguladores de crescimento, grandes quantidades de íões amônio (NH4+) e cloreto (Cl-), tipo e concentração de agentes gelificantes e alta humidade relativa nos frascos de cultivo (Park et al., 2004).

Em relação aos reguladores de crescimento, estudos mostram que em meio nutritivo contendo citocinina, a adição de auxinas frequentemente aumenta a proporção de plantas hiperhídricas. Em experimento com Cochlospermum regium, ao aumentar a concentração do ácido indol butírico (AIB), aumenta-se a porcentagem de hiperhidricidade dos explantes (Inácio, 2010), corroborando os resultados encontrados no presente trabalho. Geralmente, existe uma relação negativa entre tamanho dos rebentos ou proliferação e hiperhidricidade (Picoli et al., 2001), fato igualmente confirmado neste estudo.

Apesar da formação de estruturas hiperhídricas ser prejudicial à micropropagação do E. dunnii, a utilização de ANA em concentrações inferiores a 0,75 mg L-1 não afetou o alongamento das estacas. Somente 5% dos rebentos apresentaram a formação de hiperhidricidade quando da utilização de 0,50 e 0,75 mg L-1 de ANA, e menos de 2% na presença de 0,25 mg L-1 da auxina.

Conclusões Os genótipos testados são passíveis de seleção com base na resposta diferencial in vitro. A adição de 0,5 mg L-1 de ANA aumenta o número de rebentos alongados e eleva o comprimento dos lançamentos. Concentrações superiores a 0,5 mg L-1 de ANA apresentam aumento na formação de estruturas hiperhídricas.