Alongamento in vitro de rebentos de Eucalyptus dunnii em função de diferentes
genótipos e concentrações de ácido 1-naftil-acético (ANA)
Introdução
As características florestais apresentadas por Eucalyptus dunnii Maiden
oferecem perspectivas promissoras para o cultivo de eucaliptos no Rio Grande do
Sul, Brasil. Entre essas características, merecem destaque a tolerância a
geadas intensas e severas, além do baixo potencial invasivo de E. dunnii, que
produz poucas sementes, dificultando sua propagação aleatória (Billard e
Lallana, 2005). Por outro lado, a reduzida produção de sementes dificulta, em
muito, a produção de mudas via seminal. Alternativamente, devem ser pesquisados
métodos de propagação assexuada. A fixação de genótipos superiores aumentaria
os ganhos genéticos obtidos com a espécie, colocando no mercado mudas de melhor
qualidade e homogeneidade, características obtidas com a propagação vegetativa.
Atualmente, a clonagem do género Eucalyptus é realizada, principalmente, por
miniestaquia, porém muitas empresas florestais utilizam a micropropagação para
produção massal de genótipos selecionados através de sucessivas gerações
(Brondani et al., 2009).
A micropropagação tem sido utilizada na área florestal para preservação de
germoplasma, produção de indivíduos livres de patógenos, rápida multiplicação
em espaço reduzido, rejuvenescimento e produção de mudas selecionadas (Erig e
Schuch, 2005). Uma série de fatores influencia o sucesso da micropropagação,
como o genótipo, o estado fisiológico da planta-matriz, a colheita e o tipo de
explante, a assepsia utilizada, o meio de cultura (nutrientes, vitaminas,
açúcares, dentre outros), as concentrações e tipos de reguladores de
crescimento, as condições de incubação (fotoperíodo, irradiância e temperatura)
e a habilidade do operador (George e Debergh, 2008).
Os resultados obtidos durante todo o processo de micropropagação são
diretamente influenciados pelo genótipo, sendo este um dos fatores limitantes
no sucesso da propagação in vitro. Isto se deve a especificidade das espécies e
clones, quanto ao meio de cultura, reguladores de crescimento e condições
ambientais, controlados por fatores genéticos (Gahan e George, 2008). Desta
forma, ao se trabalhar com novos genótipos é necessário avaliar a resposta
desses materiais ao cultivo in vitro e posteriormente fazer ajustes necessários
para otimizar o processo de micropropagação (Borges et al., 2012).
Normalmente, na propagação in vitro os reguladores de crescimento constituem-se
numa primeira etapa a ser abordada, em que o modo de interação entre auxinas e
citocininas é frequentemente dependente da espécie, da planta e do tipo de
tecido utilizado na cultura (Perez e Kerbauy, 2005). A maneira complexa com que
os reguladores de crescimento e as células interagem indica que, se o tecido
não está em um estádio responsivo, não irá responder adequadamente aos
reguladores de crescimento exógenos, não importando em quais concentrações e
combinações estes reguladores são utilizados.
Os rebentos multiplicados que apresentam pequeno comprimento poderão apresentar
baixo percentual de enraizamento se forem diretamente cultivados em meios de
enraizamento, ou dar origem a mudas de baixa qualidade para a fase de
aclimatização (Silva et al., 2003). Desta forma a etapa de alongamento tem sido
considerada necessária para o sucesso do cultivo in vitro na maioria das
espécies de Eucalyptus (Joshi et al., 2003).
Um dos fatores que afetam o alongamento de rebentos está relacionado ao efeito
residual do BAP utilizado durante a fase de multiplicação de gomos em
subculturas sucessivas (Silva et al., 2003). Uma das formas de estimular o
crescimento dos rebentos é por meio da adição do ácido giberélico (Diniz et
al., 2003), induzir um balanço favorável de reguladores de crescimento
(Grattapaglia e Machado, 1990) e manter os rebentos no escuro (Ramos e
Carneiro, 2007).
E. dunnii apresenta limitações na micropropagação, assim como outras espécies
de mesmo género. Isso está de acordo com o registro de que a maioria das
espécies resistentes ao frio apresentam recalcitrância ao processo de clonagem
(Brondani et al., 2009). Alguns trabalhos recentes com a espécie mostram a
potencialidade do uso da micropropagação em Eucalyptus dunnii ou hibridos
utilizando a espécie, destacando-se os estudos de Brondani et al. (2010),
Brondani et al. (2011), Navroski et al. (2013) e Navroski et al. (2014)
desenvolvidos no Brasil e outros estudos a nível mundial: Yang (2006), Lin e
Xie (2007) e Xiuhong et al. (2011).
Objetivou-se com o presente trabalho avaliar o alongamento in vitro de rebentos
de diferentes genótipos de E. dunnii provenientes da fase de multiplicação sob
diferentes concentrações de Ácido Alfa-Naftaleno Acético (ANA) associado à
concentração fixa de 6-Benzilaminopurina (BAP).
Material e Métodos
Colheita e preparação do material genético
O material genético utilizado no presente estudo foi colhido em povoamento
comercial de E. dunniicom cerca de três anos de idade, localizado no município
de Alegrete - RS. O povoamento era originário do plantio de mudas produzidas
via seminal.
Foram escolhidas 10 árvores, cada uma correspondendo a um genótipo, com
características morfológicas (diâmetro e altura) acima da média da população,
bom desenvolvimento de copas, desprovidas de sintomas de deficiência
nutricional ou hídrica e de ataques de pragas e doenças. As árvores
selecionadas foram abatidas deixando-se a cepa com cerca de 45 cm de altura. Na
sequência, após o início dos abrolhamentos, foram realizados tratamentos
sanitários preventivos com a aplicação intercalada, semanalmente, dos
fungicidas Dicarboximida, a 2,4 g.L-1, e Benzimidazol, a 1,0 g.L-1.
Decorridos 60 dias após o inicio do tratamento com fungicidas, foram colhidos
os rebentos das árvores selecionadas, no qual foram obtidas do 3° e o 4°
segmento nodal com o par de folhas, do ápice do abrolhamento em direção à base,
posição geralmente utilizada para formar microestacas de Eucalyptus sp.
(Alfenas et al., 2009). Os rebentos foram colhidos nas primeiras horas da manhã
sendo cortados em aproximadamente 10 cm para facilitar o transporte. Após foram
acondicionadas em frascos de vidro contendo água destilada e autoclavada
acrescida de ácido ascórbico a 1% (p/v) para minimizar o efeito da oxidação
fenólica. Os frascos contendo os rebentos foram colocados em caixa de isopor
contendo gelo e transportados até o laboratório onde se desenvolveu a pesquisa.
O tempo de transporte até o laboratório foi de aproximadamente 3 horas.
As estacas foram lavadas em água corrente, por cerca de 30 minutos, para
promover-se a lixiviação de substâncias fenólicas e a redução de contaminantes
superficiais. Após essa limpeza inicial, os ramos foram submersos em detergente
neutro comercial (1 mL L-1), por 1-2 min, e, a seguir, enxaguados três vezes
com água esterilizada. Após esta etapa, segmentos nodais com 1,0-1,5 cm de
comprimento e que continham um par de gomos axilares foram excisados e
cuidadosamente lavados com água esterilizada.
A desinfestação foi efetuada em câmara de fluxo laminar, sendo os segmentos
nodais imersos em solução de etanol a 70% (v/v), por 30 seg, enxaguados com
água esterilizada e, em seguida, imersos em solução de hipoclorito de sódio -
NaOCl (1,5% v/v), durante 10 min. Após, os segmentos nodais foram lavados três
vezes com água esterilizada e, imediatamente inoculados, na posição vertical,
em frascos com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio nutritivo MS
(Murashige e Skoog, 1962).
Ao meio nutritivo MS foram adicionados 6 g L-1 de ágar (Sigma®), 30 g L-1 de
sacarose e o pH foi ajustado para 5,8. Na sequência, os frascos contendo os
meios nutritivos foram autoclavados à temperatura de 121ºC (1,5 kgf cm-2)
durante 20 minutos. O meio nutritivo foi suplementado com 0,1 mg L-1 de 6-
benzilaminopurina (BAP) e 0,01 mg L-1 de Ácido alfa-Naftaleno Acético (ANA),
conforme recomendado por Alfenas et al. (2009). Adicionaram-se, ainda, 100 mg
L-1 de mio-inositol e 250 mg L-1 de polivinilpirrolidona (PVP), com a
finalidade de controlar a oxidação fenólica.
Após 30 dias de estabelecimento dos explantes, os rebentos dos segmentos nodais
contendo 2 gomos axilares dos seis genótipos que obtiveram estabelecimento
satisfatório (>30%) foram transferidos para a fase de multiplicação. Os
explantes foram excisados e inoculados, sob condições assépticas, em frascos
com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio nutritivo MS reduzido à
metade da concentração de sais (1/2 MS), suplementado com 0,50 mg L-1 de BAP e
0,01 mg L-1 de ANA conforme estudo de Navroski et al. (2014). Os explantes
permaneceram na sala de cultivo por mais 30 dias.
Alongamento dos rebentos in vitro
Para a iniciação da fase de alongamento, os rebentos multiplicados in vitro
foram preparados e inoculados, sob condições assépticas, em frascos com
capacidade para 150 mL, contendo 30 mL do meio MS reduzido à metade da
concentração de sais (1/2 MS).
Ao meio nutritivo MS foram adicionados 6 g L-1 de ágar, 30 g L-1 de sacarose,
50 mg L-1de mio-inositol, 0,1 mg L-1 de BAP e concentrações crescentes de ANA
(0; 0,25; 0,5; 0,75; e 1 mg L-1). O meio de cultura foi preparado utilizando-se
água desionizada e o pH foi ajustado para 5,8 com NaOH 0,1 M ou HCl 0,1 M,
antes da autoclavagem e da adição do ágar. Na sequência, os frascos foram
vedados com papel alumínio e autoclavados a 121°C (1,5 kgf cm-2) por 20
minutos.
Os frascos contendo os explantes inoculados foram mantidos em sala de cultivo
com temperatura de 25ºC ±2 ºC, fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 20 µmol
m-2 s-1 fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas frias tipo luz do dia
durante todo o ensaio.
O ensaio foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em esquema
bifatorial 6 x 5, em que os níveis do fator A referiram-se aos diferentes
genótipos (identificados como 2, 3, 4, 6, 7 e 10) e os níveis do fator B, às
concentrações crescentes de ANA (0; 0,25; 0,5; 0,75; e 1 mg L-1). O ensaio foi
realizado com cinco repetições, cada uma composta por um frasco contendo três
explantes, totalizando 150 unidades experimentais e 450 rebentos submetidos aos
tratamentos.
Trinta dias após a inoculação dos explantes, foram avaliadas as seguintes
variáveis: número de rebentos alongados ' NB (rebentos que apresentaram
alongamento superior a 10% do tamanho inicial), comprimento dos lançamentos '
CMB, em mm (comprimento em relação ao tamanho inicial dos rebentos) e a
percentagem de explantes apresentando hiperhidricidade. A hiperhidricidade foi
determinada mediante avaliação visual, sendo considerados hiperhídricos aqueles
explantes que apresentaram aspecto vítreo.
Análise de dados
Após avaliar a normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov e a homogeneidade
de variâncias por meio do teste de Bartlett, os dados foram transformados pela
função e submetidos à análise de variância. Quando o valor de F foi
significativo, as médias de tratamentos qualitativos foram submetidos à
comparação de médias por meio do teste de Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade de erro. Médias de tratamentos quantitativos foram submetidas à
análise de regressão polinomial. Os resultados apresentados são as médias
originais obtidas. O programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2011) foi utilizado
para a análise estatística dos dados. A precisão dos ensaios foi medida através
da acurácia seletiva (AS%) calculada por .
Resultados e discussão
Conforme a análise de variância não ocorreu interação (p>0,05) entre os
genótipos e as concentrações de ANA para nenhuma das variáveis avaliadas.
Contudo, verificou-se efeito significativo (p<0,05) para os fatores principais
para todas as variáveis estudadas. A acurácia seletiva (AS) foi alta (>0,90)
para todas as variáveis, conforme classificação de Resende e Duarte (2007). Com
isso é alta a confiança que se pode ter na avaliação e nos valores genotípicos
preditos para fins de seleção.
Os genótipos 6, 3 e 7 apresentaram o maior número de rebentos alongados por
explante (Figura_1A), diferenciando-se dos demais genótipos (Quadro_1). A
diferença entre o genótipo que apresentou maior alongamento de rebentos
(genótipo 6) foi praticamente o dobro que o genótipo que exibiu a menor média
(genótipo 10). Essas diferenças genotípicas no desenvolvimento in vitro são
relatadas em diferentes espécies do género Eucalyptus: E. grandis (Sobrosa e
Corder, 2003; Santos et al., 2005), E. globulus (Borges et al., 2011), E.
dunnii (Navroski et al., 2013) e também em diversos híbridos: E. benthamii x E.
dunnii (Brondani et al. (2009), E. grandis x E. nitens e E. grandis x urophylla
(Watt, 2014; Nakhooda et al., 2012).
Resultado semelhante foi alcançado em relação ao comprimento médio dos rebentos
(Quadro_1), no qual, o genótipo 6 apresentou a maior média, diferindo dos
demais, e o menor comprimento foi obtido pelos genótipos 10 e 4. O genótipo 6
apresentou rebentos de praticamente 9,0 mm superiores ao pior genótipo (10).
Esses resultados mostraram variações genéticas entre os clones em relação à
capacidade de alongamento de rebentos, destacando diferenças no potencial
genético do material em relação à característica. Reforça-se a importância da
escolha de genótipos produtivos a campo, mas que apresentem também capacidade
de propagação vegetativa, neste caso, em relação ao alongamento de rebentos in
vitro.
Considerando-se que os seis genótipos estão sob condições edafoclimáticas e
experimentais semelhantes (mesmo sítio), pode-se supor que as variações no
alongamento dos rebentos advenham de diferenças genéticas entre as matrizes ou
balanço hormonal específico de cada indivíduo (Sobrosa e Corder, 2003). Assim,
as diferenças observadas podem advir do controle genético ou, mesmo, das
diferenças entre ritmos endógenos da planta relacionados a fatores fisiológicos
e morfológicos, pois flutuações são capazes de ocorrer mesmo entre genótipos
estreitamente aparentados, de acordo com o determinismo endógeno (Mankessi et
al., 2009).
O genótipo 10 além de exibir o menor número e tamanho dos rebentos, apresentou
à maior frequência de hiperhidricidade, superior a 20% dos explantes (Figura
1B). Já os demais genótipos formaram um reduzido percentual, ou não formaram,
e, em geral, apresentaram um maior crescimento da parte aérea.
Pode-se verificar recalcitrância do genótipo 4 e, principalmente, do genótipo
10 quanto ao alongamento in vitro. Ambos os genótipos apresentaram reduzido
número de rebentos alongados e, também, médias de comprimento inferiores aos
demais genótipos. A permanência desses genótipos no cultivo in vitro,
especialmente do genótipo 10, foi, além disso, afetada pelo elevado número de
rebentos com hiperhidricidade. Observou-se uma relação inversa com o
alongamento; os genótipos que mais alongaram foram aqueles com menor
aparecimento de hiperhidricidade (Quadro_1).
A hiperhidricidade é frequentemente relatada na micropropagação de espécies
lenhosas, podendo reduzir o crescimento dos rebentos, e consequentemente afetar
a qualidade, pode também, se muito intensa, levar a necrose dos tecidos
(Whitehouse et al., 2002).
Em relação ao número de lançamentos por explante, em função de concentrações
crescentes de ANA, a curva obtida ajustou-se a uma função quadrática (Figura
2), constatando-se uma elevação na formação de lançamentos à medida que
aumentou a concentração de ANA até 0,54 mg L-1 (MET). A partir desse ponto,
houve uma diminuição no número de lançamentos com o aumento na concentração da
auxina.
Resposta semelhante foi encontrada em estudo com E. benthamiixE. dunnii, no
qual o maior número de rebentos alongadas (3,8) foi obtido com concentrações
entre 0,25 e 0,75 mg L-1 de ANA e 0,05 mg L-1 de BAP (Brondani et al., 2009). O
balanço entre auxinas e citocininas foi recomendado em estudos recentes com
Eucalyptus: Watt (2014) em E. grandis × nitens e E. grandis × urophylla;
Nakhooda et al. (2012) em E. grandis × nitens e E. grandis e Nakhooda et al.
(2011) em E. grandis.
O ajuste correto na concentração entre auxina e citocinina é extremamente
importante na fase de alongamento de materiais recalcitrantes in vitro, como é
o caso do E. dunnii. Tomando-se como base o ponto de MET, uma variação de ±0,25
mg L-1 de ANA foi responsável por uma diferença de 1,10 lançamentos alongados.
Esse resultado, extrapolado para grande escala, representa uma grande
quantidade de material apto ao enraizamento.
Além de auxiliar no alongamento, a adição de auxina e citocinina é importante
para a próxima fase, o enraizamento. Segundo Nakhooda et al. (2011) a retirada
da auxina no alongamento reduziu de 68% para 31% o enraizamento de miniestacas
de E. grandis. Negishi et al. (2014) indicam que a adição exógena de
citocinina, durante o desenvolvimento de lançamentos (multiplicação e
alongamento) é eficaz na formação de raízes adventícias de E. globulus.
O comprimento dos lançamentos por microestaca teve resposta semelhante ao
número de rebentos alongadas (Figura_3). Em geral, quanto maior o número de
abrolhamentos, maior também foi o seu comprimento. A concentração 0,48 mg L-
1 de ANA (estimada pela equação) apresentou o maior comprimento médio por
rebento (11,6 mm), diminuindo conforme o aumento da concentração de ANA no meio
nutritivo.
Efeitos semelhantes foram constatados por Brondani et al. (2009), que obtiveram
a melhor resposta quanto ao número de rebentos alongados de E. benthamii x E.
dunnii em meio de cultura suplementado com concentrações entre 0,25 e 0,75 mg
L-1 de ANA e 0,05 mg L-1 de BAP, sendo estimada a concentração de 0,49 mg L-
1 de ANA para obtenção do maior número de rebentos alongados com comprimento
médio de 2,4 cm, aos 60 dias após a inoculação.
Trabalhando com E. tereticornis x E. calmadulensis, Bisht et al. (1999)
observaram multiplicação seguida de alongamento após um período de 120 dias de
cultivo em meio MS suplementado com BAP e ANA. No geral, os lançamentos
atingiram, em média, 20 a 35 mm de comprimento, resultado superior ao
encontrado no presente estudo. Para os autores, a multiplicação e o alongamento
ocorreram sem a necessidade de uma fase específica de alongamento dos rebentos
multiplicados.
Joshi et al. (2003) obtiveram rebentos de E. tereticornis x E. grandis
alongadas quando cultivadas em meio de cultura sem adição de reguladores de
crescimento. Segundo os autores esse resultado representa economia no processo
de produção in vitrodo híbrido. Entretanto, deve-se considerar a especificidade
de cada espécie/clone de eucalipto, sendo que algumas espécies necessitam de
diferentes condições em cada fase específica do cultivo in vitro (Borges et
al., 2012).
Em estudos com E. urophylla, Santos et al. (2004) observaram que a combinação
de 0,1 mg L-1 de AIB e 0,1 mg L-1 de BAP resultou nos melhores efeitos para o
alongamento dos rebentos. De maneira semelhante, Oliveira (2011) obteve os
melhores resultados para o alongamento in vitro de híbridos de E. globulus
utilizando 0,25 a 1,00 mg L-1 de AIB e 0,05 mg L-1 de BAP. Já, para Sotelo e
Monza (2007), o E. globulus sub. Maidenii, em tratamento com 0,1 mg L-1 de BAP
e 0,5 mg L-1 de AIB foi o que melhor promoveu o alongamento dos rebentos.
A formação de hiperhidricidade ajustou-se a uma função quadrática positiva com
o aumento na concentração da auxina, alcançando quase 25% de explantes com
estruturas calogênicas na presença de 1,0 mg L-1 de ANA (Figura_4). Além da
alta formação de estruturas hiperhídricas a utilização de 1,0 mg L-1 de ANA
também promoveu o aparecimento de estruturas calogênicas (dados não
apresentados).
A hiperhidricidade, antigamente conhecida como vitrificação, ocasiona desordens
morfológicas e fisiológicas na planta decorrentes do elevado teor de água no
interior das células e tecidos (Ziv, 1991), podendo em alguns casos, atingir
até 60% dos lançamentos micropropagados (Park et al., 2004). Plantas
hiperhídricas caracterizam-se morfologicamente por apresentarem aspecto
translúcido, caules largos e engrossados em diâmetro e com entrenós mais curtos
que os de plantas normais (Figura_1B), órgãos menos verdes e facilmente
quebráveis, menor alongamento celular e também menor potencial de enraizamento
das miniestacas (Kevers et al., 2004; Bertoni et al., 2006).
Entre os principais fatores que causam hiperhidricidade estão as condições de
estresse (Ziv, 1991), devidas, por exemplo, aos estados físico e químico do
meio de cultura e da atmosfera dos frascos. Além disso, outros fatores podem
ocasionar a hiperhidricidade, destacando-se a presença de reguladores de
crescimento, grandes quantidades de íões amônio (NH4+) e cloreto (Cl-), tipo e
concentração de agentes gelificantes e alta humidade relativa nos frascos de
cultivo (Park et al., 2004).
Em relação aos reguladores de crescimento, estudos mostram que em meio
nutritivo contendo citocinina, a adição de auxinas frequentemente aumenta a
proporção de plantas hiperhídricas. Em experimento com Cochlospermum regium, ao
aumentar a concentração do ácido indol butírico (AIB), aumenta-se a porcentagem
de hiperhidricidade dos explantes (Inácio, 2010), corroborando os resultados
encontrados no presente trabalho. Geralmente, existe uma relação negativa entre
tamanho dos rebentos ou proliferação e hiperhidricidade (Picoli et al., 2001),
fato igualmente confirmado neste estudo.
Apesar da formação de estruturas hiperhídricas ser prejudicial à
micropropagação do E. dunnii, a utilização de ANA em concentrações inferiores a
0,75 mg L-1 não afetou o alongamento das estacas. Somente 5% dos rebentos
apresentaram a formação de hiperhidricidade quando da utilização de 0,50 e 0,75
mg L-1 de ANA, e menos de 2% na presença de 0,25 mg L-1 da auxina.
Conclusões
Os genótipos testados são passíveis de seleção com base na resposta diferencial
in vitro. A adição de 0,5 mg L-1 de ANA aumenta o número de rebentos alongados
e eleva o comprimento dos lançamentos. Concentrações superiores a 0,5 mg L-1 de
ANA apresentam aumento na formação de estruturas hiperhídricas.
